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    茶葉中茶多酚和生物堿的測(cè)定及聚類和線性判別分析

    2010-03-23 02:05:11肖俊松袁英髦張愛雪曹雁平
    食品科學(xué) 2010年22期
    關(guān)鍵詞:烏龍茶白茶兒茶素

    肖俊松,袁英髦,張愛雪,曹雁平,*

    (1.北京工商大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,北京 100048;2.食品添加劑與配料北京高校工程研究中心,北京 100048)

    茶葉中茶多酚和生物堿的測(cè)定及聚類和線性判別分析

    肖俊松1,2,袁英髦1,張愛雪1,曹雁平1,2,*

    (1.北京工商大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,北京 100048;2.食品添加劑與配料北京高校工程研究中心,北京 100048)

    目的:建立一種反相高效液相色譜方法,測(cè)定綠茶、烏龍茶、紅茶、白茶和普洱茶中兒茶素[(+)-catechin,C]、表兒茶素[(-)-epicatechin,EC]、表兒茶素沒食子酸脂[(-)-epicatechin gallate,ECG]、表沒食子兒茶素[(-)-epigallocatechin,EGC]、表沒食子兒茶素沒食子酸脂[(-)-epigallocatechin gallate,EGCG]、沒食子酸(gallic acid,GA)、咖啡因(caffeine,CAF)、可可堿(theobromine,THEO)的水平。以這8種組分為指標(biāo)對(duì)茶葉進(jìn)行聚類分析和線性判別分析,建立區(qū)分綠茶、紅茶和烏龍茶的方法。方法:茶葉提取后采用HPLC法測(cè)定兒茶素和生物堿含量,色譜柱為C18柱,流動(dòng)相由甲醇(A)、2%的乙酸(B)等度洗脫,A、B相的體積比為25:75,流速為1mL/min,柱溫30℃。采用PDA檢測(cè)器在278nm檢測(cè),參考波長(zhǎng)為210nm。采用SPSS 14.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了聚類分析和線性判別分析。結(jié)果:在選擇的分析條件下,樣品中的8種組分獲得了理想分離,加標(biāo)回收率在87%~112.8%之間,并采用外標(biāo)法對(duì)8種組分進(jìn)行定量。以這8種組分的含量為指標(biāo),聚類分析和線性判別分析能對(duì)39種茶葉樣品進(jìn)較好的區(qū)分。

    茶多酚;咖啡堿;茶葉;高效液相色譜;聚類分析;線性判別分析

    茶葉由茶樹(Camellia sinensis)的葉子加工而成,是我國(guó)傳統(tǒng)的飲料之一,也是世界三大飲料之一,按照發(fā)酵程度的不同,分為綠茶、黃茶、白茶、青茶(烏龍茶)、紅茶、黑茶(普洱茶)等。綠茶為不發(fā)酵的茶,含有大量茶多酚及一定量的生物堿,如咖啡因、可可堿等(圖1),大約占干質(zhì)量的30%[1]。烏龍茶為半發(fā)酵茶,而紅茶則是全發(fā)酵的茶,兒茶素的含量相比綠茶偏低,而咖啡因含量則有所增加。兒茶素類物質(zhì)賦予茶湯苦、澀味以及特有的收斂性。此外,茶多酚具有抗氧化,抗動(dòng)脈粥樣硬化,降低血液膽固醇,抑制癌細(xì)胞增殖等多種生理活性[2-5]??Х纫?、可可堿是茶葉中的生物堿類,可賦予茶湯苦味,并具有祛除疲勞,興奮神經(jīng)的作用[6]。因此,茶多酚和咖啡因是茶葉品質(zhì)的重要因子。

    圖1 茶多酚和咖啡因、可可堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of catechin, caffeine and theobromine

    本實(shí)驗(yàn)擬建立一種反相高效液相色譜方法,快速測(cè)定茶葉中兒茶素[(+)-catechin,C]、表兒茶素[(-)-epicatechin,EC]、表兒茶素沒食子酸脂[(-)-epicatechin gallate,ECG]、表沒食子兒茶素[(-)-epigallocatechin, EGC]、表沒食子兒茶素沒食子酸脂[(-)-epigallocatechin gallate, EGCG]、沒食子酸(gallic acid,GA)、咖啡因(caffeine,CAF)、可可堿(theobromine,THEO)的水平。在此基礎(chǔ)上,調(diào)查目前北京茶葉市場(chǎng)上茶葉中茶多酚,咖啡因和可可堿的含量,并采用聚類分析和線性判別分析對(duì)茶葉進(jìn)行區(qū)分,為茶葉的真?zhèn)舞b定提供技術(shù)參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    茶葉購自北京馬連道茶葉市場(chǎng),未注明的均為新茶,存儲(chǔ)于-18℃冰箱待測(cè),共計(jì)39種,其中綠茶21種,烏龍茶8種,紅茶4種(其中立頓速溶紅茶1種),白茶3種,黑茶2種,花茶1種。

    兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、沒食子酸 美國(guó)Sigma公司;咖啡因、可可堿 中國(guó)藥品生物制品檢定所;甲醇、乙腈(均為色譜純) 美國(guó)Fisher公司;乙酸(優(yōu)級(jí)純) 北京精細(xì)化工廠;VC、EDTA均為分析純。1.2儀器與設(shè)備

    2695高效液相色譜系統(tǒng)(配有可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器和Empower 2色譜工作站) 美國(guó)Waters公司。

    1.3 方法

    1.3.1 茶多酚和生物堿的提取

    參照GB/T 8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》,取適量茶葉樣品于研缽,將其研碎至直徑小于1mm,精確稱取樣品200mg至于10mL離心管中,用移液管移取5mL經(jīng)70℃水浴預(yù)熱的70%甲醇溶液,注入其中,用玻璃棒充分?jǐn)嚢杈鶆驖?rùn)濕,立即移入70℃水浴鍋中,浸提10min。每隔5min攪拌一次取出,浸提后冷卻至室溫,轉(zhuǎn)入離心機(jī)在3500r/min轉(zhuǎn)速下離心10min,將上清液轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶,殘?jiān)儆?mL的70%甲醇溶液提取一次,重復(fù)以上操作,合并提取液定容至10mL。用移液管取上述溶液2mL于10mL容量瓶中,用穩(wěn)定液定容,待測(cè)。

    穩(wěn)定液配制:稱取250mg EDTA于燒杯中,加入少量pH值為8的NaOH溶液,用玻璃棒攪拌,溶解,再加入50mL乙腈后再加入250mg VC,待其溶解,轉(zhuǎn)移至容量瓶中,定容至500mL。

    1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

    精確稱取2.9mg C、3.0mg EC、2.5mg ECG、3.7mg EGC、2.9mg EGCG、2.4mg CAF、1.0mg THEO,用70%

    甲醇溶液溶解,定容至10mL,然后逐級(jí)稀釋得到一系列不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。0.45μm膜過濾,進(jìn)樣10μL,進(jìn)行HPLC分析。以進(jìn)樣化合物質(zhì)量m(μg)為橫坐標(biāo)、色譜峰面積A為縱坐標(biāo),做標(biāo)準(zhǔn)曲線,得各標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.3.3 色譜條件

    色譜柱為迪馬Inertsil ODS-3 C18柱(4.6mm×150mm,5μm)。流動(dòng)相A為100%甲醇,流動(dòng)相B為2%乙酸溶液,采用等度洗脫,流動(dòng)相由甲醇(A),2%的乙酸(B),體積比為25:75,流速1mL/min,柱溫30℃。二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè),檢測(cè)波長(zhǎng)2 7 8 n m,參考波長(zhǎng)210nm。

    1.3.4 茶多酚和生物堿的HPLC測(cè)定

    茶葉樣品如1.3.1節(jié)處理后,采用1.3.2節(jié)同樣的色譜條件進(jìn)行HPLC分析。根據(jù)各化合物的峰面積,計(jì)算其含量,并根據(jù)稀釋度,計(jì)算茶多酚和生物堿的含量。

    稱取200mg茶葉樣品6份,其中3份測(cè)定8種化合物的質(zhì)量,另外3份加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品后,測(cè)定8種化合物的質(zhì)量,然后計(jì)算其加標(biāo)回收率。

    1.3.5 數(shù)據(jù)分析

    以C、EC、ECG、EGC、EGCG、GA、CAF和THEO這8種成分為指標(biāo),用SPSS 14.0 進(jìn)行聚類分析和線性判別分析[7]。聚類分析計(jì)算歐氏距離,線性判別分析則采用逐步判別法。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 同時(shí)測(cè)定茶多酚和生物堿的HPLC方法建立

    混合標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)過HPLC分析,等度洗脫,得到HPLC圖譜見圖2??梢钥闯?,這6種茶多酚和2種生物堿得到了較好的分離,僅有EGCG和CAF基線部分有重疊。8種化合物的保留時(shí)間分別為GA 2.629min、THEO 3.294min、EGC 3.998min、C 4.573min、EGCG 6.611min、CAF 7.233min、EC 8.060min、ECG 15.111min。

    圖2 茶多酚和生物堿的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of tea polyphenols and alkaloids

    從表1可以看出,8種化合物的回歸方程的R2均大于0.9999,說明在線性范圍內(nèi),線性關(guān)系良好。

    表1 茶葉中C、EC、ECG、EGC、EGCG、GA、CAF和THEO的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table1 Regression equations of 8 compounds (C, EC, ECG, EGC, EGCG, GA, CAF and THEO) in tea samples

    這8種化合物的加標(biāo)回收率如表2所示,回收率在87.0%~112.8%之間,說明該提取和測(cè)定方法能準(zhǔn)確的反應(yīng)茶葉樣品中這8種化合物的準(zhǔn)確含量。

    表2 茶葉中C、EC、ECG、EGC、EGCG、GA、CAF和THEO的回收率(n=3)Table2 Recovery rates of spiked compounds (C, EC, ECG, EGC, EGCG, GA, CAF and THEO) in tea samples (n=3)

    2.2 茶葉中茶多酚和生物堿水平

    圖3 綠茶、白茶、烏龍茶和紅茶中C、E C、E C G、E G C、EGCG、GA、CAF、THEO、總生物堿和總茶多酚的平均含量Fig.3 Average contents of 8 compounds (C, EC, ECG, EGC, EGCG, GA, CAF and THEO), total alkaloids (TA) and total polyphenols (TPP) in green, white, oolong and black tea samples from Beijing market

    39種茶葉樣品經(jīng)過如上方法提取,HPLC測(cè)定,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算得到其中C、EC、ECG、EGC、EGCG、GA、CAF和THEO的含量,如表3所示。計(jì)算綠茶、白茶、烏龍茶、紅茶的8個(gè)指標(biāo),外加T A (CAF和THEO之和),TPP(其他6指標(biāo)之和)的平均水平,并采用SPSS14.0進(jìn)行Duncan多重比較,得到圖3。

    表3 茶葉中C、EC、ECG、EGC、EGCG、GA、CAF和THEO的含量Table3 Contents of 8 compounds (C, EC, ECG, EGC, EGCG, GA, CAF and THEO) in tea samples

    綠茶為非發(fā)酵茶,白茶、烏龍茶和紅茶的發(fā)酵程度逐漸加重,發(fā)酵方式也不一樣。從圖3可以看出,北京市場(chǎng)茶葉中總生物堿的含量在0.694%~3.454%之間,平均含量2.395%。單因素方差分析顯示,綠茶,白茶,烏龍茶和紅茶的總生物堿含量在α=0.05水平上無顯著差別,Duncan多重比較顯示4類茶葉的總生物堿也無顯著差別。這說明發(fā)酵對(duì)茶葉中生物堿的水平基本無影響。

    總茶多酚含量在2.815%~19.808%之間,平均含量11.205%,含量從高到低依次為綠茶,白茶,烏龍茶和紅茶。單因素方差分析顯示茶葉種類對(duì)TPP水平有極顯著影響(P<0.001),Duncan多重比較顯示,在α=0.05水平上,綠茶和烏龍茶TPP水平無顯著差異,和白茶,紅茶有顯著差異,這說明發(fā)酵方式對(duì)茶葉中茶多酚的含量有極顯著影響。

    茶葉中茶多酚以EGCG、EC、ECG為主,C和EGC含量較低,GA含量則是在綠茶,白茶中較高,烏龍茶,紅茶中含量較低。單因素方差分析顯示茶葉種類對(duì)茶葉中C、EC、ECG、EGC、EGCG和GA的含量

    都有顯著影響(P<0.005)。Duncan多重比較顯示,在α=0.05水平上,烏龍茶的EGCG含量與其他3類茶葉有顯著差異,E C含量只有白茶和烏龍茶之間有顯著差異,綠茶的ECG含量則與白茶和紅茶之間有顯著差異。

    2.3 茶葉的聚類分析

    采用SPSS 14.0軟件包中聚類分析程序,計(jì)算39種茶葉樣品之間的歐氏距離,進(jìn)行聚類分析聚類結(jié)果見圖4。

    圖4 39個(gè)茶葉樣品系統(tǒng)聚類分析圖Fig.4 Hierarchical cluster analysis of 39 tea samples

    從圖4可看出,當(dāng)臨界值為20時(shí),39個(gè)茶葉樣品分別聚為三類。第一類中包含19個(gè)綠茶,1個(gè)花茶1個(gè)烏龍茶和1個(gè)白茶。第二類中包含7個(gè)烏龍茶、2個(gè)綠茶、1個(gè)黑茶。第三類中包含3個(gè)紅茶、2個(gè)白茶、1個(gè)黑茶和1個(gè)立頓紅茶。這三類茶葉按發(fā)酵度逐漸遞增分類,分別是不發(fā)酵,半發(fā)酵和全發(fā)酵茶。第一類茶均為不發(fā)酵或低發(fā)酵度的茶。第二類茶主要是烏龍茶等半發(fā)酵茶,還含有少量綠茶。第三類茶主要為紅茶和黑茶,為全發(fā)酵的茶。有趣的是,33w和34w兩種白茶是輕度發(fā)酵的茶也聚到第三類中,其原因可能是33w和34w分別是07年春和08年春的茶。由于茶葉放置的時(shí)間過長(zhǎng),導(dǎo)致茶葉中的兒茶素類成份發(fā)生降解,所以被聚入第三類。因此,按照C、EC、ECG、EGC、EGCG、GA、CAF、THEO組分含量進(jìn)行分類是合理的。

    2.4 茶葉的判別分析

    用SPSS 14.0軟件包,采用Wilk sλ法對(duì)茶葉樣品進(jìn)行逐步線性判別分析,得到2個(gè)典則判別函數(shù)(Y),分別為Y1=1.169+0.535EGCG+1.285ECG-5.523CAF、Y2=-2.897-0.349EGCG+1.82ECG+1.058CAF。計(jì)算各茶葉樣品的得分,以Y1為橫坐標(biāo)、Y2為縱坐標(biāo),得到茶葉樣品線性判別圖(圖5)。82.9%的茶葉樣品分類正確,綠茶,紅茶和烏龍茶完全區(qū)分,白茶區(qū)分不太好,可能原因是其為往年陳茶,其中的茶多酚有一定程度的氧化聚合。

    圖5 綠茶、白茶、烏龍茶和紅茶的線性判別分析Fig.5 Linear discrimination analysis of green, white, oolong and black tea samples

    3 討 論

    本實(shí)驗(yàn)建立的提取及HPLC方法,可同時(shí)測(cè)定茶葉中咖啡因,可可堿以及6類茶多酚含量。雖然采用了等度洗脫,但8種化合物基本實(shí)現(xiàn)了基線分離(EGCG和CAF峰有少部分重合),基線平,能在18min內(nèi)完成測(cè)定,且8種化合物回收率均達(dá)到要求。Ferandez等[8]采用梯度洗脫方式,6種兒茶素流出需要20min,而且基線漂移嚴(yán)重;康海寧等[9]采用梯度洗脫,則需要左右;唐根源等[10]采用等度洗脫,需要30min左右;Mitsuaki等[11]采用等度洗脫,分析12種茶多酚需要時(shí)間大概110min。

    采用此方法對(duì)39個(gè)茶葉樣本中的上述8中化合物進(jìn)行了測(cè)定??偵飰A含量平均為2.395%,茶多酚總量平均為11.205%,以EGCG、EC、ECG為主。綠茶、白茶、烏龍茶和紅茶中咖啡因、可可堿的含量并無顯著差別,說明發(fā)酵處理,并不能將其有效去除。4種茶葉茶多酚含量有顯著性區(qū)別,說明發(fā)酵對(duì)兒茶素類物質(zhì)具有很大影響。發(fā)酵過程中,兒茶素類物質(zhì)氧化聚合,形成茶黃素和茶紅素,形成烏龍茶、紅茶的獨(dú)特風(fēng)味與茶湯顏色。隨著發(fā)酵程度的增加,綠茶、烏龍茶和紅茶中茶多酚的含量逐漸減少。這與Ferandez等[8]和朱勤艷等[12]研究結(jié)果一致。但是白茶作為一種發(fā)酵程度低于烏龍茶的茶葉,其總多酚低于烏龍茶,其原因可能是本實(shí)驗(yàn)選擇的白茶樣本為往年陳茶,其中的茶多酚已發(fā)生氧化聚合所致,有研究證明,綠茶在90%相對(duì)濕度,40℃條件下貯藏45d兒茶素下降了31%[13],說明茶多酚在貯藏條件下會(huì)氧化聚合,從而含量下降。

    聚類分析將茶葉分為了3大類,基本符合實(shí)際情況。通過逐級(jí)線性判別分析,利用EGCG、ECG和CAF構(gòu)成的判別方程,將茶葉分為了4大類,綠茶、烏龍茶和紅茶完全區(qū)分,白茶區(qū)分效果不好。雖然白茶樣

    品選擇不當(dāng),干擾了分類方法的表現(xiàn),但是利用這2種方法,用于茶葉種類的區(qū)分、鑒別是可能的。

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    Determination of Polyphenols and Alkaloids in Tea and Cluster-Linear Discrimination Analysis

    XIAO Jun-song1,2,YUAN Ying-hao1,ZHANG Ai-xue1,CAO Yan-ping1,2,*
    (1. School of Chemical and Environmental Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China;2. Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, Beijing 100048, China)

    Objective: To establish a HPLC method for the determination of (+)-catechin, (-)-epicatechin (EC), (-)-epicatechin gallate (ECG), (-)-epigallocatechin (EGC), (-)-epigallocatechin gallate (EGCG), gallic acid (GA), caffeine (CAF) and theobromine (THEO) in green, oolong and black tea samples, and to develop a discrimination method for green, oolong and black tea by cluster analysis and linear discrimination analysis on the basis of determined chemical components. Methods: Tea samples were extracted by 70% aqueous methanol. Totally 200 mg of grinded tea samples was extracted with 5 mL of 70% aqueous methanol for 10 min in 70 ℃water bath. The extract was centrifuged at 3500 r/min for 10 min, and the supernatant was collected. Then the precipitate was extracted with 5 mL of 70% methanol under the same conditions. The supernatants were combined in a volumetric flask and diluted to 10 mL. A total of 2 mL of such solution was diluted by 5 times with stabilizing solution, filtrated with 0.45 μm membrane, and then used for HPLC analysis. Eight compounds were separated by a C18 column using a mobile phase containing methanol-2% aqueous acetic acid at a ratio of 25:75 (V/V) in an isocratic elution at 30 ℃, and detected using a photodiode array detector at 278 nm with the reference wavelength at 210 nm. The cluster and linear discrimination analyses were performed using SPSS 14.0 software. Results: Eight compounds in all tea samples were well separated under the proposed conditions. The recovery rates of spiked samples were in the range of 87%-112.8%. The contents of 8 compounds determined by an external standard method were used to conduct cluster analysis and linear discrimination analysis. The good differentiation of green, oolong and black tea samples were achieved. Conclusion: This established method is feasible to discriminate green, oolong and black tea.

    tea polyphenol;caffeine;tea;high performance liquid chromatography (HPLC);cluster analysis;linear discrimination analysis

    TS255.36

    A

    1002-6630(2010)22-0343-06

    2010-07-08

    “十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD27B03);北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(3062007)

    肖俊松(1980—),男,講師,博士,主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。E-mail:waq0012@hotmail.com

    *通信作者:曹雁平(1961—),男,教授,碩士,主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)與物理場(chǎng)強(qiáng)化技術(shù)研究。E-mail:caoyp@th.btbu.edu.cn

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