TMPRSS4在胃癌中的表達(dá)及其與患者預(yù)后相關(guān)性:基于Oncomie和Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析

徐朝波，陳正偉，梅祎軍

徐朝波，陳正偉，梅祎軍，麗水市人民醫(yī)院胃腸外科 浙江省麗水市323000

核心提要：本研究通過(guò)分析Oncomie和Kaplan-Meier Plotter等數(shù)據(jù)庫(kù)，采用生物信息學(xué)方法探討TMPRSS4在胃癌(gastric cancer，GC)中的表達(dá)及其作為預(yù)后分子標(biāo)志物的可信性.同時(shí)采用免疫組化對(duì)生物信息分析結(jié)果進(jìn)行證實(shí).研究結(jié)果提示TMPRSS4在GC中高表達(dá)并與GC患者預(yù)后不良有關(guān)，可作為GC預(yù)后相關(guān)分子標(biāo)志物.

0 引言

胃癌(gastric cancer，GC)是較為常見的實(shí)體惡性腫瘤，近年來(lái)其發(fā)病率明顯增高，且呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)[1].2018年美國(guó)癌癥流行報(bào)告研究顯示，2018年美國(guó)新發(fā)GC患者26240例，而當(dāng)年因GC死亡患者10800例，GC已成為癌癥相關(guān)死亡的重要原因[2].我國(guó)尚缺乏全國(guó)范圍內(nèi)的腫瘤流行病學(xué)報(bào)告，但區(qū)域性的腫瘤發(fā)病率研究顯示，我國(guó)GC發(fā)病率也呈現(xiàn)出逐年增加并且年輕化的趨勢(shì)[3-5].目前，GC的整體預(yù)后較差，術(shù)后復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是治療失敗的重要原因.影響GC預(yù)后的因素較多，如臨床分期，病理分級(jí)及治療方案等[6，7].同時(shí)也有研究報(bào)道，一些癌基因或抑癌基因的異常表達(dá)也與GC患者的預(yù)后存在相關(guān)性[8].跨膜絲氨酸蛋白酶4(transmembrane protease serines，TMPRSS4)近年來(lái)發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中呈現(xiàn)異常表達(dá)，并與腫瘤的惡性生物學(xué)行為有關(guān)[9].但TMPRSS4在GC中的表達(dá)情況及其與患者預(yù)后的關(guān)系鮮有報(bào)道.因此，我們對(duì)相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了挖掘，探討TMPRSS4在GC組織與正常胃組織中的差異表達(dá)及其與患者生存期的關(guān)系.

1 材料和方法

1.1 材料 選取基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)Oncomine和Kaplan-Meier plotter作為本次數(shù)據(jù)挖掘?qū)ο?篩選上述數(shù)據(jù)庫(kù)中關(guān)于GC患者癌組織和正常胃組織中TMPRSS4基因mRNA的表達(dá)情況并對(duì)比癌組織和正常組織中是否存在差異.同時(shí)回對(duì)麗水市人民醫(yī)院手術(shù)治療的50例GC患者的臨床資料，進(jìn)行回顧性分析.病例資料納入標(biāo)準(zhǔn):(1)手術(shù)治療的GC患者； (2)病理組織切片資料完整； (3)術(shù)后病理證實(shí)為GC； (4)術(shù)前未進(jìn)行新輔助放化療及生物治療； (5)患者組織標(biāo)本獲取經(jīng)患者同意，并經(jīng)麗水市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)討論通過(guò).

1.2 方法 首先我們?cè)谧畲蟮哪[瘤基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)Oncomine中分析TMPRSS4基因在多種腫瘤中是否存在差異表達(dá)，然后分析GC患者癌組織和正常胃組織中TMPRSS4基因的差異情況.數(shù)據(jù)挖掘限定條件為:(1)腫瘤類型:胃腫瘤； (2)組織對(duì)比:腫瘤組織vs正常組織； (3)數(shù)據(jù)類型:mRNA； (4)顯著性:P＜1E-4； (5)差異表達(dá)級(jí)別:大于2倍； (6)基因排序:前10%.然后利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)平臺(tái)挖掘TMPRSS4表達(dá)的芯片數(shù)據(jù)，然后利用在線分析軟件繪制GC患者TMPRSS4高低表達(dá)生存曲線，分析TMPRS4S高低表達(dá)組患者預(yù)后是否存在差異.回顧性分析手術(shù)治療的50例GC患者的臨床資料，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)50例患者癌組織中TMPRSS4蛋白的表達(dá)情況，并分析TMPRSS4表達(dá)與患者臨床特征是否存在相關(guān)性.免疫組化檢測(cè)根據(jù)試劑盒步驟進(jìn)行.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中中分析TMPRSS4表達(dá)差異顯著性條件為P＜1E-4； 差異表達(dá)級(jí)別＞2倍； 基因排序?yàn)榍?0%.納入研究的50例GC患者數(shù)據(jù)分析采用STATA 10.0軟件完成，計(jì)量資料應(yīng)用mean±SD表示，組間比較采用t檢驗(yàn)； 計(jì)數(shù)采用率表示，組間采用χ2檢驗(yàn)；生存分析繪制生存曲線并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)，P＜0.05為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2 結(jié)果

2.1TMPRSS4基因mRNA在腫瘤與正常組織中的整體表達(dá) Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中共收錄了GC、乳腺癌等常見腫瘤組織與對(duì)應(yīng)正常組織中TMPRSS4的差異表達(dá)相關(guān)數(shù)據(jù)集共185項(xiàng)，其中存在差異表達(dá)10項(xiàng)，有9項(xiàng)在腫瘤組織中高表達(dá)，有1項(xiàng)在腫瘤組織中低表達(dá)(圖1).

2.2TMPRSS4在胃腫瘤中與其他基因共表達(dá)分析及信號(hào)通路分析 通過(guò)聚類層次聚類分析顯示，TMPRSS4基因在GC中呈現(xiàn)共表達(dá)的基因有LAMB3、LAD1、ANXA4等(圖2).TMPRSS4與LAMB3、LAD1、ANXA4的共表達(dá)相關(guān)系數(shù)分別為0.57，0.51和0.43.TMPRSS4與LAMB3、LAD1、ANXA4等共表達(dá)基因在功能上可能具有相似性.我們采用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了信號(hào)通路富集，信號(hào)通路提示TMPRSS4相關(guān)蛋白主要集中于細(xì)胞增殖和腫瘤相關(guān)信號(hào)通路(圖3).

2.3TMPRSS4在胃腫瘤的中表達(dá) Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中，有2項(xiàng)基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)關(guān)于TMPRSS4基因在GC組織與正常組織中差異表達(dá)的研究[10，11](圖4).2項(xiàng)基因表達(dá)芯片結(jié)果均提示在GC組織中，TMPRSS4表達(dá)水平高于正常胃組織(P＜0.05)(圖5).

2.4TMPRSS4高低表達(dá)GC患者生存分析 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)中，TMPRSS4表達(dá)與GC患者相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行了多因素Cox回歸分析[12]，在Cox回歸模型中，我們將患者腫瘤分期、性別、Lauren分型、治療方法及腫瘤分化程度等因素加到同一個(gè)模型中，并繪制了TMPRSS4高低表達(dá)的生存曲線，并計(jì)算HR，圖5.結(jié)果顯示，TMPRSS4高低表達(dá)組總中位生存時(shí)間分別為22.0 mo和32.6 mo，高表達(dá)組顯著低于低表達(dá)組(HR = 1.31，95%CI:1.09-1.57，P＜0.05).高低表達(dá)組中位無(wú)疾病進(jìn)展生存時(shí)間分別為22.40 mo和13.87 mo，高表達(dá)組顯著低于低表達(dá)組(HR = 1.27，95%CI:1.03-1.58，P＜0.05)，圖6.根據(jù)GC患者不同分期及性別進(jìn)行了生存分析的亞組Cox回歸分析(我們將患者腫瘤分期、性別、Lauren分型、治療方法及腫瘤分化程度等因素加到同一個(gè)模型中，并繪制了TMPRSS4高低表達(dá)的生存曲線，并計(jì)算HR)(表1).

圖1 TMPRSS4基因mRNA在腫瘤與正常組織中的整體表達(dá).

2.5TMPRSS4蛋白在GC組織中的表達(dá)及臨床意義TMPRSS4蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，程棕褐色顆粒，圖7.50例GC患者中，TMPRSS4陽(yáng)性表達(dá)者18例，陽(yáng)性率為36.0%.TMPRSS4陽(yáng)性表達(dá)與患者臨床病理特征如性別、年齡、腫瘤分期、等無(wú)明顯相關(guān)性(P＞0.05)，然而TMPRSS4陽(yáng)性表達(dá)與患者腫瘤是否侵犯血管存現(xiàn)相關(guān)性，TMPRSS4陽(yáng)性患者腫瘤侵犯血管比顯著高于陰性者(P＜0.05)(表2).

3 討論

TMPRSS4是一類定位于細(xì)胞膜上具有保守絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域的蛋白.該蛋白由TMPRSS4基因編碼，cDNA全長(zhǎng)4.1 kb.現(xiàn)有研究認(rèn)為TMPRSS4在多種實(shí)體腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，如結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌等[9].皇甫深強(qiáng)等[13]采用免疫組化方法探討TMPRSS4蛋白在直腸癌中的表達(dá)及臨床意義，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TMPRSS4蛋白表達(dá)患者5年總生存率明顯低于陰性表達(dá)者，提示TMPRSS4蛋白可能與腸癌患者的預(yù)后不良有關(guān).李培超等[14]采用免疫組化方法探討了TMPRSS4再非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況及其與腫瘤組織中微血管密度的關(guān)系，研究提示TMPRSS4蛋白高表達(dá)與腫瘤中血管密度增高及肺癌腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān).TMPRSS4在GC中的表達(dá)已有相關(guān)研究[15，16]，但大多采用免疫組化或qPCR方法檢測(cè)TMPRSS4基因mRNA或蛋白表達(dá)與患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系，且樣本量較小，無(wú)法進(jìn)行高通量大檢測(cè).同時(shí)，免疫組化為半定量分析，其提供的TMPRSS4基因表達(dá)水平信息有限，且各個(gè)研究間存在一定的差異.因此，在本研究中，我們通過(guò)對(duì)相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，探討TMPRSS4在GC組織與正常胃組織中的差異表達(dá)及其與患者生存期的關(guān)系.

基因表達(dá)譜芯片就有高通量、標(biāo)準(zhǔn)化及對(duì)已知基因進(jìn)行全面檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn).同時(shí)對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化出來(lái)后上傳相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，可進(jìn)行后續(xù)深入分析.在本研究中，我們對(duì)Oncomine和Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)平臺(tái)中儲(chǔ)存的GCTMPRSS4基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行了挖掘和分析，結(jié)果顯示與正常胃組織比較，GC組織中TMPRSS4基因mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，其高表達(dá)與患者的預(yù)后不良相關(guān)，且高表達(dá)者腫瘤侵犯血管比例較高.TMPRSS4高表達(dá)可能是GC患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素.

Oncomie數(shù)據(jù)庫(kù)中TMPRSS4基因mRNA在GC組織樣本中，大多數(shù)呈現(xiàn)高表達(dá)，說(shuō)明TMPRSS4基因在GC的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮了重要作用.然而，其如何調(diào)控胃黏膜細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化并不清楚.共表達(dá)聚類分析顯示，TMPRSS4基因在GC組織中與LAMB3，LAD1等基因存在共表達(dá)，說(shuō)明TMPRSS4、LAMB3、LAD1可能在GC轉(zhuǎn)化過(guò)程具有相似的生物學(xué)功能.因此，提示上述基因可能存相關(guān)調(diào)控信號(hào)通路.

總之，TMPRSS4在包括GC等的多種腫瘤組織中高表達(dá)，并與患者預(yù)后不良相關(guān)，可作為預(yù)測(cè)GC術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的潛在生物學(xué)標(biāo)記物.

式中：s為待估計(jì)西江流域廣東段傳統(tǒng)村落的位置，si為落在以s為圓心的西江流域廣東段傳統(tǒng)村落，h為在半徑空間范圍內(nèi)第i個(gè)傳統(tǒng)村落的位置。

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

胃癌(gastric cancer，GC)是消化系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤之一，且全世界范圍內(nèi)高發(fā).GC患者預(yù)后與腫瘤分期、臨床病理類型、治療方法等多種因素有關(guān).近年來(lái)研究認(rèn)為，某些腫瘤相關(guān)基因的差異表達(dá)可能是GC患者預(yù)后的獨(dú)立因素.跨膜絲氨酸蛋白酶4(transmembrane protease serines，TMPRSS4)近年來(lái)發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中呈現(xiàn)異常表達(dá)，并與腫瘤的惡性生物學(xué)行為有關(guān)，而其在GC中的表達(dá)及其與患者預(yù)后關(guān)系仍不十分清楚.

表1 TMPRSS4表達(dá)與患者總生存及中為生存相關(guān)性亞組分析

表2 TMPRSS4表達(dá)與入組患者基本臨床特征相關(guān)性

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

探討TMPRSS4基因在GC中的表達(dá)及其與患者預(yù)后關(guān)系.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

采用生物信息分析方法分析TMPRSS4基因在GC的表達(dá)情況，評(píng)估其作為GC患者預(yù)后分子標(biāo)志物的可行性.

實(shí)驗(yàn)方法

在Oncomie數(shù)據(jù)庫(kù)中分析TMPRSS4基因在GC中的差異表達(dá)情況.采用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)平臺(tái)繪制生存曲線比較TMPRSS4高低表達(dá)患者生存期是否存在差異.采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)50例患者癌組織中TMPRSS4蛋白的表達(dá)情況，并分析TMPRSS4表達(dá)與患者臨床特征關(guān)系.

圖2 TMPRSS4基因共表達(dá)聚類分析.

圖3 TMPRSS4及其相關(guān)蛋白信號(hào)通路分析.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

GC組織中TMPRSS4基因表達(dá)水平高于正常胃組織(P＜0.05).TMPRSS4高表達(dá)組顯著低于低表達(dá)組(HR =1.31，95%CI:1.09-1.57，P＜0.05).高低表達(dá)組中位無(wú)疾病進(jìn)展生存時(shí)間顯著低于低表達(dá)組(HR = 1.27，95%CI:1.03-1.58，P＜0.05).免疫組化顯示TMPRSS4陽(yáng)性表達(dá)與患者腫瘤是否侵犯血管存現(xiàn)相關(guān)性，TMPRSS4陽(yáng)性患者腫瘤侵犯血管比顯著高于陰性者(P＜0.05).

圖4 TMPRSS4在胃腫瘤的中差異表達(dá)的芯片研究數(shù)據(jù)集.

圖5 胃癌組織與正常組織中TMPRSS4差異表達(dá)芯片數(shù)據(jù)比較的箱式圖.A：數(shù)據(jù)來(lái)自Cho Gastric Statistics； B：數(shù)據(jù)來(lái)自Cui Gastric Statistics.

圖6 TMPRSS4高低表達(dá)胃癌患者生存曲線.A：總生存比較； B：無(wú)疾病進(jìn)展生存比較.

圖7 TMPRSS4蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì), 程棕褐色顆粒.A：TMPRSS4蛋白高表達(dá)×400； B：TMPRSS4蛋白低表達(dá)×200.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

GC患者癌組織中TMPRSS4基因表達(dá)水平明顯升高，其高表達(dá)與患者的預(yù)后不良相關(guān)，且高表達(dá)者腫瘤侵犯血管比例較高.

展望前景

TMPRSS4基因在GC組織中高表達(dá)并與腫瘤侵犯血管有關(guān)，其高表達(dá)者預(yù)后不良.TMPRSS4可作為GC患者預(yù)后不良的潛在分子標(biāo)志物.