MAPK通路主要激酶抑制劑對亞洲帶絳蟲感染乳豬肝細(xì)胞生長抑制率和凋亡率的影響

門萬琪,楊漢蕾,張 科,楊 林,許士剛,牟 榮

亞洲帶絳蟲(Taenia asiatica)是一種常見的人獸共患寄生蟲,人是唯一終宿主[1]。這種帶絳蟲主要分布在亞太部分地區(qū)[2],近年還在印度北部地區(qū)和老撾發(fā)現(xiàn)該蟲種[3-4]。亞洲帶絳蟲的流行與當(dāng)?shù)厝藗儾涣嫉娘嬍澈蜕盍?xí)慣有關(guān),而它的感染則直接危害人和家畜的健康[5]。亞洲帶絳蟲的最適宜中間宿主是豬,囊尾蚴一般寄生于肝臟,導(dǎo)致肝組織的病理變化。前期研究發(fā)現(xiàn)囊尾蚴的寄生可以引起肝臟的急慢性炎癥反應(yīng)、肝細(xì)胞凋亡及肉芽腫形成等多種病理變化[6]。

絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)是生物體內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一。MAPK信號通路主要包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK),c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino-terminal protein kinase,JNK)和p38MAPK,MAPK通路對細(xì)胞增殖,細(xì)胞分裂及分化,應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等產(chǎn)生重要作用[7]。MAPK信號通路在寄生蟲感染宿主過程中參與宿主細(xì)胞對有絲分裂原、熱休克蛋白和促炎細(xì)胞因子等多種刺激的反應(yīng),還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖,基因表達(dá),細(xì)胞存活和凋亡等功能[8]。近年來,課題組相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),亞洲帶絳蟲感染乳豬后可顯著影響肝細(xì)胞MAPK通路主要激酶基因的表達(dá)并抑制肝細(xì)胞生長[9]。另外,Lin R等[10]在研究感染多房棘球絳蟲(Echinococcus multilocularis)的小鼠肝臟基因表達(dá)譜后發(fā)現(xiàn)MAPK信號通路主要激酶基因均出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)并影響肝細(xì)胞的增殖。

目前用CCK-8法和流式細(xì)胞術(shù)對寄生蟲感染宿主組織細(xì)胞的損傷作用進(jìn)行研究。常見的ERK、p38和JNK抑制劑分別是U0126、SB203580和SP600125。Smout MJ等[11]研究發(fā)現(xiàn)U0126可以抑制華支睪吸蟲(Clonorchis sinensis)分泌蛋白所致小鼠成纖維細(xì)胞增殖。Jin X等[12]研究發(fā)現(xiàn)SB203580可以抑制犬新孢子蟲(Neospora caninum)對牛腎細(xì)胞的侵襲作用。Wu Y等[13]研究華支睪吸蟲(Clonorchis sinensis)分泌蛋白可激活肝形狀細(xì)胞(Hepatic stellate cell,HSC),而SP600125能抑制JNK活性,抑制HSC過度增殖。但目前尚無U0126、SB203580和SP600125對亞洲帶絳蟲感染中間宿主乳豬肝細(xì)胞MAPK通路影響的研究報(bào)道。本研究在建立亞洲帶絳蟲感染和MAPK特異性抑制劑干預(yù)的動物模型基礎(chǔ)上,分別采用CCK-8法、流式細(xì)胞術(shù)和RT-PCR檢測肝細(xì)胞生長抑制率、細(xì)胞凋亡率以及ERK1、p38和JNK1基因的表達(dá)水平,以了解MAPK特異性抑制劑干預(yù)后感染肝細(xì)胞MAPK信號通路相關(guān)基因表達(dá)、細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡的變化,探究MAPK特異性抑制劑是否能夠減輕亞洲帶絳蟲所致乳豬肝組織損傷,進(jìn)一步為抗囊尾蚴病的藥物研發(fā)及囊尾蚴病的治療提供新的、有價(jià)值的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 蟲體來源 亞洲帶絳蟲標(biāo)本采自貴州省都勻市墨沖鎮(zhèn)。對近期有排節(jié)片患者用檳榔-南瓜子法驅(qū)蟲,經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定,確定采集蟲體為亞洲帶絳蟲并收集成蟲孕節(jié)和蟲卵。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 30頭20 d齡約克二元施格雜交乳豬,動物批號[2017-151],體重3.4～7.5 kg,體健,經(jīng)糞檢和間接血凝集試驗(yàn)證實(shí)無豬囊蟲等寄生蟲感染,購自貴州省龍里縣種豬養(yǎng)殖基地。

1.1.3 主要試劑和儀器 Trizol試劑購自美國sigma公司,熒光定量PCR試劑盒和和cDNA合成試劑盒購自日本TAKARA公司,氯仿、異丙醇和乙醇均購自上海國藥集團(tuán),cck一8試劑購自北京康為世紀(jì)公司,PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。熒光定量PCR儀(7300)為美國ABI公司產(chǎn)品,酶標(biāo)儀(μ一Quant)為美國Bio—Tek公司產(chǎn)品。

1.2 方 法

1.2.1 蟲卵收集和計(jì)數(shù) 取每條亞洲帶絳蟲成蟲后部10～20節(jié)孕節(jié),在盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿中以細(xì)針沿縱軸劃破孕節(jié)使蟲卵溢出,并反復(fù)用生理鹽水清洗,裝入試管以2 000 r/min離心20 min,收集蟲卵備用。光學(xué)顯微鏡下觀察收集的蟲卵并分別計(jì)數(shù)5次,取平均值,定量1 mL生理鹽水中蟲卵數(shù)為15萬個(gè)備用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動物感染和標(biāo)本采集 乳豬隨機(jī)分為5組,即正常對照組4頭、實(shí)驗(yàn)組5頭、U0126抑制劑干預(yù)組、SB203580抑制劑干預(yù)組和SP600125抑制劑干預(yù)組各7頭,實(shí)驗(yàn)組以定量蟲卵15萬個(gè)/頭通過胃管灌胃感染。上述3組抑制劑干預(yù)組自灌胃之日起每頭乳豬分別腹腔注射抑制劑U0126、SP600125、SB203580 1 mg/kg,隔天1次,連續(xù)注射7次。各組在封閉環(huán)境下同條件飼養(yǎng)。于感染后第15 d麻醉處死所有組乳豬,采集對照組、實(shí)驗(yàn)組和各抑制劑干預(yù)組乳豬肝組織,并剝除實(shí)驗(yàn)組囊尾蚴。將各組肝組織放入冷凍管或有1 mL Trizol的EP管中,保存于-80℃冰箱備用。

1.2.3 CCK-8法檢測乳豬肝細(xì)胞生長抑制率 將-80℃冰箱取出的肝組織先用1640培養(yǎng)液沖洗后置于平皿中,再用注射器針頭輕輕研磨,邊研磨邊以1640培養(yǎng)液沖洗,直至組織研磨完全。收集肝組織細(xì)胞懸液,經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾,1 500 r/min離心5 min,再以1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。調(diào)整各組肝細(xì)胞懸液濃度為5 000個(gè)/mL,以每孔100μL細(xì)胞懸液量接種于96孔板,每孔再加入10μL CCK-8,于37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)2 h后,在450 nm波長處讀取光密度值。以對照組作為陰性對照,按公式計(jì)算實(shí)驗(yàn)組和各抑制劑干預(yù)組肝細(xì)胞生長抑制率:細(xì)胞生長抑制率＝(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/陰性對照組OD值)×100%。對照組、實(shí)驗(yàn)組和各抑制劑干預(yù)組各選取3個(gè)樣本檢測,每個(gè)樣本各做6孔。

1.2.4 流式細(xì)胞儀測定乳豬肝細(xì)胞凋亡率 取各組肝細(xì)胞懸液,每組肝細(xì)胞5×104個(gè),1 000 r/min離心5 min,再用500μL AnnexinⅤ-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞,然后加入15μL Annexin V-FITC,4℃避光孵育15 min。加入5μL PI染液5 min后,上機(jī)檢測并分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 根據(jù)GenBank相關(guān)序列,使用上海生工公司在線軟件設(shè)計(jì)ERKl、JNKl、p38和β肌動蛋白(β-actin)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物,并由其合成(表1)。采用Trizol一步法提取各組乳豬肝組織總RNA,按試劑盒說明操作獲得逆轉(zhuǎn)錄cDNA。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s,95℃變性5 s,60℃退火34 s,72℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。記錄熒光定量PCR儀得出的各組目的基因和內(nèi)參基因的CT值,重復(fù)3次取平均值。計(jì)算目的基因的△△CT值,采用2-△△CT法計(jì)算出各組目的基因的相對表達(dá)量。

表1 熒光定量PCR引物Tab.1 Primers for Quantitative Real-Time PCR

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處。1)數(shù)據(jù)的正態(tài)性分析。2)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示,采用單因素方差分析比較各組間差異,組間兩兩比較視方差齊性采用LSD法(齊),P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 亞洲帶絳蟲蟲卵實(shí)驗(yàn)感染乳豬結(jié)果 感染后第15 d,實(shí)驗(yàn)組肝臟和各抑制劑干預(yù)組肝臟均可見白色細(xì)小點(diǎn)狀結(jié)構(gòu),未見清晰囊尾蚴結(jié)構(gòu)(圖1)。實(shí)驗(yàn)總共感染乳豬26頭,其中感染組5頭,3種抑制劑干預(yù)組21頭。乳豬囊尾蚴感染率為100%。

圖1 亞洲帶絳蟲感染后不同組乳豬肝臟外觀,箭頭所示為囊尾蚴Fig.1 Liver appearance of different groups of porkets after infection with Taenia asiatica,↑indicated cysticercus

2.2 CCK-8法測乳豬肝細(xì)胞的生長抑制率 感染組肝細(xì)胞生長抑制率為(23.11±1.26)%,U0126組生長抑制率為(16.48±0.7)%,與感染組相比(t＝9.223,P＜0.001);SB203580組生長抑制率為(12.59±1.2)%,與感染組相比(t＝11.532,P＜0.001);SP600125組生長抑制率為(18.3±0.75)%,與感染組相比 (t＝6.775,P＜0.001);各干預(yù)組均較感染組的生長抑制率明顯降低(圖2)。

圖2 感染組和抑制劑干預(yù)組乳豬肝細(xì)胞的生長抑制率(±s)%Fig.2 Growth inhibition rate of hepatocytes in infection group and inhibitor intervention group(±s)%

2.3 流式細(xì)胞儀檢測乳豬肝細(xì)胞凋亡率 流式細(xì)胞儀的細(xì)胞點(diǎn)圖示:流式細(xì)胞分析圖的左下區(qū)(LL)為正?；罴?xì)胞,右下區(qū)(RL)為早期凋亡細(xì)胞;右上區(qū)(RU)為晚期凋亡或死亡細(xì)胞,左上區(qū)(LU)為收集過程中損傷的細(xì)胞(圖3)。對照組肝細(xì)胞凋亡率為(13.44±1.6)%,感染組(18.21±1.1)%與對照組相比(t＝-4.282,P＜0.05);U0126組為(26.12±3.3)%,與對照組相比 (t＝-5.998,P＜0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與對照組相比,SB203580組為(15.34±1.4)%(t＝-1.548,P＞0.05),SP600125組為(16.22±2.7)%(t＝-1.545,P＞0.05),此兩組的肝細(xì)胞凋亡率與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;與感染組相比,U0126干預(yù)組的肝細(xì)胞凋亡率增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(t＝-5.934,P＜0.001),SB203580干預(yù)組的肝細(xì)胞凋亡率較感染組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝3.821,P＜0.01),SP600125干預(yù)組的肝細(xì)胞凋亡率較感染組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝1.188,P＞0.05)(圖4)。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測乳豬肝細(xì)胞ERK1、p38、JNK1的mRNA相對表達(dá)量的變化 與對照組相比,感染組(t＝-10.739,P＜0.05)和 U0126干預(yù)組(t＝-4.157,P＜0.05)的 ERK1 mRNA 相對表達(dá)量增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與感染組相比,U0126干預(yù)組ERK1 mRNA相對表達(dá)量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝3.462,P＜0.05);與對照組相比,感染組(t＝-8.227,P＜0.01)和SB203580干預(yù)組(t＝-3.118,P＜0.01)p38 mRNA相對表達(dá)量增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與感染組相比,SB203580干預(yù)組p38 mRNA相對表達(dá)量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝3.267,P＜0.05);與對照組相比,感染組(t＝2,887,P＜0.05)和SP600125干預(yù)組(t＝10.392,P＜0.05)JNK1 mRNA的相對表達(dá)量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與感染組相比,SP600125干預(yù)組JNK1 mRNA的表達(dá)量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝3.363,P＜0.001)(圖5)。

圖3 乳豬肝細(xì)胞流式檢測圖Fig.3 Flow cytometry figure of porcine hepatocytes

圖4 對照組、感染組和三種抑制劑干預(yù)組乳豬肝細(xì)胞的凋亡率Fig.4 Apoptosis rate of liver cells of suckling pigs in control group,infection group and three inhibitor intervention groups

3 討 論

寄生蟲的感染可影響宿主組織細(xì)胞MAPK通路中相關(guān)基因的表達(dá)導(dǎo)致該通路的激活并產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。Han S等[14]研究認(rèn)為大鼠肝細(xì)胞炎癥和凋亡與華支睪吸蟲(Clonorchis sinensis)感染激活肝細(xì)胞MAPK信號通路有關(guān)。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)亞洲帶絳蟲幼蟲在乳豬體內(nèi)發(fā)育過程中可影響肝臟MAPK通路中ERK1/2、p38和JNK1基因的表達(dá)水平[9]。有研究表明,通過抑制MAPK通路ERK1/2、p38和JNK1基因表達(dá),能夠減輕陰道毛滴蟲感染導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)[15]。MAPK信號通路特異性抑制劑可抑制相應(yīng)通路的激活,減輕寄生蟲感染后MAPK信號通路活化而產(chǎn)生的各種組織細(xì)胞病理損傷[11-13]。常見的MAPK信號通路抑制劑有 ERK 抑制劑(U0126)、p38MAPK 抑制劑(SB203580)和JNK抑制劑(SP600125)等,這些抑制劑可作用于MAPK通路的相應(yīng)位點(diǎn),從而抑制通路激活,可能具有治療某些癌癥的潛力[16-17]。

圖5 感染組和U0126干預(yù)組ERK1基因、SB203580干預(yù)組p38基因、SP600125干預(yù)組JNK1基因mRNA相對表達(dá)量Fig.5 Relative expression of ERK1,p38 and JNK1 mRNA in infection group and three inhibitor intervention groups

研究表明肝臟內(nèi)寄生蟲可通過激活MAPK通路來抑制肝細(xì)胞生長。Liu P等[18]發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲卵抗原可激活小鼠肝細(xì)胞MAPK通路中p38和JNK蛋白激酶并抑制肝星狀細(xì)胞增殖。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)亞洲帶絳蟲感染可通過改變MAPK通路中ERK1、p38和JNK基因表達(dá)來抑制肝細(xì)胞生長[9]。本研究使用3種抑制劑(U0126、SB203580和SP600125)對亞洲帶絳蟲感染乳豬進(jìn)行注射干預(yù),結(jié)果顯示3種抑制劑干預(yù)組的乳豬肝細(xì)胞生長抑制率均較感染組明顯降低。由此可見,經(jīng)3種抑制劑干預(yù),亞洲帶絳蟲幼蟲寄生所致的乳豬肝細(xì)胞生長抑制率明顯減低,有利于肝細(xì)胞生長。這可能與乳豬肝細(xì)胞中激活的MAPK通路被抑制有關(guān),經(jīng)特異性抑制劑阻斷后,肝細(xì)胞中MAPK信號通路相關(guān)基因的表達(dá)被抑制,從而影響了細(xì)胞的生長、增殖和凋亡。

此外,研究表明MAPK信號通路抑制劑可以影響寄生蟲的生長發(fā)育和寄生蟲對宿主的侵襲力。Cheng Z等[19]在研究U0126對多房棘球絳蟲(E-chinococcus multilocularis)泡球蚴生發(fā)細(xì)胞的作用中發(fā)現(xiàn)U0126抑制了蟲體生發(fā)細(xì)胞的增殖和生長。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)U0126明顯降低乳豬肝細(xì)胞生長抑制率,從而促進(jìn)乳豬肝細(xì)胞生長,推測可能與亞洲帶絳蟲幼蟲在乳豬肝臟內(nèi)生長發(fā)育中也受到U0126抑制有關(guān)。由于U0126可能抑制亞洲帶絳蟲幼蟲體內(nèi)MAPK信號通路中主要參與細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和發(fā)育等過程的ERK1/2途徑,該途徑的激活受到抑制可能會干擾幼蟲在乳豬肝臟內(nèi)的生長發(fā)育進(jìn)程,以減輕幼蟲對肝組織的破壞和損傷,進(jìn)而減緩肝細(xì)胞的生長抑制,具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。另外,Jin X等[12]研究發(fā)現(xiàn)SB203580可顯著降低犬新孢子蟲(Neospora caninum)自身的運(yùn)動能力和對牛腎細(xì)胞的侵襲作用。Bussière FI等[20]比較3種MAPK通路抑制劑(PD98059,SP600125和SB203580)在柔嫩艾美球蟲(Eimeria tenella)對宿主腸道上皮細(xì)胞侵襲性的影響研究中發(fā)現(xiàn),SP600125和SB203580能顯著抑制該蟲對腸上皮細(xì)胞的侵襲力。由此我們推測,本實(shí)驗(yàn)中SB203580和SP600125也可能通過降低亞洲帶絳蟲幼蟲在乳豬體內(nèi)的活動能力或者抑制其對乳豬肝臟的侵襲作用,以減輕幼蟲對肝臟組織細(xì)胞的破壞,從而減少肝細(xì)胞損傷,使得肝細(xì)胞的生長抑制率降低,促進(jìn)肝細(xì)胞生長。

MAPK信號通路是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵參與者,但通路中不同級聯(lián)的激活對細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)有所差異。研究表明MAPK信號通路中ERK基因的上調(diào)表達(dá),ERK途徑激活可以促使細(xì)胞存活、減少細(xì)胞凋亡[21]。而MAPK信號通路中p38和JNK途徑的激活則促進(jìn)細(xì)胞凋亡[22]。課題組前期研究結(jié)果顯示,亞洲帶絳蟲幼蟲感染乳豬肝臟后可致乳豬肝細(xì)胞凋亡增加[6]。Tsai JJ等[23]研究發(fā)現(xiàn)瑞格列尼(regorafenib)通過抑制SK-HEP-1細(xì)胞中的ERK和NF-κB途徑而促進(jìn)細(xì)胞凋亡,表明抑制MAPK信號通路中的ERK途徑可以增加SKHEP-1細(xì)胞凋亡。Aoki Mdel P等[24]研究克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)感染的小鼠心肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn),抑制ERK1/2途徑可增加心肌細(xì)胞凋亡率。本研究發(fā)現(xiàn),U0126抑制劑干預(yù)組的肝細(xì)胞凋亡率較對照組和感染組均明顯升高且ERK1 mRNA表達(dá)水平降低。由此推測,U0126抑制劑干預(yù)組乳豬肝細(xì)胞期凋亡增加可能與ERK1/2途徑的抑制有關(guān),U0126可能通過下調(diào)乳豬肝細(xì)胞ERK1 mRNA表達(dá)水平來抑制ERK途徑,導(dǎo)致乳豬肝細(xì)胞凋亡率增加。

另外,研究表明有些原蟲可通過抑制JNK或p38 MAPK途徑來減少宿主細(xì)胞的凋亡率。Rodríguez-González J等[25]在墨西哥利什曼原蟲(Leishmania mexicana)無鞭毛體感染樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DC)的研究中發(fā)現(xiàn)無鞭毛體通過減少p38 MAPK和JNK的磷酸化,抑制被感染DC細(xì)胞的凋亡,以延長DC的存活。Chang JH等[26]研究證明SB203580的干預(yù)治療可持續(xù)阻斷陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)導(dǎo)致的人巨噬細(xì)胞凋亡。Sreekanth GP等[27]研究登革熱病毒(DENV)感染BALB/c小鼠肝臟發(fā)現(xiàn),SP600125可抑制JNK1/2磷酸化,減少細(xì)胞凋亡,減輕肝損傷。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),SB203580與SP600125干預(yù)組乳豬肝細(xì)胞p38和JNK1 mRNA表達(dá)水平降低,且肝細(xì)胞凋亡率較感染組明顯降低并且與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明SB203580與SP600125可明顯減少因亞洲帶絳蟲幼蟲感染所致的肝細(xì)胞凋亡。我們推測SB203580和SP600125可能通過下調(diào)p38和JNK1 mRNA表達(dá)來抑制p38和JNK途徑,以減少肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)亞洲帶絳蟲感染可明顯影響乳豬肝細(xì)胞ERK1、p38和JNK1基因mRNA水平,特異性抑制劑可以通過改變?nèi)樨i肝細(xì)胞MAPK相關(guān)基因的mRNA水平減輕肝細(xì)胞的生長抑制和細(xì)胞凋亡,而在亞洲帶絳蟲感染乳豬肝臟的病理生理變化過程中,抑制劑是如何通過抑制不同底物磷酸化以及是否同時(shí)調(diào)節(jié)通路中其他相關(guān)基因的表達(dá)值得進(jìn)一步研究。

利益沖突:無

引用本文格式:門萬琪,楊漢蕾,張科,等.MAPK通路主要激酶抑制劑對亞洲帶絳蟲感乳豬肝細(xì)胞生長抑制率和凋亡率的影響[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào),2019,35(9):797-804.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.084