中獸藥散劑中非法添加酰胺醇類藥物的檢測方法研究

高 婷，李應(yīng)超，王亞芳，張連彥，張小飛，鐘昆芮

(北京市獸藥監(jiān)察所，北京 102629)

酰胺醇類藥物，主要有氯霉素、甲砜霉素及氟苯尼考，其作為一種抑菌性廣譜抗生素，作用是抗感染，可作用于細(xì)菌核糖核蛋白體的 50S 亞基，而阻撓蛋白質(zhì)的合成[1]。由于其價格低廉，可大量生產(chǎn)，因此有些不法商家將酰胺醇類藥物加入綠色、安全的中獸藥散劑中，以提高藥物抗菌作用。添加的化學(xué)藥物與中藥的相互作用既有可能減弱療效，又有可能對動物產(chǎn)生新毒副作用[2-3]。非法添加酰胺醇類藥物導(dǎo)致畜禽產(chǎn)品中藥物殘留，對人的造血系統(tǒng)、消化系統(tǒng)具有嚴(yán)重的毒性反應(yīng)，有可能引發(fā)人的再生障礙性貧血[4-5]，因此急須建立一種穩(wěn)定的、可靠的方法監(jiān)測中獸藥散劑中酰胺醇類藥物的非法添加現(xiàn)象。

目前，中獸藥制劑中非法添加化學(xué)藥物分析檢測的技術(shù)手段主要有顯微鑒別[6]、薄層色譜分析[7]、高效液相色譜[8-9]、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)[10]等。顯微鑒別方法能夠?qū)崿F(xiàn)快速檢測,但該方法只能進(jìn)行初步定性；薄層色譜分析也是起到初篩的作用，存在假陽性的風(fēng)險；液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)—般不作為主要分析手段用于常量分析。高效液相色譜以分離性能高、分析速度快，通過保留時間及紫外圖譜雙重定性，減小了假陽性的可能性，因此，高效液相色譜不僅是獸藥檢驗的常用分析方法，也是檢查中獸藥制劑中非法添加化學(xué)藥物的最主要的分析手段。

實驗在上述文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合國家標(biāo)準(zhǔn)，對中獸藥散劑中非法添加酰胺醇類藥物進(jìn)行研究，以滿足檢測需要。試樣經(jīng)40%甲醇溶解、離心、定容，最后經(jīng)高效液相色譜二極管陣列檢測器檢測。本方法快速、高效，能夠準(zhǔn)確測定中獸藥散劑中非法添加的酰胺醇類藥物。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀(Agilent 1100，美國，配有二極管陣列檢測器)、電子天平(Mettler Toledo，瑞士)。甲醇、乙腈(色譜級，美國Fisher公司)，實驗用水由MilliQ-Gradient 超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)制備。

1.2 對照品 甲砜霉素對照品(來源：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號K0241406，含量99.7%)、氟苯尼考對照品(來源：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號K0301305，含量99.3%)、氯霉素對照品(來源：中國藥品生物制品檢定研究院，批號130555-201203，含量99.8%)。

1.3 供試品 健胃散、止痢散、球蟲散、胃腸活等中獸藥散劑均來自企業(yè)審批檢驗的合格產(chǎn)品。

1.4 色譜條件 色譜柱為Waters Atiantis?T3 5 μm,4.6 mm×250 mm。流動相A為甲醇；流動相B為乙腈；流動相C為水，梯度洗脫。流速1.0 mL/min；檢測波長為224和278 nm；進(jìn)樣體積為10 μL。流動相梯度洗脫方法如表1所示。

表1 梯度洗脫方法Tab 1 The method of gradient elution

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

1.5.1 對照品儲備溶液 分別精密稱取甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素對照品50、50、125 mg置100 mL量瓶中，加40%甲醇溶液超聲使溶解，用40%甲醇溶液稀釋至刻度，濃度分別為0.5、0.5、1.25 mg/mL，用時根據(jù)需要稀釋至相應(yīng)濃度。

1.5.2 系統(tǒng)適用性溶液 精密稱取甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素對照品各25 mg，置50 mL量瓶中，加40%甲醇溶液適量，超聲使溶解，放置至室溫，加40%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻；精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，加40%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濃度為50 μg/mL。

1.6 樣品溶液的制備

1．6.1 陰性樣品儲備溶液 分別稱取供試品0.50 g，精密加入50 mL 40%甲醇溶液超聲，6000 r/min離心5 min，取上清液備用。

1.6.2 陰性樣品溶液 精密量取陰性樣品儲備液1 mL，精密加入9 mL 40%甲醇溶液，混勻，上機(jī)前使用0.45 μm濾膜過濾。

1.6.3 陽性樣品溶液 精密量取陰性樣品儲備液1 mL，精密加入對照品儲備液1 mL和8 mL 40%甲醇溶液，混勻。上機(jī)前使用0.45 μm濾膜過濾。

1.6.4 陽性添加樣品 按照甲砜霉素、氟苯尼考及氯霉素制劑常用規(guī)格，即5%，5%，12.5%的比例在供試品中添加3種酰胺醇類藥物。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適用性試驗 取40%甲醇溶液、系統(tǒng)適用性溶液、陰性樣品溶液、陽性添加樣品溶液，在本試驗確定色譜條件下測定，記錄色譜峰，如圖1，圖2，圖3，圖4所示。在此測定條件下，40%甲醇溶液及各陰性樣品溶液對待測組分沒有干擾，各藥物之間的分離度良好，甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素的出峰時間分別為9.1、18.7、24.2 min，各目標(biāo)峰純度角小于純度閾值，表明峰的純度較好。

圖1 40%甲醇溶液色譜圖Fig 1 The chromatogram of 40% Methanol solution

圖2 酰胺醇類藥物對照品溶液(50 μg/mL)色譜圖Fig 2 The chromatogram of Amide alcohol reference solution (50 μg/mL)

圖3 健胃散-空白色譜圖Fig 3 The blank chromatogram of Jianweisan

圖4 健胃散-添加(50 μg/mL)色譜圖Fig 4 The chromatogram of Jianweisan-addition (50 μg/mL)

2.2 精密度試驗 取濃度為50 μg/mL的甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在本試驗確定色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，其峰面積的RSD分別為0.11%、0.11%、0.13%，表明在該色譜條件下檢測，標(biāo)準(zhǔn)溶液精密度良好。

2.3 重現(xiàn)性試驗 按陽性添加樣品的制備方法制備6份健胃散添加溶液，在本試驗確定色譜條件下進(jìn)樣，測定甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素的峰面積，RSD分別為2.13%、2.56%、2.29%，表明此方法的重現(xiàn)性良好。

2.4 檢測限 精密量取各樣品的陰性樣品儲備液1 mL，置15 mL離心管中，精密加入系統(tǒng)適用性溶液適量(0.5 mL、0.6 mL和0.8 mL)，用40%甲醇溶液稀釋至10 mL，搖勻，在本試驗確定色譜條件下進(jìn)樣，以光譜未失真的最低添加量作為檢測限。經(jīng)對比光譜圖及純度峰，所檢測藥物中甲砜霉素的檢測限為3 g/kg、氟苯尼考及氯霉素的檢測限均為4 g/kg，如圖5至16所示。

圖5 甲砜霉素-對照品(50 μg/mL)光譜圖Fig 5 The spectrum of Thiopentomycin-reference (50 μg/mL)

圖6 甲砜霉素-對照品(50 μg/mL)純度峰Fig 6 The purity peak of Thiamphenicol- reference (50 μg/mL)

圖7 氟苯尼考-對照品(50 μg/mL)光譜圖Fig 7 The spectrum of Fluoroquinol -reference (50 μg/mL)

圖9 氯霉素-對照品(50 μg/mL)光譜圖Fig 9 The spectrum of Chloramphenicol-reference (50 μg/mL)

圖10 氯霉素-對照品(50 μg/mL)純度峰Fig 10 The purity peak of Chloramphenicol-reference (50 μg/mL)

圖11 止痢散(甲砜霉素3 g/kg)光譜圖Fig 11 The spectrum of Zhili San (Memboxin 3 g/kg)

圖12 止痢散(甲砜霉素3 g/kg)純度峰Fig 12 The purity peak of Zhili San (Memboxin 3 g/kg)

圖13 止痢散(氟苯尼考4 g/kg)光譜圖Fig 13 The spectrum of Zhili San (Flufenicol 4 g/kg)

圖14 止痢散(氟苯尼考4 g/kg)純度峰Fig 14 The purity peak of Zhili San (Flufenicol 4 g/kg)

圖15 止痢散(氯霉素4 g/kg)光譜圖Fig 15 The spectrum of Zhili San (Chloramphenicol 4 g/kg)

圖16 止痢散(氯霉素4 g/kg)純度峰Fig 16 The purity peak of Zhili San (Chloramphenicol 4 g/kg)

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素的對照品儲備液，用40%甲醇稀釋至濃度分別為10、20、50、100、250、500 μg/mL，在本試驗的色譜條件下進(jìn)行測定，以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，三種藥物的線性方程分別為y=21.46x-7.1245；y=21.009x-4.1586；y=15.876x-3.5812，相關(guān)系數(shù)R2均在0.999以上，如圖17所示。結(jié)果表明，三種藥物在10～500 μg/mL濃度范圍內(nèi)時，藥物濃度與相應(yīng)峰面積線性關(guān)系良好。

2.6 加樣回收率試驗 在陰性樣品中按照80%，100%，120%添加甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素3種酰胺醇類藥物，按外標(biāo)法計算其回收率，三種藥物的回收率在均在98.0%～103.0%，變異系數(shù)均在0.6%～1.6%，其試驗結(jié)果如表2所示。

圖17酰胺醇類藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線方程與相關(guān)系數(shù)Fig 17 Standard curve equation and correlation coefficient of amide alcohols

表2 中獸藥散劑中添加酰胺醇類藥物(甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素)的回收率和變異系數(shù)(n=9)Tab 2 Recovery and coefficient of variation of amide alcohols (Methamphetamine,Florfenicol and Chloramphenicol)added to Chinese veterinary drug powder (n=9)

3 討論與結(jié)論

3.1 中獸藥散劑種類的選擇 一直以來，中獸藥具有綠色、安全、無殘留的特點，備受廣大養(yǎng)殖戶的青睞，寄托了獸醫(yī)獸藥行業(yè)的厚望。本試驗選擇的四種中獸藥散劑為養(yǎng)殖過程中的常用藥，均有一定的預(yù)防和治療腸道感染的作用。其中健胃散具有治療嘔吐反胃、消化不良的功效；止痢散具有治療濕熱瀉痢、熱毒血痢的功效；球蟲散具有抗球蟲病、涼血止血的功效；胃腸活具有治療消化不良的功效。酰胺醇類藥物，屬抑菌性廣譜抗生素，用于治療敏感細(xì)菌所致的呼吸系統(tǒng)、腸道及尿路等感染，故在畜禽養(yǎng)殖中極有可能被非法添加到上述四種中獸藥散劑中，用于加強(qiáng)預(yù)防及治療細(xì)菌感染。

3.2 色譜柱及柱溫的選擇 通過改變柱溫，未見色譜圖有明顯變化，考慮到本方法檢測較多樣品及采用梯度洗脫的方式，試驗選擇以35℃為檢測溫度，以提高色譜峰的重現(xiàn)性。本試驗使用了不同品牌、不同型號的色譜柱：Waters Atiantis?T3 (5 μm，4.6 mm×250 mm)、Waters symmetry C18 (5 μm，4.6 mm×250 mm)、Waters Xterra C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)、Agilent Eclipse XDB-C18(5 μm，4.6 mm×150 mm)等色譜柱，綜合考慮待測組分與其他藥物的分離度，以及保留時間和靈敏度，只有Waters Atiantis?T3(5 μm，4.6 mm×250 mm)對甲砜霉素保留時間較長，能使被測成分有效的分離，并且與其他成分峰不產(chǎn)生干擾。其他色譜柱不能使中獸藥制劑與三種酰胺醇類藥物有效的分離，或者不能將三種被測藥物有效的分離。

3.3 流動相的選擇 試驗在優(yōu)化流動相的過程中盡量避免引入酸或鹽類物質(zhì)，以免減少柱子壽命。本試驗探究了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水三種流動相組合，經(jīng)比較甲醇-乙腈-水的分離效果比甲醇-水或乙腈-水的分離效果要好。由于中藥的成分比較復(fù)雜，等度洗脫未能完全實現(xiàn)藥物的基線分離，因此選擇梯度洗脫，洗脫程序為表1，其中甲砜霉素的極性最強(qiáng)，最先出峰，保留時間為9.3 min，氟苯尼考居中，保留時間為19.1 min，氯霉素的極性最弱，最后出峰，保留時間為24.2 min，此時三種酰胺醇類藥物能實現(xiàn)基線分離，并能與中獸藥制劑中的成分有效的分離。

3.4 結(jié)論 試驗采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器、梯度洗脫的方法，建立的中獸藥散劑中非法添加酰胺醇類藥物檢查方法，能夠?qū)崿F(xiàn)添加的酰胺醇藥物與固體制劑藥物中其他成分的有效分離，經(jīng)峰純度檢查確保酰胺醇類藥物出峰處無干擾，同時該方法較穩(wěn)定、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于中獸藥散劑中酰胺醇類藥物的檢測。此外，經(jīng)試驗驗證，該方法對于β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類等固體藥物制劑中酰胺醇類非法添加的檢測也具有較好的效果。