PK15細(xì)胞的無血清全懸浮馴化研究

劉天倫，郎洪彬，孔 颯

(1.北京民海生物科技有限公司，北京102609；2.北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司，北京102609)

豬圓環(huán)病毒病是由豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)引起的病毒性傳染病。研究結(jié)果表明，PCV2感染除了造成斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)，同時還與豬呼吸道綜合癥(PRDC)、豬皮炎和腎病綜合征(PNDS)、先天性震顫、繁殖障礙、胎兒心肌炎和擴(kuò)張性壞死性肺炎等豬圓環(huán)病毒病(PCDAD)密切相關(guān)[1]，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。王貴華等[2]已經(jīng)用PK15細(xì)胞成功分離了豬圓環(huán)病毒2型。PK15為豬腎上皮細(xì)胞，對豬圓環(huán)病毒(PCV)、豬細(xì)小病毒(PPV)和豬瘟病毒(CSFV)等多種病毒比較敏感[3]。PK15細(xì)胞現(xiàn)已用于PCV2的生產(chǎn)，但由于PCV2體外增殖能力較差，致使PCV2效價不高。因此，PCV2的滴度問題一直是PCV2培養(yǎng)過程中的關(guān)鍵[4]。生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是提升細(xì)胞密度的核心技術(shù)，其中微載體技術(shù)是目前較為成熟的技術(shù)之一。何錫忠等[5]利用微載體技術(shù)培養(yǎng)PK15細(xì)胞生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型，任麗[6]用生物反應(yīng)器對PCV2的微載體懸浮培養(yǎng)進(jìn)行了系統(tǒng)研究。但由于微載體培養(yǎng)系統(tǒng)不適合于對剪切力較敏感的細(xì)胞，且存在微載體價格昂貴，重復(fù)利用效果不好，細(xì)胞制備需求量過大等缺點(diǎn)，馴化一株可適應(yīng)大規(guī)模生物反應(yīng)器培養(yǎng)的全懸浮PK15細(xì)胞可推進(jìn)工藝的進(jìn)一步升級。全懸浮細(xì)胞培養(yǎng)具有細(xì)胞密度大、放大倍數(shù)大、傳代方便等優(yōu)勢，但是對攪拌和氣體的剪切力非常敏感，對反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)有較高的要求。無血清培養(yǎng)是通過用已知的人源或者動物源的蛋白或生長因子、激素來代替動物血清的一種培養(yǎng)方式，可減少后期純化工作的難度，提高產(chǎn)品質(zhì)量[7]。本研究對一株貼壁的PK15進(jìn)行了無血清的全懸浮馴化，以期為大規(guī)模培養(yǎng)豬圓環(huán)2型病毒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和毒株 PK15細(xì)胞(豬圓環(huán)病毒1型陰性、豬肺炎支原體陰性)由大北農(nóng)動物醫(yī)學(xué)研究中心保存。

1.1.2 主要試劑和耗材 DMEM-F12(12500-096)、0.25%胰蛋白酶(27250-018)、optiPROTM-sfm(12309019)購自Gibco公司，無血清懸浮培養(yǎng)基PK15-H(M20317)購自上海源培生物有限公司，新生牛血清(04-102-1A)購自BI公司，臺盼藍(lán)(T8154)購自美國Sigma公司，細(xì)胞方瓶、搖瓶、96孔板購自美國康寧公司。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱購自Thermo公司，軌道式振蕩器購自杭州奧盛儀器有限公司，倒置顯微鏡購自O(shè)lympus公司，Countstar細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購自上海睿鈺生物科技有限公司，SBA生物傳感器購自山東省科學(xué)院生物研究所，低速冷凍離心機(jī)購自美國Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 PK15細(xì)胞無血清全懸浮馴化

1.2.1.1 PK15貼壁細(xì)胞降血清 復(fù)蘇一支PK15細(xì)胞，用含8%新生牛血清(NBS)的DMEM-F12按照常規(guī)傳代方法傳代，在75 cm2方瓶中傳3代至細(xì)胞密度穩(wěn)定后，按初始密度0.25×106/mL分別接種至2個75 cm2方瓶中，其中一瓶用含有1/4體積的optiPROTM-sfm和3/4體積的加入8% NBS的DMEM-F12的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)，用于降血清；另外一瓶用全體積的加入8% NBS的DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，作對照細(xì)胞，培養(yǎng)體積均為30 mL。

表1 降血清方法和代次Tab 1 Method and Generation of reduced serum

1.2.1.2 PK15貼壁細(xì)胞低血清的懸浮馴化 細(xì)胞適應(yīng)低血清貼壁培養(yǎng)至密度穩(wěn)定3代后，消化后將細(xì)胞懸液離心去除胰酶，移至125 mL搖瓶中。培養(yǎng)體積根據(jù)初始密度一般在20～40 mL之間，初始密度1.0×106/mL，培養(yǎng)基比例由1/2optiPROTM-sfm和1/2 PK15-H過渡到1/3optiPROTM-sfm和2/3PK15-H再過渡到全PK15-H，血清含量為2%。傳代時間根據(jù)細(xì)胞密度決定，一般保證傳代前細(xì)胞密度大于2.0×106/mL，繼續(xù)消化連續(xù)傳代，至細(xì)胞密度穩(wěn)定。

1.2.1.3 PK15懸浮無血清的馴化 含2%NBS的全懸浮PK15細(xì)胞傳代時，成團(tuán)現(xiàn)象較為嚴(yán)重，需去除大團(tuán)并連續(xù)消化傳代。降血清由2%降到1%，再由1%降至0.5%，再降至無血清，降血清過程中細(xì)胞密度穩(wěn)定2～3代后方可進(jìn)行下一步傳代。傳代時間根據(jù)細(xì)胞密度而定，傳代前密度一般大于2.0×106/mL，傳代后初始密度一般在1.0×106/mL左右。

1.2.2 PK15-S增值的穩(wěn)定性 取馴化后細(xì)胞進(jìn)行初始密度為0.5×106/mL的連續(xù)傳代，每24 h取樣觀察計(jì)數(shù)，72 h開始傳代。細(xì)胞懸液離心后取上清液，按照SBA生物傳感器操作規(guī)程，10倍稀釋上清液后，測定糖和乳酸含量，并記錄。

1.2.3 細(xì)胞密度測定方法 采用臺盼藍(lán)(TB)染色法計(jì)算細(xì)胞密度，具體操作如下：先用無菌PBS稀釋臺盼藍(lán)，稀釋比例1∶1，再用稀釋過的臺盼藍(lán)稀釋細(xì)胞懸液，稀釋比例1∶1，最終稀釋后，吹打均勻，取40 μL加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，放入Countstar細(xì)胞計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)，一個樣品取3個視野，取平均值，即為細(xì)胞密度。

1.2.4 PK15-S倍增時間的測定 取馴化傳代穩(wěn)定的細(xì)胞，每天取樣計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞生長曲線，計(jì)算細(xì)胞倍增時間。取馴化傳代穩(wěn)定細(xì)胞峰值前一天的細(xì)胞計(jì)數(shù)(Y)、接種細(xì)胞數(shù)(X)及生長時間(T)計(jì)算細(xì)胞倍增時間Δt，計(jì)算公式如下：

Δt=T/AA=log2Y/X

2 結(jié)果與分析

2.1 無血清懸浮PK15細(xì)胞生長情況分析

2.1.1 PK15貼壁細(xì)胞降血清 逐步降血清與高血清對照最高密度的對比結(jié)果見表2。在含有9/10體積的optiPROTM-sfm和1/10體積的加入8% NBS的DMEM-F12的混合培養(yǎng)基時細(xì)胞密度也高于高血清密度，即0.8%血清量。當(dāng)全用optiPROTM-sfm養(yǎng)時，細(xì)胞密度低于高血清的密度，由此可初步將馴化前期血清量控制在1%～2%。

表2 PK15貼壁細(xì)胞降血清密度情況Tab 2 Reduction of serum density by PK15 adherent cells

48 h或72 h取樣為消化后體積，細(xì)胞懸液為10 mL；表格中DMEM-F12均加入8% NBS

2.1.2 PK15貼壁低血清的懸浮馴化 由于細(xì)胞直接由貼壁狀態(tài)轉(zhuǎn)至全懸浮狀態(tài)，細(xì)胞成團(tuán)現(xiàn)象較為嚴(yán)重，以致于每次傳代必須經(jīng)過消化才能傳代，傳代需經(jīng)過離心去上清、胰酶震蕩消化、離心去胰酶、培養(yǎng)基吹打均勻繼續(xù)培養(yǎng)4個步驟，密度情況見表3。團(tuán)塊較大時，可配制高濃度胰酶進(jìn)行消化，期間操作時間較長且步驟多，對細(xì)胞造成損傷較為嚴(yán)重并且易污染，前期細(xì)胞活率不是很高但可以接受，后期轉(zhuǎn)為正常。

表3 PK15貼壁低血清的懸浮馴化密度情況Tab 3 Suspension acclimation density of PK15 adherent low serum

細(xì)胞經(jīng)過9個代次，3種組合培養(yǎng)基的過渡傳代，細(xì)胞漲勢較好，但存在較大團(tuán)塊，消化后分散均勻(圖1)，且活率保持在95%以上，需進(jìn)一步降血清馴化。

圖1 PK15貼壁低血清的懸浮馴化細(xì)胞狀態(tài)Fig 1 Suspension domesticated cell state of PK15 adherent low serum

2.1.3 PK15懸浮無血清的馴化 血清的存在也是細(xì)胞成團(tuán)的主要因素之一，血清濃度由2%降到1%，再由1%降至0.5%，再降至無血清，細(xì)胞密度波動較為明顯，消化后計(jì)數(shù)，活率都能有95%以上，若細(xì)胞團(tuán)塊過大還仍用合適濃度的胰酶進(jìn)行消化后再計(jì)數(shù)，否則計(jì)數(shù)誤差會很大。

PK15懸浮細(xì)胞經(jīng)過9個代次的降血清實(shí)驗(yàn)(表4)，細(xì)胞在無血清條件下輪廓清晰，分散均勻，大小均一性良好(圖2)，密度穩(wěn)定。該株貼壁PK15細(xì)胞，從復(fù)蘇到最終馴化成全懸浮PK15-S細(xì)胞，經(jīng)過3種培養(yǎng)方法的過渡(表5)，共23次傳代(圖3、圖4)，細(xì)胞狀態(tài)良好，活率較高，可凍存保種。

表4 PK15懸浮無血清的馴化密度情況Tab 4 Domestication density of PK15 suspension without serum

圖2 PK15懸浮無血清的馴化細(xì)胞狀態(tài)Fig 2 State of domesticated cells in PK15 suspension without serum

培養(yǎng)方法血清含量傳代次數(shù)培養(yǎng)容器接種密度/mL培養(yǎng)時間細(xì)胞數(shù)量/mL細(xì)胞活率結(jié)團(tuán)情況低血清貼壁8%～2%5T750.25×10648h0.97×106/少量低血清懸浮2%9搖瓶1×10648h3.79×10696%多且大無血清懸浮2%～0%9搖瓶1×10648h3.89×10697%無

圖3 貼壁培養(yǎng)階段PK15細(xì)胞密度情況Fig 3 The density of PK15 cells in the adherent culture stage

圖4 懸浮培養(yǎng)階段PK15細(xì)胞密度及活率情況Fig 4 Density and survival rate of PK15 cells in suspension culture stage

2.2 PK15-S增值的穩(wěn)定性 為了驗(yàn)證該馴化細(xì)胞的穩(wěn)定性，本實(shí)驗(yàn)又將馴化后凍存細(xì)胞再次復(fù)蘇，并按初始密度0.5×106/mL連續(xù)傳11代，同時對糖和乳酸含量進(jìn)行檢測，結(jié)果見表6。

2.3 PK15-S倍增時間的測定 取馴化穩(wěn)定細(xì)胞，培養(yǎng)至144 h，每24 h取樣計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞生長曲線(圖5)；根據(jù)該曲線計(jì)算細(xì)胞倍增時間為22.7 h。

表6 PK15-S細(xì)胞生長情況Tab 6 PK15-S Cells growth situation

圖5 PK15-S細(xì)胞生長趨勢圖Fig 5 PK15-S cell growth trend graph

3 討論與結(jié)論

PK15細(xì)胞主要用于生產(chǎn)PCV2型和豬細(xì)小病毒，近年來，培養(yǎng)方式也逐漸由滾瓶系統(tǒng)提升為微載體系統(tǒng)，但目前仍有少部分生產(chǎn)廠家沿用滾瓶系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)，滾瓶培養(yǎng)的主要缺點(diǎn)是勞動強(qiáng)度大，比表面積小，占用空間大，培養(yǎng)條件難以檢測和控制[7]。通過生物反應(yīng)器運(yùn)用微載體系統(tǒng)進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)改進(jìn)了滾瓶培養(yǎng)模式的不足。張立等[8]運(yùn)用球轉(zhuǎn)球的方法成功將Vero細(xì)胞由5 L生物反應(yīng)器放大培養(yǎng)至50 L生物反應(yīng)器。但是，大部分微載體放大培養(yǎng)需要用胰酶進(jìn)行消化，消化后的細(xì)胞存在貼壁時間不同的現(xiàn)象，消化后的微載體與新加入的微載體表面存在差異，兩種因素均會造成細(xì)胞再次貼壁的不均勻，從而影響產(chǎn)毒結(jié)果；并且微載體存在價格昂貴，重復(fù)利用效果不好，貼壁條件苛刻，暴露環(huán)節(jié)多等劣勢。兩種培養(yǎng)方式均需要有牛血清的添加，增加成本的同時也給下游純化工作帶來一定的麻煩，所以馴化一株無血清全懸浮PK15細(xì)胞可以提升培養(yǎng)工藝，也使培養(yǎng)方法更簡單，操作性更高。

該株P(guān)K15細(xì)胞，從復(fù)蘇到最終馴化成全懸浮PK15-S細(xì)胞，經(jīng)過3種培養(yǎng)方法的馴化，共23個代次的傳代，細(xì)胞狀態(tài)良好，馴化過程中偶有接團(tuán)現(xiàn)象，細(xì)胞活率較高，最高密度可達(dá)4.0×106/mL左右，倍增時間在24 h左右。

馴化過程中，由于細(xì)胞生長方式的改變，細(xì)胞會以相互聚集即成團(tuán)的現(xiàn)象生長，消化傳代可以改善成團(tuán)問題，也可以添加一些除團(tuán)的組分來除團(tuán)。同一種病毒對同一細(xì)胞的不同克隆株的敏感性不同，同一細(xì)胞所處外環(huán)境不同，同一病毒的敏感性也會有所差異[9]，為了避免做無用功，定期的檢測細(xì)胞對毒的敏感性是很關(guān)鍵的。另外，在細(xì)胞馴化過程中及時的凍存細(xì)胞也是很重要的，因?yàn)轳Z化過程中操作步驟多，污染風(fēng)險(xiǎn)大，及時保種可以避免重復(fù)工作。

無血清全懸浮的培養(yǎng)工藝優(yōu)勢在于細(xì)胞密度大，操作方便，對于非CPE病毒可采用半連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)收獲病毒，提高了產(chǎn)量降低了成本，血清的去除減輕了下游工藝的工作壓力，但全懸浮細(xì)胞對培養(yǎng)基的成分和攪拌式生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)要求較高，對剪切力也非常敏感，常添加PF-68等表面活性劑來保護(hù)細(xì)胞達(dá)到所需密度，在今后的大規(guī)模生產(chǎn)中仍需對培養(yǎng)條件進(jìn)行更深入的研究。