犬細(xì)小病毒2c亞型毒株的分離與鑒定

鄧 永，孔冬妮，侯力丹，毛婭卿，王 嘉

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

犬細(xì)小病毒病是由犬細(xì)小病毒(Canineparvo-virus，CPV)引起的一種高度接觸性、烈性傳染病[1]。該病在臨床上以劇烈嘔吐、出血性腸炎及白細(xì)胞顯著減少為主要特征，分為出血性胃腸炎和急性心肌炎兩種類型[2]。前者主要侵害犬的腸上皮隱窩細(xì)胞，引起犬劇烈嘔吐及血樣下??；后者主要侵害犬心肌細(xì)胞，引起犬心率紊亂，突然死亡[3-4]。該病在世界范圍內(nèi)流行，是危害犬健康最嚴(yán)重的疾病之一，給養(yǎng)犬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，養(yǎng)犬的人數(shù)越來越多，犬細(xì)小病毒對犬的危害非常嚴(yán)重[5-7]。本實(shí)驗(yàn)采集了納米PCR檢測為陽性疑似感染犬細(xì)小病毒病犬的糞便，并在F81細(xì)胞上增殖培養(yǎng)，將分離的病毒通過納米PCR試驗(yàn)檢測、血凝試驗(yàn)、免疫過氧化物酶單層細(xì)胞染色(IPMA)試驗(yàn)和基因測序分析，確定其株型[8-10]，為監(jiān)測CPV的變異狀況和流行趨勢提供依據(jù)，對其進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測將為是否需要更新當(dāng)前可用的疫苗和檢測方法提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 細(xì)胞、病料和載體 貓腎細(xì)胞(F81)由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所病毒制品檢測實(shí)驗(yàn)室保存；病料采集于廣西大學(xué)動物醫(yī)院臨床糞便；pMD-18T克隆載體(批號K8201AB)購自于TaKaRa公司。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)液(批號8118126)購自GIBCO公司、MEM培養(yǎng)液(批號AC10447375)購自Hyclone公司、胎牛血清(批號ST170802)購自PAN SERATECH；注射用青霉素鈉(批號180508)購自山東魯抗公司、注射用硫酸鏈霉素(批號20180201)購自華北制藥公司；DL2000 DNA Marker(批號746087AH)購自博邁德公司 and Pluss Marker(批號AHF1915A)購自TaKaRa公司、Taq DNA聚合酶(批號745661AH)購自博邁德公司；DNA提取試劑盒(批號03718KC5)購自AXYGEN公司；膠回收試劑盒(批號R6620)購自AXYGEN公司；納米PCR試劑盒(批號NPK01)購自山東大正生物有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒(批號Q6020)購自TIANGEN公司。

1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(THERMO公司)、熒光顯微鏡(OLYMPUS公司)、PCR儀(美國BIO-RAD公司)、小型高速冷凍離心機(jī)(HIMAC公司)、高速冷凍離心機(jī)(PROTEINSIPMLE公司)、紫外凝膠成像系統(tǒng)(TANON2500)(上海天能科技有限公司)、電子天平(METTLER TOLEDO PL203-IC)、低溫臺式高速離心機(jī)(Biofugo primo R)(美國THERMO公司)、Milli-Q純水儀(美國MILLIPORE公司)、移液槍(美國EPPENDORF公司)、96 孔V型血凝板、微型血凝振蕩(上海生物工程公司)、普通光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS公司)等。

2 方 法

2.1 臨床樣品處理 采用納米PCR檢測為陽性疑似感染犬細(xì)小病毒的糞便作為樣品，將糞便放入EP管中，用PBS將其重旋，并加入1%青、鏈霉素。15000 r/min離心15 min，將上清用0.22 μm濾膜過濾除菌后作為分離病毒樣品，-80 ℃保存。

2.2 病毒的分離與增殖 將病料用適量PBS重懸，然后15000 r/min離心15 min，用移液器吸取上清，用0.22 μm濾器無菌過濾，同步接種于新消化的F81細(xì)胞中，加入含5% FBS(胎牛血清)的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，加入1% 青、鏈霉素雙抗，然后放入37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，同時設(shè)正常細(xì)胞對照。每天觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞病變(CPE)情況。盲傳3代無CPE則棄去，產(chǎn)生CPE的細(xì)胞再連續(xù)傳3代，當(dāng)出現(xiàn)90%的CPE時，收獲病毒。

2.3 樣品PCR的測定

2.3.1 引物設(shè)計(jì)及合成 參照GenBank 中發(fā)表的CPV-2(登錄號：AB054222)基因組序列的分析，應(yīng)用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增CPV VP2基因的全長序列引物，經(jīng)過VP2基因全長序列比對后篩選出保守區(qū)域并設(shè)計(jì)能擴(kuò)增出574 bp目的條帶的引物[11-12]。引物由華大基因公司合成(表1)。

表1 CPV VP2基因保守序列PCR擴(kuò)增引物Tab 1 The primers of CPV VP2 gene conservative sequence PCR amplification

2.3.2 樣品DNA提取 樣品及病毒分離后細(xì)胞培養(yǎng)物 DNA的提取使用AXYGEN公司的 DNA 提取試劑盒進(jìn)行，具體操作按照使用說明書進(jìn)行。

2.3.3 PCR的擴(kuò)增 以提取的DNA為模板，應(yīng)用引物 VP2-F和VP2-R來擴(kuò)增目的片段，大小為574 bp，用已經(jīng)優(yōu)化好條件的納米PCR進(jìn)行擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物 5 μL與6× Loading buffer加樣緩沖液混勻，在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，電壓為120 V，30 min后，于凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)觀察結(jié)果，并照相。

2.3.4 血凝實(shí)驗(yàn) 按常規(guī)微量 HA操作方法在96孔 “V”型微量板上進(jìn)行。將待檢病毒液于 96孔微量血凝板中倍比稀釋后加入等量1%豬紅細(xì)胞懸液，4 ℃靜置1 h后判定結(jié)果。

2.3.5 免疫過氧化物酶單層細(xì)胞染色法(IPMA)鑒定 取1 mL經(jīng)過離心的病料上清，經(jīng)過0.22 μL濾器同步接種于F81細(xì)胞，加入足量的含5%胎牛血清的MEM，于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)48 h，用PBS(200 μL/孔)洗3次，電吹風(fēng)吹干，直到孔邊緣出現(xiàn)白色圈為宜。每孔加入100 μL 33%丙酮-PBS，室溫放置30 min。棄固定液，用電吹風(fēng)吹干。進(jìn)行IPMA試驗(yàn)，具體操作步驟如下：每孔加入200 μL洗滌液，置室溫漂洗一次，輕輕甩出洗液，吸水紙上輕叩。用樣品稀釋液將待檢樣品、陰性血清對照品和陽性血清對照品作1∶100倍稀釋。取上述稀釋血清樣品分別加入到對應(yīng)孔，每孔100 μL，于37 ℃溫箱中孵育1 h。再次洗板后，每孔加入100 μL稀釋的HRP-SPA辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，將反應(yīng)板放入盒中，于37 ℃溫箱中放置30 min。再次洗板。每孔加入100 μL底物顯色液，避光，于37 ℃溫箱中反應(yīng)15 min。棄去反應(yīng)液，每孔加入200 μL蒸餾水洗板一次，每孔加入100 μL ddH2O觀察結(jié)果。在顯微鏡下觀察各孔顯色情況，進(jìn)行樣品結(jié)果判定。在CPV陽性血清下，若有病毒感染的細(xì)胞染色后細(xì)胞質(zhì)內(nèi)或細(xì)胞核周圍呈棕紅色判定為陽性，若無病毒感染細(xì)胞核無著色反應(yīng)判定為陰性。

2.3.6 VP2基因PCR擴(kuò)增與序列分析 在NCBI網(wǎng)站上下載幾個CPV的VP2序列，使用DNAMAN軟件進(jìn)行比對。根據(jù)比對結(jié)果，選擇CPV的VP2基因的保守區(qū)域使用Primer6.0軟件設(shè)計(jì)一對覆蓋犬細(xì)小病毒VP2基因全長的引物P1、P2(表2)，通過PCR擴(kuò)增獲得VP2全長基因(表3)。所使用的引物為上海生工生物公司合成，擴(kuò)增片段長度為1755 bp。按文獻(xiàn)[13]方法提取待檢樣品、陰性對照與標(biāo)準(zhǔn)CPV的DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖電泳凝膠觀察。用AXYGEN公司的凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。將回收的目的基因片段與pMD18-T載體16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化E．coliJM109，經(jīng)酶切鑒定和質(zhì)粒PCR鑒定后，將陽性克隆送上海生工生物公司測序。

表2 CPV VP2全長基因PCR擴(kuò)增引物Tab 2 The primers of CPV VP2 gene PCR amplification

表3 PCR擴(kuò)增參數(shù)Tab 3 PCR amplification parameters

2.3.7 序列測定及分析 將鑒定后的陽性菌液送去測序，測序結(jié)果用 DNAMAN 軟件對獲得的VP2基因序列進(jìn)行拼接，并與NCBI上已經(jīng)公布的犬細(xì)小病毒的全基因組序列以及相關(guān)蛋白的核酸序列進(jìn)行比較，確定其所分離的病毒株型并推導(dǎo)氨基酸序列。

3 結(jié)果與分析

3.1 病毒在F81細(xì)胞上的分離與增殖結(jié)果 病料上清接種于F81細(xì)胞后培養(yǎng)5 d，接種的細(xì)胞明顯出現(xiàn)拉長，變圓，脫落狀態(tài)，呈現(xiàn)明顯的CPE，未接種的細(xì)胞狀態(tài)正常(圖1)。反復(fù)凍融并繼續(xù)傳代，仍然出現(xiàn)同樣的CPE，將出現(xiàn)CPE的樣品命名為CPV-Guangxi23。

3.2 目的基因的擴(kuò)增結(jié)果 將PCR擴(kuò)增的目的基因以1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示在574 bp處可見目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符合，表明成功擴(kuò)增出VP2保守序列(圖2)。

3.3 紅細(xì)胞血凝檢測結(jié)果 采用微量血凝試驗(yàn)檢測分離上清對豬紅細(xì)胞的凝集作用，結(jié)果顯示病毒在4 ℃條件下能夠凝集豬紅細(xì)胞，與己知CPV血凝譜相符(圖3)。該上清液血凝效價可達(dá)214。

A:CPV感染的F81細(xì)胞；B:正常細(xì)胞A:F81 cells infected with CPV (×100)；B:control F81 cells (×100)圖1 感染CPV的F81細(xì)胞和健康F81細(xì)胞Fig 1 Healthy F81 cell and F81 cell infected with CPV

M：DL2000 DNA Marker；1、2：樣品PCR產(chǎn)物；3：陰性對照M：DL2000 DNA Marker；1、2：PCR production of sample；3：Negative control圖2 CPV-VP2基因保守序列的PCR產(chǎn)物Fig 2 PCR production of CPV-VP2 gene conservative sequence from samples

3.4 免疫過氧化物酶單層細(xì)胞染色法(IPMA)鑒定結(jié)果 將病毒液同步接種F81細(xì)胞培養(yǎng)48 h后用33%丙酮固定，然后用CPV陽性血清和陰性血清，按1∶100稀釋，按照IPMA操作方法進(jìn)行，結(jié)果顯示接種病毒F81細(xì)胞能與陽性血清反應(yīng)，細(xì)胞核周圍呈棕紅色染色；接種病毒F81細(xì)胞不能與陰性血清反應(yīng)，呈現(xiàn)細(xì)胞正常顏色，未接種病毒的F81細(xì)胞也不能與陽性血清反應(yīng)，呈現(xiàn)正常細(xì)胞顏色，結(jié)果與預(yù)期相符(圖4)。

3.5 測序結(jié)果 圖5顯示，Guangxi23樣品細(xì)小病毒序列中編碼VP2蛋白426位氨基酸的密碼子為GAA，編碼Glu，表明這份樣品中的細(xì)小病毒為CPV-2c型，命名為CPV-2c-Guangxi23。

1-23列：病毒液依次按2倍倍比稀釋；24列：紅細(xì)胞對照Line1-23:serial two-fold dilutions of the virus;Line24:RBC control圖3 病毒血凝特性檢測結(jié)果Fig 3 The result of hemagglutination

A:陰性血清；B:陽性血清；C:陽性血清 A:Rabbit negative serum；B:Rabbit positive serum；C:positive serum圖4 F81細(xì)胞接種CPV病毒48 h后IPMA結(jié)果(×100)Fig 4 IPMA results detected 48 h after inoculation of CPV in F81 cells (×100)using different sera

CPV-Guangxi23編碼426位氨基酸的密碼子為GAA，而CPV-2a編碼426位氨基酸的密碼子為AAT,CPV-2b編碼426位氨基酸的密碼子為GATThe codon for AA at position 426 of VP2 of CPV-Guangxi23 is GAA,while AAT for CPV-2a and GAT for CPV-2b圖5 CPV-Guangxi23樣品測序彩圖Fig 5 The sequencing result of CPV-Guangxi23

3.6 序列分析 使用 DNAMAN軟件進(jìn)行分析比對，結(jié)果顯示Guangxi23樣品與CPV-2c型同源性都在99%以上。從所測的VP2基因氨基酸序列推導(dǎo)序列變異位點(diǎn)，CPV-Guangxi23在VP2蛋白426位氨基酸為Glu，蛋白序列比對結(jié)果表明細(xì)小病毒為CPV-2c型，并存在267(F)→267(Y)、324(Y)→324(I)2個位點(diǎn)突變，如表4所示。

表4 CPV-Guangxi23 VP2 與參考株VP2 蛋白序列關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸比較Tab 4 The comparison of the amino acids at critical sites within VP2 protein of CPV-Guangxi23 and the reference strains.Accession number of reference

*strains:CPV-b (M38245),CPV-GZ(JX120178),CPV-431(AY742951),CPV-M52 (KC196087)

4 討論與結(jié)論

本研究從疑似犬細(xì)小病毒感染的犬糞便中分離出一株病毒，后經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)、病毒形態(tài)學(xué)鑒定、血凝試驗(yàn)、免疫過氧化物酶單層細(xì)胞染色法以及納米PCR擴(kuò)增試驗(yàn)和VP2基因分析等多種方法鑒定[14]，確定分離的病毒為犬細(xì)小病毒，該毒株屬CPV-2c型，并命名為CPV-2c-Guangxi23。

為了區(qū)別于1967年由Binn等人從健康犬糞便中分離到的犬極細(xì)小病毒(Minute virus of canine，MVC)(習(xí)慣上被叫做CPV-1)而將后來發(fā)現(xiàn)的病毒命名為犬細(xì)小病毒2型(CPV-2)[16]。迄今為止，CPV只有一個抗原型，即CPV-2，但不同毒株間抗原性有所差異，已出現(xiàn)了多個亞型，即CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c (a)和CPV-2c (b)。CPV-2型出現(xiàn)后很快在世界廣泛傳播，該病毒可能由貓的白血病病毒變異而來，通過野生的犬科動物如貂和狐貍，適應(yīng)了新的宿主犬，連續(xù)傳播幾年后，CPV已經(jīng)發(fā)生抗原漂移，在抗原性、宿主范圍和血凝性上都發(fā)生了變化，Mara B等研究證實(shí)CPV-2與RNA病毒相似，表現(xiàn)有高的遺傳異質(zhì)性。Parrish等報(bào)道，1978-1980年分離的毒株是CPV-2型，1980年后分離的毒株又是另一個型，Parrish等提出將新的毒株命名為CPV-2a，以表明是CPV-2的亞型，能感染犬和貓。很快，最初的CPV-2被CPV-2a完全替代。較CPV-2而言，CPV-2a 在VP2外膜蛋白上有5個氨基酸的改變，已證明這些氨基酸代表了抗原和宿主范圍的病毒特性。1984年，出現(xiàn)了另一種新的抗原變異株，命名為CPV-2b，一般和CPV-2a混合感染，兩者不同之處在CPV-2b衣殼的主要抗原位點(diǎn)有1個氨基酸(Asn426Asp)替換。隨后應(yīng)用單克隆抗體發(fā)現(xiàn)，Asn/Asp426 Glu 替代引起抗原的改變。因此，有的研究者將Glu-426變異株作為一個新的型，命名為CPV-2c[15]。

研究表明 VP2基因是CPV的特異性基因，為其最主要的毒力基因，也是 CPV最易變異的集中區(qū)段，尤其是CPV 基因型分型依據(jù)就是位于VP2 蛋白的第426aa。為進(jìn)一步驗(yàn)證該分離株，本實(shí)驗(yàn)又對該病毒株的VP2基因進(jìn)行了克隆和分析。結(jié)果顯示從病料樣品和細(xì)胞培養(yǎng)物中均能夠擴(kuò)增出大小約為 l755bp的基因片段，測序后進(jìn)行同源性比較顯示該基因與CPV VP2的同源性可達(dá) 99%以上，從分子水平上證明了該分離株為CPV。進(jìn)一步對 VP2基因?qū)?yīng)的氨基酸序列分析表明，該病毒株 426aa為Glu，符合CPV-2c型的特征[17]，而且該病毒株在一些其他位點(diǎn)也發(fā)生了變異，在267(F)→267(Y)、324(Y)→324(I)2個位點(diǎn)發(fā)生突變，從而可能會影響該分離株的感染譜或毒力。

犬細(xì)小病毒隨時在變異，可能再經(jīng)過幾年，又會有新的病毒株型出現(xiàn)。我國主要以CPV-2a株流行[18]，在2010年之前，國內(nèi)沒有CPV-2c出現(xiàn)，最近幾年開始陸續(xù)報(bào)道我國有CPV-2c的出現(xiàn)，這說明犬細(xì)小病毒的傳播速度很快，具有跨區(qū)域傳播的能力。本研究從犬的糞便中，成功分離到一株CPV-2c型病毒，在VP2蛋白426位氨基酸為Glu，血凝價為214，病毒的增殖能力較強(qiáng)，病毒液中所含病毒的量較高，氨基酸推導(dǎo)序列分析發(fā)現(xiàn)存在267(F)→267(Y)、324(Y)→324(I)2個位點(diǎn)突變，說明細(xì)小病毒在不斷進(jìn)化，應(yīng)隨時監(jiān)測犬細(xì)小病毒變異情況，如若出現(xiàn)新的株型，就可以快速更新疫苗，從而對犬起到保護(hù)作用。