國家標(biāo)準(zhǔn)方法測定水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量檢測方法的改進(jìn)

宋 瑞，李 云，趙義良，田 梅，王志恒，何立寧

(石家莊市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心，石家莊 050041)

硝基呋喃類藥物對大多數(shù)革蘭氏陽性菌和陰性菌、真菌、原蟲等病原體有很好殺滅作用，是一種廣譜抗生素。硝基呋喃類藥物常用的是以下4種:呋喃它酮、呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因。此4種藥物使用后在生物體內(nèi)代謝迅速，其代謝產(chǎn)物分別為AMOZ、AOZ、SEM、AHD。因價(jià)格低且療效好，硝基呋喃類藥物廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。但是，硝基呋喃類藥物及其代謝物對人體有致癌、致畸胎副作用。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已發(fā)布公告在飼養(yǎng)過程中禁止使用硝基呋喃類藥物[1]，且在動(dòng)物性食品中不得檢出硝基呋喃類藥物代謝物。農(nóng)業(yè)部783-1-2006號(hào)公告[2]實(shí)現(xiàn)了水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的檢測工作從無方法、無標(biāo)準(zhǔn)到有國家檢測方法的革新，并且能夠指導(dǎo)基層工作者進(jìn)行這項(xiàng)檢測工作。其原理是將樣品肌肉組織殘留的硝基呋喃類代謝物在酸性條件下水解衍生化，經(jīng)液液萃取后，氮?dú)獯蹈?、甲醇溶液溶解，?nèi)標(biāo)法定量。由于其中部分檢測過程不完善，會(huì)產(chǎn)生水解衍生化不徹底，液液萃取離心后，分層明顯，保留層較渾濁。氮?dú)獯蹈珊?，由于有油脂存在，渦旋離心后會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重乳化現(xiàn)象，使得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性不理想。通過改變衍生化環(huán)境、調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)速以及定容后渦旋轉(zhuǎn)速，較好的解決了上述問題，獲得較好的標(biāo)準(zhǔn)曲線。做2.5 ng/g陽性添加后，回收率可以達(dá)到95%以上。檢測的靈敏度可達(dá)0.1 ng/g。方法改進(jìn)后提升了準(zhǔn)確度、精密度、靈敏度。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 AB SCIEX 5500超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀；ZORBAX SB C18(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)色譜柱；甲醇為色譜純；鹽酸為優(yōu)級(jí)純；磷酸氫二鉀為分析純；2-硝基苯甲醛(購自德國CNW公司)；標(biāo)準(zhǔn)品AMOZ(WITEGA公司，純度99.9%，批號(hào)C010MGNF003)、AOZ(WITEGA公司，純度99.1%，批號(hào)C010MGNF005)、SEM(Dr.公司，純度99.8%，批號(hào)G151417)、AHD(Dr.公司，純度99.3%，批號(hào)G138075)；同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品AHD-13C3(WITEGA公司，純度99.1%，批號(hào)957509-21-8)、AOZ-D4(WITEGA公司，純度99.2%，批號(hào)1188331-23-8)、AMOZ-D5(WITEGA公司，純度99.6%，批號(hào)1017793-94-0)、SCA-HCI-13C,15N2(WITEGA公司，純度99.8%，批號(hào)1173020-16-0)。

1.2 試劑配制 5 mmol乙酸銨溶液0.385 g醋酸銨定溶于1000 mL水中,冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至4.5；5%甲醇溶液：甲醇+水=5+95(V/V)；0.2 mol/L鹽酸溶液：濃鹽酸1.6 mL，用水稀釋至100 mL；0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液：稱取0.0378 g 2-硝基苯甲醛，溶于5 mL 二甲亞砜中，現(xiàn)用現(xiàn)配；1 mol/L磷酸氫二鉀溶液：三水磷酸氫二鉀114.11 g，溶于500 mL水中[3]。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜條件 流動(dòng)相：A相(5 mmol乙酸銨溶液，pH=4.5)+B相(0.1%甲酸乙腈)，流速：0.30 mL/min[4]，梯度如表1所示。

表1 流動(dòng)相梯度Tab 1 Flow phase gradient

1.3.2 質(zhì)譜條件 離子源：ESI源，正離子模式；IS電壓：5500 V；氣簾氣CUR：20 psi；霧化氣GSI：50 psi；輔助氣GS2：60 psi；源溫度TEM：550 ℃；碰撞氣CAD：9 psi，4種硝基呋喃代謝物及其內(nèi)標(biāo)的定性、定量離子對、同位素化合物碎裂電壓、碰撞能量如表2、表3所示。

表2 4種硝基呋喃代謝物的定性、定量離子對、同位素化合物碎裂電壓、碰撞能量Tab 2 Qualitative and quantitative ion pairs, fracture voltage and collision energy of 4 nitrofuran metabolites

表3 4種硝基呋喃代謝物內(nèi)標(biāo)的定性、定量離子對、同位素化合物碎裂電壓、碰撞能量Tab 3 Qualitative and quantitative ion pairs,fracture voltage and collision energy of 4 nitrofuran metabolites

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制 分別準(zhǔn)確移取10 ng/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0.025、0.05、0.10 mL和100 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0.025、0.05、0.10 mL于50 mL離心管中，除不加樣品外，按提取與凈化步驟進(jìn)行操作[5]。

1.4.2 樣品制備、提取與凈化 試樣制備，檢測樣品為市場監(jiān)督抽檢鯉魚一尾(被抽樣單位佳農(nóng)市場，產(chǎn)地行唐縣)，去鱗、去皮，切下脊背肉。磨碎[6]，勻漿，作為檢測試樣，同時(shí)也當(dāng)空白試樣，多稱取2份樣品，加入適宜的標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為陽性添加試樣[7]。

稱取試樣2.0 g，置于50 mL的離心管中，加入50 μL(100 ng/mL的混合內(nèi)標(biāo)工作液)。渦旋混合[8]50 s，加入5 mL鹽酸溶液和0.15 mL 2-硝基苯甲醛溶液，渦旋50 s，37度恒溫振蕩16 h。取出離心管后放置至室溫[9]，加入4 mL濃度為1 mol/L的磷酸氫二鉀溶液，調(diào)節(jié)pH=7.0～7.5，(此處pH都在范圍內(nèi)，不用調(diào))，加入4 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩50 s，10000 r/min離心5 min。取上清液轉(zhuǎn)移至另一15 mL離心管中[10](分4層，取最上層)；再加入4 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩50 s，10000 r/min離心5 min，合并有機(jī)相，40 ℃下氮?dú)獯蹈?。?zhǔn)確加入1 mL甲醇溶液[11]，使用IKA渦旋混合儀，渦旋速度低于500 r/min,15 s,取上清液過0.22 μm濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生化過程 783號(hào)公告酸性環(huán)境用0.6 mL濃鹽酸加入100 mL水中，再加入2-硝基苯甲醛。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)衍生化效果并不好，回收率較低，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性不好。主要原因是濃鹽酸量較少。濃鹽酸使用量增大至1.6 mL[13]，回收率有明顯的提升。由圖1可見提升濃鹽酸濃度后，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性得到明顯改善。衍生化后的pH值經(jīng)比對，783號(hào)公告pH=1.18±0.02，方法改進(jìn)后pH=0.95±0.02。

783號(hào)公告:0.6 mL濃鹽酸加入100 mL水中，衍生化回收率的重復(fù)性不好，造成標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性不太好，結(jié)果如圖2～圖4所示。

圖1 AOZ定量離子標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.05530 x(r=0.96985)Fig 1 AOZ Quantitative Ion Standard Curvey=0.05530 x(r=0.96985)

圖2 AHD定量離子標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.04788 x (r=0.98370)Fig 2 AHD Quantitative Ion Standard Curvey=0.04788 x (r=0.98370)

圖3 SEM定量離子標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.05071 x (r=0.97434)Fig 3 SEM Quantitative Ion Standard Curvey=0.05071 x (r=0.97434)

圖4 AMOZ定量離子標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.05995 x (r=0.16883)Fig 4 AMOZ Quantitative Ion Standard Curvey=0.05995 x (r=0.16883)

方法改進(jìn)后，1.6 mL濃鹽酸加入100 mL水中衍生化回收率的重復(fù)性明顯改善，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性很好，結(jié)果如圖5～圖8所示。

圖6 AHD定量離子標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.17715 x (r=0.99977)Fig 6 AHD Quantitative Ion Standard Curvey=0.17715 x (r=0.99977)

圖7 SEM定量離子標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.28517 x (r=0.99989)Fig 7 SEM Quantitative Ion Standard Curvey=0.28517 x (r=0.99989)

圖8 AMOZ定量離子標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.18027 x (r=0.99995)Fig 8 AMOZ Quantitative Ion Standard Curvey=0.18027 x (r=0.99995)

2.2 提取過程 磷酸氫二鉀溶液，783號(hào)公告為87.1g磷酸氫二鉀溶于500 mL水中。通常所用的磷酸氫二鉀為三水化合物，折完水應(yīng)為114.11 g[14]。

2.3 離心過程 783號(hào)公告顯示離心轉(zhuǎn)速為4000 r/min，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)此轉(zhuǎn)速離心后，上層液較渾濁，將轉(zhuǎn)速提升至10000 r/min時(shí)，可以很好的分層，上清液較澄明(圖9、圖10)。

圖9 離心轉(zhuǎn)速為4000 r/min上層液體Fig 9 Centrifugal speed 4000 r/min upper liquid

圖10 離心轉(zhuǎn)速為10000 r/min上層液體Fig 10 Centrifugal speed 4000 r/min upper liquid

2.4 定容過程 氮?dú)獯蹈梢宜嵋阴ズ螅?83號(hào)公告使用甲醇溶液溶解，渦旋振蕩殘留物，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)由于油脂的存在，渦旋振蕩殘留物會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的乳化現(xiàn)象。氮?dú)獯蹈珊蠹尤? mL正己烷除酯[15]，再加入甲醇溶液，渦旋10000 r/min離心10 min，離心后發(fā)現(xiàn)正己烷與甲醇溶液仍然發(fā)生乳化現(xiàn)象。氮?dú)獯蹈梢宜嵋阴ズ骩16]，使用甲醇溶液溶解將渦旋速度限定在500 r/min以下，15 s,短時(shí)間緩慢渦動(dòng),不僅能很好的溶解殘留物，同時(shí)避免油脂乳化。經(jīng)檢測并不影響回收率。

2.5 檢測方法改進(jìn)后回收率情況 由于783號(hào)公告所得標(biāo)準(zhǔn)曲線上的點(diǎn)分布較亂，改進(jìn)后的方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較好，可作為回收率計(jì)算的基礎(chǔ)。通過如上衍生化過程、提取過程、離心過程、定容過程的改進(jìn)，平行樣品的陽性添加濃度為2.5 ng/g，稱取2 g，上儀器濃度應(yīng)為5 ng/mL。4種硝基呋喃代謝物的回收率在95%以上，標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，回收率有明顯的提升(圖11～圖15)。

圖11 空白樣品圖譜Fig 11 Map of blank samples

圖12 AOZ陽性添加樣品圖譜Fig 12 Map of AOZ positive samples added

圖13 AHD陽性添加樣品圖譜Fig 13 Map of AHD positive samples added

圖14 SEM陽性添加樣品圖譜Fig 14 Map of SEM positive samples added

圖15 AMOZ陽性添加樣品圖譜Fig 15 Map of AMOZ positive samples added

2.6 檢測的靈敏度 國家標(biāo)準(zhǔn)783-1-2006號(hào)公告中檢測限為0.25 ng/g，使用改進(jìn)后的方法，最低檢出限可以達(dá)到0.1 ng/g。在空白的鯉魚樣品中加入適量標(biāo)準(zhǔn)溶液使之含有0.1 ng/g的4種硝基呋喃代謝物，稱取2 g，上儀器濃度應(yīng)為0.2 ng/mL。按照改進(jìn)后的前處理方法進(jìn)行前處理，可以得到信噪比大于3，回收率在80%～120%之間，標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%的檢測結(jié)果(圖16～圖20)。

圖16 空白樣品圖譜Fig 16 Map of blank samples

圖17 0.1 ng/g AOZ添加樣品圖譜Fig 17 0.1 ng/g AOZ Add sample map

圖18 0.1 ng/g AHD添加樣品圖譜Fig 18 0.1 ng/g AHD Add sample map

圖19 0.1 ng/g SEM添加樣品圖譜Fig 19 0.1 ng/g SEM Add sample map

圖20 0.1 ng/g AMOZ添加樣品圖譜Fig 20 0.1 ng/g AMOZ Add sample map

3 討論與結(jié)論

農(nóng)業(yè)部783-1-2006號(hào)公告，實(shí)現(xiàn)了水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的檢測工作從無方法、無標(biāo)準(zhǔn)到有國家檢測方法的革新，并且能夠指導(dǎo)基層工作者進(jìn)行這項(xiàng)檢測工作。雖然本方法有很好的實(shí)用性，但在工作中也發(fā)現(xiàn)本方法存在回收率不高、重復(fù)性不好、基質(zhì)效應(yīng)較大等缺點(diǎn)。因此，在實(shí)際工作中通過不斷對本方法進(jìn)行研究與摸索，進(jìn)一步對本方法進(jìn)行了優(yōu)化和改進(jìn)，通過對以上論述整理與總結(jié)，本研究總共從以下幾個(gè)方面對農(nóng)業(yè)部783-1-2006號(hào)公告進(jìn)行了優(yōu)化：(1)進(jìn)一步優(yōu)化了水解衍生化酸性條件，加大了酸的濃度，提升了衍生化效率，提高了回收率，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性得到明顯改善；(2)根據(jù)提取過程實(shí)際市售磷酸氫二鉀為三水化合物的情況，改進(jìn)磷酸氫二鉀的使用量，使得磷酸氫二鉀的用量更加準(zhǔn)確；(3)離心過程提升離心速度，使得上層液體更加澄清，分離效果更好；(4)本方法定容過程中限制甲醇溶液渦旋溶解速度，減輕乳化現(xiàn)象，使得前處理過程的凈化效果更好，降低了儀器的基質(zhì)效應(yīng)。有的方法是進(jìn)一步用正己烷除脂，然后高速離心，但是這樣做也會(huì)造成乳化現(xiàn)象，導(dǎo)致分層不明顯，進(jìn)而導(dǎo)致回收率降低，因此，兩相比較，本方法的凈化效果和回收率更好；(5)做2.5 ng/g陽性添加后，回收率可以達(dá)到95%以上，提高了方法的回收率；(6)檢測的靈敏度可達(dá)0.1 ng/g。將改進(jìn)方法用于實(shí)際樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品的測定，提升了方法的準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度。綜上所述，通過對國家標(biāo)準(zhǔn)783-1-2006號(hào)公告的進(jìn)一步優(yōu)化，大大提高了方法的實(shí)際應(yīng)用效果，對于更好的做好硝基呋喃類藥物及其代謝物的殘留檢測工作具有很好的現(xiàn)實(shí)意義。