耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)GK大鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和胰島素信號(hào)通路的影響

戈哲 孫易 漆正堂 丁樹哲

1華東師范大學(xué)青少年健康評(píng)價(jià)與運(yùn)動(dòng)干預(yù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（上海200241）

2華東師范大學(xué)體育與健康學(xué)院（上海200241）

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)環(huán)境發(fā)生變化，例如缺氧、化學(xué)毒物等多種因素抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工的糖基化或者導(dǎo)致蛋白質(zhì)二硫鍵的錯(cuò)配，從而導(dǎo)致未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的積累從而引發(fā)下游一系列信號(hào)通路的過程。1988年，Kozutsumi等提出了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激存在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所引發(fā)的未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）信號(hào)通路通過各種途徑對(duì)胰島素信號(hào)通路存在一定的影響，例如肌醇需求激酶1（inositol-requiring enzyme-1，IRE1）的激活導(dǎo)致下游c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）磷酸化，JNK磷酸化再導(dǎo)致下游胰島素受體底物1（insulin receptor substrate 1，IRS-1）異位點(diǎn)的磷酸化，進(jìn)而誘發(fā)胰島素抵抗。體外實(shí)驗(yàn)表明，ER應(yīng)激可引起肝臟、肌肉和脂肪等外周組織的胰島素抵抗[2]。IRS-1的正常磷酸化位點(diǎn)是酪氨酸，IRS-1特定的絲氨酸位點(diǎn)磷酸化則會(huì)抑制胰島素信號(hào)通路[3]。肝臟是人體胰島素作用的主要器官之一，在正常生理狀態(tài)下，胰島素通過與肝臟胰島素受體結(jié)合從而攝取血液中的葡萄糖進(jìn)而加強(qiáng)肝糖原的合成來維持體內(nèi)糖代謝的穩(wěn)定。然而，在胰島素抵抗的狀態(tài)下，肝臟攝取葡萄糖的能力下降[4]。Ozcan等[5]利用衣霉素誘導(dǎo)肝細(xì)胞ER應(yīng)激，發(fā)現(xiàn)胰島素刺激的Akt磷酸化和IRS-1酪氨酸磷酸化受到抑制，同時(shí)IRS-1絲氨酸磷酸化增強(qiáng)。有研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增強(qiáng)和JNK通路的激活干擾了胰島素信號(hào)通路，造成了胰島素抵抗[6]。Jiro等[7]研究發(fā)現(xiàn)與正常小鼠對(duì)比，JNK1敲除小鼠肝臟中IRS-1酪氨酸磷酸化增強(qiáng)，胰島素受體功能恢復(fù)。這也提示了JNK1是誘發(fā)IRS-1異位點(diǎn)磷酸化的關(guān)鍵。IRE1-JNK通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引發(fā)胰島素抵抗的經(jīng)典信號(hào)通路，而目前眾多研究表明長期的耐力運(yùn)動(dòng)能夠緩解2型糖尿病的癥狀，降低體內(nèi)血糖水平，提高胰島素受體敏感性。為探索運(yùn)動(dòng)是否通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路來影響2型糖尿病的發(fā)展，本研究以GK大鼠為2型糖尿病模型，聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1-JNK信號(hào)通路的視角探索肝臟胰島素抵抗的機(jī)制，以期為2型糖尿病的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性12周齡GK大鼠（Goto Kakiski Wistar rats，自發(fā)2型糖尿病動(dòng)物模型）和Wistar大鼠，均由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)大鼠自由飲食、飲水，1～2天更換一次墊料。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20℃～24℃，相對(duì)濕度維持在50%～70%，自然光照，正常室內(nèi)通風(fēng)。

1.2 GKGK大鼠糖尿病模型的確定

對(duì)購買的大鼠立即進(jìn)行空腹血糖測(cè)定，確定GK大鼠糖尿病模型的建立成功。見表1。

表1 Wistar大鼠與GK大鼠運(yùn)動(dòng)干預(yù)前空腹血糖的測(cè)定（mmol/L）

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組與運(yùn)動(dòng)方案

GK 大鼠16只，隨機(jī)分為糖尿病組（D組）和糖尿病運(yùn)動(dòng)組（DE組），每組8只。對(duì)照Wistar雄性大鼠16只，隨機(jī)分為正常組（C組）和正常運(yùn)動(dòng)組（E組），每組8只。DE及E組進(jìn)行為期6周的跑臺(tái)耐力運(yùn)動(dòng)，速度按周遞增分別為15、16、17、18、19、20 m/min，持續(xù)時(shí)間為1 h，每周運(yùn)動(dòng)6天，周日休息。運(yùn)動(dòng)過程中不定期稱重。

1.4 腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)

6周耐力訓(xùn)練后進(jìn)行腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)（intraperitoneal glucose tolerance trial，IPGTT），大鼠禁食12小時(shí)后稱重，計(jì)算所需葡萄糖量，腹腔注射1.0 g葡萄糖/kg，采用剪尾法取尾靜脈血，檢測(cè)0 min（空腹）、15 min、30 min、60 min、90 min，120 min大鼠全血血糖水平。

1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處死與取材

末次運(yùn)動(dòng)結(jié)束，實(shí)驗(yàn)大鼠空腹24小時(shí)后處死。取肝臟，迅速裝入已經(jīng)標(biāo)記好的凍存管中，立即置于液氮中速凍，之后轉(zhuǎn)入－80℃冰箱保存，指標(biāo)待測(cè)。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR

冰上稱取30 mg肝臟組織，然后采用Trizol法提取肝臟中RNA，按照Trizol試劑說明書進(jìn)行提取。提取后采用超微量分光光度計(jì)NanoDrop測(cè)定提取RNA的濃度和純度。本實(shí)驗(yàn)使用TOYOBO的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄。采用ABI Step One型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器檢測(cè)Bip、IRE1、JNK1、AKT2、JNK2、IRS1及βactin的mRNA相對(duì)表達(dá)量，β-actin為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)引物均由上海生物工程有限公司合成，具體引物序列如下（表2），PCR結(jié)果數(shù)據(jù)分析采用2—ΔΔCT法進(jìn)行分析。

表2 基因引物序列

1.7 Western Blotting

本實(shí)驗(yàn)蛋白提取主要采用試劑為RIPA細(xì)胞裂解液（Thermo Scientific）和蛋白酶抑制劑（Roche），按羅氏蛋白酶抑制劑說明書，每10 ml RIPA裂解液中加入1片蛋白酶抑制劑和1片磷酸酶抑制劑。取組織40 mg置于放有磁珠的研磨管中，加入400 μl的裂解液（RIPA Lysis Buffer+1片蛋白酶磷酸酶抑制劑）。OMINI:OM-RP24型磁珠均質(zhì)勻漿儀勻漿。每勻漿1次，置于冰上5 min。共勻漿3次，最后1次置于冰上20 min。然后4度離心，14000 g，20 min。取上清，BCA蛋白濃度測(cè)定調(diào)平蛋白液濃度后進(jìn)行SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Alpha:FluorChem HD2凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照分析。其中 Bip、JNK1、JNK2、phospho-JNK（phospho T183+T183+T221）抗體均購于Abcam公司，AKT抗體購于CST公司。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

本實(shí)驗(yàn)各數(shù)據(jù)結(jié)果均采用±s的方式表示，統(tǒng)計(jì)軟件為EXCEL、SPSS。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和雙因素方差分析統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠體重的影響及耐力運(yùn)動(dòng)后血糖IPIP--GTTGTT測(cè)試

與C、E組相比，D、DE組大鼠體重均表現(xiàn)為低體重，E組體重相較C組呈下降的趨勢(shì)。DE組相較D組，體重同樣呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。6周耐力訓(xùn)練后血糖IPGTT測(cè)試結(jié)果表明，D、DE組大鼠IPGTT測(cè)試中血糖整體水平明顯高于C、E組大鼠（P＜0.001），并且其血糖水平在注射葡萄糖之后15 min后快速升高，且在60 min時(shí)，D組血糖水平達(dá)到峰值，DE組則已經(jīng)越過峰值開始下降，并且DE組血糖自60 min后顯著低于D組（P＜0.01），C組和E組15 min后血糖水平達(dá)到峰值。見圖1。

圖1 運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠體重的影響及6周耐力運(yùn)動(dòng)后大鼠血糖IPGTT測(cè)試結(jié)果

2.2 耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠BipBip、JNKJNK等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和胰島素信號(hào)通路相關(guān)mRNAmRNA水平的影響

與C組相比，E組的Bip mRNA水平無顯著性差異，D組的Bip mRNA有上升趨勢(shì)（P=0.06）。與E組相比，DE組的JNK1 mRNA 的表達(dá)有降低趨勢(shì)（P=0.06），而其余基因的mRNA水平均無明顯差異。見圖2。

2.3 耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)BipBip、JNKJNK等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白水平的影響

如圖3所示，與C組相比，D組JNK1蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。與E組相比，DE 組的JNK2蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）。與C組相比，D組AKT蛋白表達(dá)下降（P＜0.01）；與E 組相比，DE組的AKT蛋白表達(dá)下降（P＜0.01）。

圖2 運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠肝臟Bip、IRE1、JNK1、JNK2、AKT2、IRS1基因表達(dá)水平的影響

圖3 運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠肝臟Bip、JNK1、JNK2、p-JNK、AKT蛋白表達(dá)水平的影響

3 分析和討論

3.1 耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠體重的影響及耐力運(yùn)動(dòng)后血糖IPIP--GTTGTT測(cè)試

有研究表明GK大鼠由于2型糖尿病導(dǎo)致體重增速減緩，發(fā)病后體重顯著低于Wistar大鼠[8]，本研究GK大鼠體重符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期。而長期耐力訓(xùn)后大鼠表現(xiàn)出體重降低的趨勢(shì)。2型糖尿病的主要病理生理特征是高血糖結(jié)合胰島素抵抗。本研究結(jié)果表明，與C、E組相比，D、DE組的降血糖能力明顯下降。C組、E組IPGTT測(cè)試結(jié)果無明顯差異，注射葡萄糖溶液60 min～120 min后，DE組血糖水平顯著低于D組，提示6周的跑臺(tái)耐力運(yùn)動(dòng)可以改善GK大鼠血糖水平，有利于維持血糖水平穩(wěn)態(tài)。

3.2 耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與胰島素抵抗相關(guān)分子表達(dá)的影響

靜息狀態(tài)下，免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白（immunoglobulin heavy chain-binding protein，Bip）與 PERK、IRE1、ATF6處于結(jié)合狀態(tài)。隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，三者從Bip上釋放出來，進(jìn)而激活下游信號(hào)通路，引發(fā)UPR。Bip是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志物，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的情況下，Bip表達(dá)升高[9]。Ozcan等[5]研究表明Bip表達(dá)增加后，通過IRE1-JNK通路使IRS1絲氨酸異位點(diǎn)磷酸化增加，最終導(dǎo)致胰島素抵抗。然而，Jennifer研究表明，用?；切苋パ跄懰帷⑺谋交宜岷瓦^表達(dá)Bip來減緩內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，肌細(xì)胞在棕櫚酸鹽的誘導(dǎo)作用下并未出現(xiàn)胰島素抵抗減緩的現(xiàn)象。這也表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并不是導(dǎo)致胰島素抵抗的唯一因素[10]。最近研究表明脂肪組織巨噬細(xì)胞分泌的外泌體上所攜帶的micro RNA155可以直接抑制胰島素信號(hào)通路[11]，提示導(dǎo)致胰島素抵抗的原因可能是復(fù)雜多樣的。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致IRE1的激活，從而引發(fā)進(jìn)一步UPR信號(hào)反應(yīng)。而我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)正常組，D組大鼠Bip蛋白表達(dá)并未升高，僅Bip mRNA水平有上升趨勢(shì)（P=0.06），而IRE1同樣無顯著性差異，表明本實(shí)驗(yàn)GK大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并未發(fā)生應(yīng)激。這也說明了雖然大量證據(jù)表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗，但導(dǎo)致胰島素抵抗的原因可能并非只有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，可能還存在其它的因素。并且，眾多研究表明長期運(yùn)動(dòng)能夠減緩內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，降低胰島素抵抗。然而，本研究結(jié)果顯示運(yùn)動(dòng)并未減緩內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，推測(cè)6周的跑臺(tái)耐力訓(xùn)練的運(yùn)動(dòng)量可能不足以降低Bip和IRE1的表達(dá)。

JNK是MAPK家族中的重要一員，包括JNK1、JNK2、JNK3。其中JNK1和JNK2在功能上存在著較大的差別。Ruo等[12]用高果糖膳食喂養(yǎng)小鼠，發(fā)現(xiàn)肝臟中IRE1表達(dá)增加，JNK磷酸化顯著上升，IRS1絲氨酸位點(diǎn)磷酸化顯著增強(qiáng)，并且伴隨著AKT磷酸化的下降，這表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以通過激活JNK來誘發(fā)胰島素抵抗。Jiro等[7]研究發(fā)現(xiàn)，肥胖小鼠中伴隨著JNK活性的異常升高。敲除JNK1基因，肥胖癥狀則有所緩解，胰島素抵抗的癥狀有明顯的改善。他們還發(fā)現(xiàn)高脂膳食能夠誘導(dǎo)小鼠肌肉、肝臟及脂肪組織JNK1的激活，這表明脂肪可能是導(dǎo)致JNK1激活的關(guān)鍵因素。Sharma等[13]通過siRNA敲低IRE1，發(fā)現(xiàn)飽和脂肪酸能在肝細(xì)胞中直接誘導(dǎo)JNK的激活，這表明IRE1的激活并不是JNK激活的主要因素，脂肪在肝細(xì)胞中的堆積也能導(dǎo)致JNK激活。本研究表明，C組與D組在JNK1 mRNA水平?jīng)]有顯著性差異。與E組相比，DE組JNK1 mRNA水平有降低的趨勢(shì)。推測(cè)運(yùn)動(dòng)和糖尿病二者共同作用調(diào)節(jié)，導(dǎo)致DE組JNK1轉(zhuǎn)錄降低，但其具體機(jī)制仍不明確。與C組相比，D組的JNK1蛋白表達(dá)明顯升高，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示JNK1磷酸化水平并未出現(xiàn)顯著性差異，這提示JNK1是通過總蛋白增加來引發(fā)胰島素抵抗，但本研究中JNK1的激活因素究竟是什么，有待進(jìn)一步研究。從JNK2 mRNA水平來看，各組之間無顯著性差異，而從蛋白水平來看，與C組相比，D組JNK2蛋白有下降趨勢(shì)，并且相對(duì)E組而言，DE組JNK2蛋白水平顯著下降，可能是糖尿病大鼠JNK2 mRNA翻譯過程受阻，或者其轉(zhuǎn)錄后受到細(xì)胞內(nèi)非編碼RNA的調(diào)控，其具體機(jī)制尚不明確。Gurol等[14]研究發(fā)現(xiàn)JNK2基因敲除的動(dòng)物并未表現(xiàn)出任何胰島素敏感性和體重的改變。由此，我們不難得出，JNK1和JNK2兩種同源蛋白在細(xì)胞內(nèi)共同調(diào)節(jié)生理功能時(shí)，JNK2對(duì)胰島素信號(hào)通路似乎沒有明確直接的影響，而JNK1則與胰島素信號(hào)通路存在著密切的關(guān)系。

IRS-1是胰島素信號(hào)通路中的關(guān)鍵受體蛋白，本研究表明IRS1 mRNA水平各組之間均無顯著性差異，這表明JNK1導(dǎo)致的胰島素敏感性降低與IRS1上游信號(hào)的變化無關(guān)，而是直接影響IRS1磷酸化以及下游分子的變化。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT又被稱為蛋白激酶B（protein kinase B，PKB），有幾種亞型，如AKT1、AKT2，而AKT2與胰島素信號(hào)通路的關(guān)系更為密切。Frankish研究表明，AKT2基因敲除的小鼠表現(xiàn)出2型糖尿病的癥狀[15]。研究表明，2型糖尿病中AKT的表達(dá)被抑制，例如Christ發(fā)現(xiàn)2型糖尿病病人肌細(xì)胞AKT表達(dá)降低[16]，王亞等研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病大鼠肝組織AKT表達(dá)降低[17]，這表明胰島素信號(hào)通路處于抑制狀態(tài)。本研究結(jié)果表明，AKT2 mRNA水平上各組之間無顯著性差異，但從C組和D組蛋白水平來看，D組AKT蛋白水平低于C 組（P＜0.01）。而且，DE 組AKT蛋白表達(dá)水平低于E 組（P＜0.01）。我們推測(cè)，由于D組和DE組同是2型糖尿病，存在著嚴(yán)重的胰島素抵抗，所以其胰島素信號(hào)通路被抑制，AKT表達(dá)下降。然而從C組與E組以及D組與DE組比較來看，其AKT蛋白表達(dá)相互之間不存在顯著性差異，推測(cè)6周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)的運(yùn)動(dòng)量不足以改善胰島素信號(hào)通路。

4 結(jié)論

本研究顯示肝臟組織中，相較于正常大鼠，2型糖尿病大鼠肝臟JNK1蛋白表達(dá)水平顯著升高，其JNK2水平無明顯差異，表明胰島素抵抗的發(fā)生與JNK1的表達(dá)水平的升高密切相關(guān)。此外，6周跑臺(tái)耐力運(yùn)動(dòng)并未影響大鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平和GK大鼠肝臟胰島素信號(hào)通路，但其能改善GK大鼠血糖水平，有利于維持血糖水平穩(wěn)態(tài)。