有氧運(yùn)動調(diào)控神經(jīng)生長因子表達(dá)改善心力衰竭大鼠心臟交感神經(jīng)功能

李曉霞 李梅 邢軍 朱中新 張行 趙賽 孔亦樂 宋玉瑩 趙龍 曹業(yè)童

山東體育學(xué)院（濟(jì)南 250102）

去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）是交感神經(jīng)節(jié)后纖維釋放的主要神經(jīng)遞質(zhì)，其生物學(xué)效應(yīng)是通過突觸前和突觸后腎上腺素能受體介導(dǎo)的，包括提高心率和心肌收縮力、增加血管緊張度、上調(diào)腎素-血管緊張素系統(tǒng)活性以及促進(jìn)腎臟對鈉離子重吸收[1]。交感神經(jīng)囊泡釋放的NE在發(fā)揮作用后約80%～90%會被位于神經(jīng)元突觸前膜的單胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白——去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體（norepinephrine transporter，NET）再攝取，及時終止神經(jīng)沖動信號并維持受體對神經(jīng)遞質(zhì)的敏感性。使用非選擇性NET抑制劑西布曲明（sibutramine）可引起NE過度釋放以及心臟腎上腺素能反應(yīng)過度，進(jìn)而造成心臟結(jié)構(gòu)和功能異常[2]，提示NET對心血管交感神經(jīng)系統(tǒng)起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。研究顯示[2]，各種原因造成的心血管疾?。ㄔl(fā)性高血壓、缺血性心臟病、應(yīng)激性心肌?。┮约鞍l(fā)展至終末階段的心力衰竭（心衰）患者均存在交感神經(jīng)過度興奮、NE釋放增加，其機(jī)制與NET表達(dá)下降、再攝取功能減弱有關(guān)。神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的一員，通過與其受體（TrkA）結(jié)合進(jìn)而促進(jìn)中樞和外周神經(jīng)生長、分化、存活以及再生，在維持神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和整合的生理功能中起調(diào)節(jié)作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，多種心血管疾病均與NGF有直接關(guān)聯(lián)[4]，而交感神經(jīng)節(jié)內(nèi)注射NGF還能夠改善心衰大鼠NET結(jié)構(gòu)和功能[5]，因此NGF－TrkANET信號途徑有望成為心衰治療的新靶點(diǎn)。

流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)[6]，有氧運(yùn)動能力作為重要的臨床參數(shù)，是多種心血管疾病患者全因死亡率的強(qiáng)預(yù)測因子，而長期有氧運(yùn)動可對多個器官系統(tǒng)產(chǎn)生良性作用，包括肌肉（心肌和骨骼?。┚€粒體生物合成增加、毛細(xì)血管增多、血管順應(yīng)性提高以及心輸出量增加[7]，最終提升患者運(yùn)動能力、改善生活質(zhì)量并降低死亡率。因此，有氧運(yùn)動已成為多種慢性?。òㄐ乃?、高血壓、糖尿病等）一級和二級預(yù)防的干預(yù)手段以及臨床治療的重要補(bǔ)充[8]。研究證實(shí)[9]，有氧運(yùn)動能夠抑制心衰患者交感神經(jīng)過度興奮狀態(tài)，但具體機(jī)制尚未明確。課題組前期的研究證實(shí)[10]，有氧運(yùn)動通過上調(diào)心肌梗塞大鼠心臟交感神經(jīng)元NET的表達(dá)，促進(jìn)對NE再攝取并恢復(fù)交感神經(jīng)末梢NE釋放量。鑒于NGF在維持NET功能中的作用，因此推測NGF－TrkA信號途徑可能參與了運(yùn)動對交感神經(jīng)活性的調(diào)控。本研究旨在觀察有氧運(yùn)動對心肌梗塞后心衰大鼠心臟重塑以及心臟交感神經(jīng)功能的影響并探討NGF－TrkA在其間的可能作用機(jī)制。

1 研究對象和方法

1.1 實(shí)驗動物與分組

8周齡SPF級雄性Wistar大鼠36只，購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司。實(shí)驗動物許可證號：SCXK[魯]2008-0003）。分籠飼養(yǎng)（2只/籠），室溫22℃～26℃，濕度60%～70%，12/12 h明暗交替循環(huán)，自由進(jìn)食水。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后采用SPSS 20.0隨機(jī)生成數(shù)字表分為假手術(shù)組（sham group，Sham組）、心衰安靜組（heart failure sedentary group，HF-sed）和心衰運(yùn)動組（heart failure exercise group，HF-ex組），每組12只。

1.2 心肌梗塞后心衰模型制備

參照課題組前期建立的方法[10-16]制備心肌梗塞后心衰模型（HF-sed和HF-ex組），方法簡述如下：稱重后腹腔麻醉（30 g/L戊巴比妥納，10 ml/kg體重）大鼠，仰臥位固定于手術(shù)臺上，行氣管插管并接動物呼吸機(jī)（潮氣量10 mL/kg體重，呼吸頻率65 b/min，呼吸比1.5︰1）。備皮后，于胸骨左緣3 mm處縱型切開皮膚約3～4 cm，依次分離胸壁肌肉打開胸腔，破壞心包暴露心臟并分離左冠狀動脈前降支，用0號絲線結(jié)扎。結(jié)扎成功的標(biāo)志：結(jié)扎后肉眼可觀察到結(jié)扎遠(yuǎn)端局部心臟表面變白，同時在心電圖顯示ST段抬高以及心律失常表現(xiàn)。Sham組大鼠進(jìn)行假手術(shù)，即麻醉開胸后只在左冠狀動脈前降支下方穿線但不結(jié)扎，其他操作同上。術(shù)后連續(xù)7 d肌肉注射抗生素預(yù)防感染。4周后 HF-ex組開始進(jìn)行跑臺運(yùn)動訓(xùn)練，Sham組和HF-sed組于鼠籠內(nèi)安靜飼養(yǎng)。

1.3 運(yùn)動方案

先利用課題組前期建立的方法測定HF-ex組大鼠最大有氧速度（maximal aerobic speed，MAS）[10]，方法為：以5 m/min跑速（坡度：0°）進(jìn)行15 min熱身后休息5 min，隨后進(jìn)行遞增負(fù)荷力竭運(yùn)動實(shí)驗，即起始負(fù)荷為7 m/min，每3 min遞增5 m/min，直至力竭（坡度始終為0°）。

參照課題組前期研究[10-16]制定HF-ex組運(yùn)動方案，該組大鼠進(jìn)行5 d/周、共10周的跑臺運(yùn)動訓(xùn)練，運(yùn)動強(qiáng)度前2周為50%MAS，后8周為60%MAS，運(yùn)動時間逐漸遞增，第1天30 min，以后每天增加10 min，直到60 min/d。

1.4 心臟結(jié)構(gòu)與功能測定

末次訓(xùn)練后48 h，先稱量體重，隨后用戊巴比妥鈉（10 mL/kg體重）腹腔注射麻醉動物，仰臥固定，胸部備皮，用小動物超聲影像診斷系統(tǒng)（visualsonics vevo770，加拿大）檢測心臟結(jié)構(gòu)與功能，指標(biāo)包括：左心室舒張末期直徑（leftventricularend-diastolicdiameter，LVEDD）、左心室壁厚度（left ventricular wall thickness，LVWT）和左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.5 動物取材

超聲檢測后尾靜脈取血200 μL，EDTA抗凝，4℃、3000 rpm離心15 min取血漿，－20℃凍存待測血漿NE。隨后取大鼠心臟，用生理鹽水沖洗后濾紙沾干，稱量心臟重量（heart mass，HM），計算與體重的比值作為心臟質(zhì)量指數(shù)（heart mass index，HMI）。分離左心室，稱量左心室重量（left ventricular mass，LVM）并計算與體重的比值作為左心室質(zhì)量指數(shù)（left ventricular mass index，LVMI）。隨后在左心室最大橫徑處橫切將其分為兩部分，一部分利用Masson染色進(jìn)行組織病理學(xué)觀察，另一部分投入液氮中并轉(zhuǎn)入－80℃低溫冰箱凍存待測心肌NE含量和相關(guān)基因表達(dá)水平。

1.6 心臟組織病理學(xué)觀察

將心肌組織用10%甲醛溶液固定，經(jīng)脫水、透明、包埋和切片（5 μm）后利用Masson染色制作組織切片，每張切片隨機(jī)選取5個視野，用圖像分析軟件（Image Pro Plus 6.0，美國）測量膠原面積，用膠原面積與所測視野面積的比值作為膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen volume fraction，CVF），表示心肌纖維化程度。

1.7 血漿與心肌NENE測定

取100 μL血漿，加入200 μL濃度為0.05 mol/L的高氯酸溶液，常溫10000 rpm離心5 min，取上清，用日本產(chǎn)島津LC10ATvp型高效液相色譜儀測定血漿NE含量（單位：μg/mL）。取50 μg心肌組織，按2 μL/mg加入濃度為0.1 mol/L的高氯酸溶液，常溫18000 rpm離心15 min，取上清，同樣方法測定心肌NE含量（單位：μg/mg濕?。?。

1.8 心肌NGFNGF、TrkATrkA、NETNET和酪氨酸羥化酶（tyrosineosine hydroxylaseylase，THTH）mRNAmRNA表達(dá)測定

心肌組織勻漿后，Trizol法抽提總RNA，采用A260紫外吸收測定法和變性瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA質(zhì)量與純度。上下游引物采用Primer 5.0（美國）進(jìn)行設(shè)計（見表1），逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA，使用實(shí)時熒光定量PCR儀（ABI 7900型，美國）測定心肌NGF、TrkA、NET和TH mRNA表達(dá)量。擴(kuò)增條件為：預(yù)變性95℃/1min；95℃/15s，55℃/15s，72℃/15s，共40個循環(huán)。以βactin為內(nèi)參基因，計算各目的基因的相對表達(dá)量。

表1 引物序列設(shè)計

1.9 心肌NGFNGF、TrkATrkA、NETNET和THTH蛋白表達(dá)測定

取100 mg心肌組織經(jīng)勻漿裂解后，4℃、20000 g離心15 min，考馬斯亮藍(lán)法測定總蛋白濃度。取10 μg蛋白樣品在垂直電泳儀上經(jīng)15%SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。一抗（兔抗鼠）4℃靜置孵育過夜，二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG）37℃孵育1～2 h，充分洗滌后，使用ECL發(fā)光成像，利用Image Pro Plus 6.0軟件（美國）掃描各條帶灰度值。β-actin為內(nèi)參蛋白，計算各目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間比較使用單因素方差分析（Fisher檢驗），若F值具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），則使用S-N-K檢驗進(jìn)行多重比較。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。統(tǒng)計軟件為SPSS 20.0 for windows。

2 結(jié)果

2.1 樣本量分析

實(shí)驗過程中（包括造模和10周運(yùn)動干預(yù)），由于手術(shù)失敗、拒跑、意外死亡等原因，共剔除8只動物，最終樣本量n＝28，其中Sham組（n＝11），HF-sed組（n＝9），HF-ex組（n＝8）。

2.2 體重、心指數(shù)、心臟結(jié)構(gòu)與功能

與Sham組比較，HF-sed組體重和LVEF降低（P＜0.05），HM、HMI、LVW、LVMI、LVEDD 和 LVWT 增加（P＜0.05）；與HF-sed組比較，HF-ex組LVEDD下降，LVEF升高（P＜0.05）。見表2。心臟超聲見圖1。

表2 體重、心指數(shù)、心臟結(jié)構(gòu)與功能

圖1 超聲心動圖

2.3 心肌Massonasson染色與CVFCVF

心臟組織病理學(xué)觀察顯示（見圖2）：心肌細(xì)胞呈暗紅色，膠原纖維呈淺藍(lán)色。Sham組心肌細(xì)胞排列整齊，僅含有少量膠原纖維；HF-sed組心肌細(xì)胞減少、排列紊亂，膠原含量明顯增多（黑色箭頭所示部位即為膠原成分），CVF顯著高于Sham組（P＜0.05）；HF-ex組較HF-sed組心肌細(xì)胞增多、膠原纖維有所減少，CVF降低（P＜0.05）。各組CVF的變化見圖3。

圖2 心肌Masson染色（×200）

圖3 心肌CVF變化

2.4 血漿與心肌NENE含量變化

與Sham組比較，HF-sed組心肌NE含量下降（P＜0.05），HF-sed和HF-ex組血漿NE含量增加（P＜0.05）；與HF-sed組比較，HF-ex組心肌NE含量升高（P＜0.05），血漿NE含量降低（P＜0.05）。見圖4。

2.5 心肌NGFNGF、TrkATrkA、THTH和NETNET基因表達(dá)（mRNAmRNA和蛋白）的變化

與Sham組比較，HF-sed組心肌NGF、TrkA和TH mRNA與蛋白以及NET蛋白表達(dá)量降低（P＜0.05）；與HF-sed組比較，HF-ex組心肌NGF、TrkA和TH mRNA與蛋白以及NET蛋白表達(dá)量升高（P＜0.05）。未檢測出心肌NET mRNA表達(dá)量。見圖5～6。

圖4 血漿與心肌NE含量變化

圖5 心肌NGF、TrkA、TH mRNA表達(dá)的變化

圖6 心肌NGF、TrkA、NET和TH蛋白表達(dá)的變化

3 討論

結(jié)扎左冠狀動脈前降支造成心肌梗塞是心衰最常用的造模方法，其它方法還包括腹主動脈縮窄法、阿霉素或異丙腎上腺素注射法以及快速心室起搏法等。一般認(rèn)為冠狀動脈結(jié)扎術(shù)后2～4周即可獲取慢性心衰模型并廣泛應(yīng)用于心衰病因、病理生理機(jī)制以及治療等方面的研究。在本研究中，心衰造模后14周，HF-sed組心臟出現(xiàn)結(jié)構(gòu)與功能重塑，心臟超聲和心臟幾何學(xué)表現(xiàn)為心肌肥厚、左心室擴(kuò)張、心功能下降，即HM、HMI、LVW、LVMI、LVEDD和LVWT增加，LVEF降低；病理組織學(xué)顯示心肌間質(zhì)出現(xiàn)明顯纖維化，CVF升高。上述結(jié)果提示，HF-sed組大鼠出現(xiàn)心功能不全且處于心肌梗塞所致心衰失代償期，最終導(dǎo)致心臟舒縮功能障礙并加速心衰進(jìn)程。

大量研究證實(shí)[10-20]，有氧運(yùn)動對于心衰動物/臨床患者具有良好的輔助治療（康復(fù)）作用，可有效減輕疲勞、呼吸困難等癥狀，提高心功能和運(yùn)動耐力，改善生活質(zhì)量。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過10周跑臺有氧運(yùn)動后，與HF-sed組比較，HF-ex組雖然心臟肥大并未得到改善（HM、HMI、LVW和LVMI與HF-sed組無顯著性差異），但心腔內(nèi)徑（LVEDD）縮小，心功能提高（LVEF增加），心肌纖維化減輕（CVF減少），說明有氧運(yùn)動可通過抑制心臟重塑提高心臟舒縮功能，進(jìn)而延緩心衰進(jìn)程。這與Garciarena等[21]針對自發(fā)性高血壓大鼠的研究基本一致，即心衰所致的病理性心臟肥大經(jīng)過規(guī)律運(yùn)動后向生理性心臟肥大轉(zhuǎn)化。然而目前關(guān)于有氧運(yùn)動對心衰有益效應(yīng)的機(jī)制尚未完全明確。

心臟自主神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控心臟的興奮性、節(jié)律性、傳導(dǎo)性和收縮性，是維持心功能的重要因素。心交感神經(jīng)通過釋放神經(jīng)遞質(zhì)NE激活β-腎上腺素受體（β-adrenergic receptor，β-AR），對心臟功能發(fā)揮變時、變力、變傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用。各種病因?qū)е滦乃r均出現(xiàn)心臟交感神經(jīng)功能異常并與心衰后的不良結(jié)局密切相關(guān)，而β-AR阻滯劑則可改善心功能并降低病死率[22]，說明交感神經(jīng)過度激活是心衰發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。本研究中，血漿NE含量顯著升高，說明全身交感活性顯著增加。研究證實(shí)[2]，心衰時血漿NE濃度顯著升高，除了與交感神經(jīng)元NE外溢（NE spillover）有關(guān)外，還與位于交感神經(jīng)突觸前膜的NET功能異常有關(guān)。NET的主要作用是將交感神經(jīng)元末梢釋放的NE再攝取到突觸前膜中，以便及時終止神經(jīng)沖動信號，避免過量NE對心臟的毒性效應(yīng)[2]。本研究發(fā)現(xiàn)，HF-sed組NET蛋白表達(dá)下調(diào)，提示其攝取功能下降，與課題組前期的研究結(jié)果一致[10]。需要注意的是，各組心肌未檢測到NET mRNA表達(dá)量，而課題組前期證實(shí)[10]，NET mRNA在心臟交感神經(jīng)節(jié)（即頸中－星狀神經(jīng)節(jié)復(fù)合體）表達(dá)，因此推測NET蛋白在神經(jīng)節(jié)中翻譯后通過神經(jīng)軸突轉(zhuǎn)運(yùn)到突觸前膜上發(fā)揮再攝取功能[2]。與血漿NE變化不同，HF-sed組心肌NE含量低于Sham組，提示心肌交感活性下降，心肌TH表達(dá)下降也證實(shí)了這一點(diǎn)（TH是NE合成代謝通路中的關(guān)鍵酶，其表達(dá)量可間接反映心交感神經(jīng)活性）?？赡艿脑蚴?，心衰代償期時，交感神經(jīng)系統(tǒng)激活以及循環(huán)NE增高導(dǎo)致心肌間質(zhì)NE濃度升高，但交感持續(xù)活化、高濃度NE對心肌產(chǎn)生毒性作用，可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，心肌交感神經(jīng)密度下降，即所謂的交感去神經(jīng)（sympathetic denervation）[1]。此外，過量產(chǎn)生的NE還可促使β-AR表達(dá)下調(diào)、受體對NE反應(yīng)性下降以及受體后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)脫耦聯(lián)（脫敏反應(yīng)）[23]，心肌NE含量下降。

NGF對于交感神經(jīng)生長、分化與再生以及維持其正常功能起重要調(diào)節(jié)作用[3]。NGF的高親和性受體是由原癌基因trk編碼的一種酪氨酸蛋白激酶受體（TrkA），NGF和TrkA結(jié)合后產(chǎn)生的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制與其他酪氨酸蛋白激酶受體相似[24]。研究證實(shí)，諸多心臟疾患如心肌梗塞、高血壓、心律失常、心衰等均與NGF和TrkA有直接關(guān)聯(lián)[4]。在本研究中，與Sham組比較，HF-sed組NGF和TrkA mRNA和蛋白水平均顯著性降低，與Kaye等[25]和Xing等[4]針對心衰動物的研究結(jié)果一致。NGF與TrkA表達(dá)下調(diào)影響交感神經(jīng)生長并造成其分布密度下降。

對心臟NGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及交感神經(jīng)活性的調(diào)節(jié)無疑是保護(hù)心功能，延緩心衰進(jìn)程的治療靶點(diǎn)。多項報道顯示[9]，規(guī)律體力活動能夠改善心血管疾病患者的自主神經(jīng)功能，然而運(yùn)動是否通過影響NGF和TrkA基因表達(dá)而發(fā)揮心血管保護(hù)效應(yīng)尚不得而知。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過10周跑臺訓(xùn)練，HF-ex組NGF和TrkA mRNA和蛋白表達(dá)量較HF-sed組均顯著增加，提示有氧運(yùn)動可能通過維持NGF－TrkA穩(wěn)態(tài)平衡而促進(jìn)交感神經(jīng)生長和存活，進(jìn)而提高心臟交感神經(jīng)密度（TH mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)），最終改善心功能。動物實(shí)驗證實(shí)[3-5]，NGF可激活病理狀態(tài)下心臟交感神經(jīng)再生和功能修復(fù)、改善NET結(jié)構(gòu)和功能，這對于降低心血管不良事件發(fā)生率具有積極作用。在本研究中，HF-ex組NET蛋白表達(dá)量較HF-sed組上調(diào)，但仍低于Sham組，提示NET功能僅部分恢復(fù)。HF-ex組血漿NE含量下降，證實(shí)全身交感過度激活得到抑制，然而心肌NE水平顯著性升高，似乎與NET表達(dá)上調(diào)相悖?？赡艿慕忉屖?，心衰失代償期心肌交感神經(jīng)密度下降造成心肌間質(zhì)NE含量降低[1，23]，有氧運(yùn)動通過上調(diào)NGF和TrkA表達(dá)增加心肌交感神經(jīng)密度進(jìn)而提高心肌NE水平，因此心肌NE升高是對長期運(yùn)動的適應(yīng)性反應(yīng)。此外，由于NET表達(dá)上調(diào)，其對交感神經(jīng)末梢NE釋放的調(diào)節(jié)作用得到恢復(fù)，從而改善心衰后自主神經(jīng)功能紊亂狀態(tài)[10]?？傊琋GF－TrkA－NET信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了運(yùn)動對心衰大鼠心肌的保護(hù)作用，可能是心衰康復(fù)治療的干預(yù)靶點(diǎn)之一。

4 結(jié)論

心衰后出現(xiàn)交感神經(jīng)功能紊亂、心臟重塑、心功能下降，其機(jī)制可能與NGF、TrkA和NET表達(dá)下調(diào)有關(guān)；長期有氧運(yùn)動可通過改善心衰大鼠心臟交感神經(jīng)功能逆轉(zhuǎn)心臟重塑、提高心功能，其機(jī)制可能與NGF與TrkA表達(dá)上調(diào)進(jìn)而部分恢復(fù)NET功能有關(guān)。