袁玲玲 錢如貴 丁麗娜 李心鋒
摘要:目的 建立HPLC法測定保元湯顆粒中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量。方法 根據(jù)《中國藥典》規(guī)定的方法,并加以優(yōu)化,以Agilent Eclipse plus(5μm,4.6 mm × 250 mm)為色譜柱,以乙腈(A)-0.2%甲酸溶液(B)為流動相,梯度洗脫(0~20min,15%~40%A;20~25min,40%A),流速1.0 mL/min,柱溫25℃,檢測波長260nm。結(jié)果 經(jīng)方法學驗證,毛蕊異黃酮葡萄糖苷在25.23~504.5ng(R2=0.9995)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,該檢測方法專屬性較好,陰性無干擾,精密度RSD為0.26%,重復性RSD為3.98%,中間精密度RSD為3.12%,加樣回收率為93.63%(RSD為3.98%),溶液穩(wěn)定性在8h以內(nèi)可保持穩(wěn)定(RSD為1.47%),該方法耐用性較好。經(jīng)測定,甘草中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量為0.0045~0.0161%,保元湯顆粒(含有輔料,6 g/袋)中為87.98~97.46μg·g-1。結(jié)論 本研究所建立的方法簡便,結(jié)果準確可靠,適用于保元湯顆粒中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的測定,為建立保元湯質(zhì)量標準提供依據(jù)。此外,本研究首次對甘草中毛蕊異黃酮葡萄糖苷進行了鑒別及含量測定,為甘草及其制劑質(zhì)量標準深入研究奠定基礎。
關(guān)鍵詞:保元湯顆粒;毛蕊異黃酮葡萄糖苷;甘草;HPLC法
中圖分類號:R285.5?? 文獻標志碼:A?? 文章編號:1007-2349(2019)08-0069-07
【Abstract】Objective: To establish a HPLC method for the determination of calycosin isoflavone glucoside in Baoyuantang granules. Methods: According to the method specified in the Chinese Pharmacopoeia, Agilent Eclipse plus (5μm, 4.6 mm×250 mm) was taken as chromatographic column and acetonitrile (A)-0.2% formic acid solution (B) as mobile phase, with gradient elution (0~20min, 15%~40%A; 20~25min, 40%A), flow rate 1.0 mL/min, column temperature 25℃, and detection wavelength 260 nm. Results: The method showed that calycosin isoflavone glucoside had a good linear relationship in the range of 25.23 to 504.5ng (R2=0.9995). The detection method had good specificity and no interference. The precision RSD was 0.26% and the reproducible RSD was 3.98%, and the intermediate precision RSD is 3.12%. The sample recovery rate was 93.63% (RSD is 3.98%), and the solution stability could be kept stable within 8h (RSD is 1.47%). The method had better durability. The content of calycosin isoflavone glucoside in the licorice was determined to be 0.0045-0.0161%, and that in the Baoyuantang granules (containing excipients, 6 g/bag) was 87.98~97.46μg·g-1. Conclusion: The method established in this study is simple, accurate and reliable and suitable for the determination of calycosin isoflavone glucoside in the Baoyuantang granules, and provides a basis for establishing the quality standard of Baoyuantang. In addition, the study was the first to identify and determine the content of calycosin isoflavone glucosides in licorice and lay a foundation for further research on the quality standards of licorice and its preparations.
【Key words】Baoyuantang granules, calycosin flavonoid glucoside, licorice, HPLC method
保元湯為治療元氣虛弱的古代經(jīng)典方劑,最早見于明代魏直的《博愛心鑒》,將其作為治療小兒痘瘡的基礎方,由人參、黃芪、肉桂、甘草四味藥物組成,全方可大補元氣,尤補后天脾肺之氣,健脾保肺溫腎,能治一切元氣虛弱之證,故名“保元”[1]。明代孫志宏所著《簡明醫(yī)彀》中記載保元湯“由人參一錢,黃芪二錢,甘草五分,肉桂二分組成,右加生姜一片,水煎服。治元氣虛弱,精神倦怠,肌肉柔慢,飲食少進,面青白,睡臥寧靜,及有雜證,皆屬虛弱,宜服。”藥理研究發(fā)現(xiàn),該方具有調(diào)節(jié)免疫、促進心血管功能、促進造血、調(diào)節(jié)凝血及纖溶平衡、抗氧化、抗應激等多種藥理作用,與其補氣溫陽的功能相吻合。臨床上廣泛用于氣虛、免疫失調(diào)引起的多種疾病[2,3]。
人參和黃芪作為該方的君臣藥,各活性成分均起到重要的藥理作用[4],其中,毛蕊異黃酮葡萄糖苷是黃芪中具有代表性的黃酮類成分之一,具有抗病毒、抗菌、降脂、抗氧自由基、抗缺血、抗骨質(zhì)疏松、促血管新生等作用[5,6],該成分可作為保元湯顆粒的質(zhì)量控制指標。研究中發(fā)現(xiàn),黃芪和甘草均含有毛蕊異黃酮苷葡萄糖苷,其中甘草中含量較低,通過本研究建立保元湯顆粒中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測定方法,并對其進行方法學驗證研究,為保元湯顆粒質(zhì)量標準建立提供實驗依據(jù)。
1 儀器與材料
1.1 試驗材料 保元湯顆粒(昆明邦宇制藥有限公司,自制,6 g/袋);毛蕊異黃酮葡萄糖苷(中國食品藥品檢定研究院,111920-201606);甲醇(國藥集團化學試劑有限公司,20181102);三氯甲烷(國藥集團化學試劑有限公司,20180223);甲酸(天津風船化學試劑科技有限公司,20100722);乙腈(Fisher Chemical,177798),硅膠GF254薄層板(青島海洋化工廠分廠,20130708)。
1.2 試驗儀器 ME204電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);BT125D電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司);Aglient 1260高效液相色譜儀(Agilent Technologies Inc.,G1311C 1260 Quat pump四元泵,G1329B自動進樣器,G1316A 1260TCC柱溫箱,G1314F 1260VWD紫外檢測器);SK250LH7超聲波清洗儀(上海科導超聲儀器有限公司);HH-S26數(shù)顯雙列六孔恒溫水浴鍋(金壇市大地自動化儀器廠)。
2 方法與結(jié)果
2.1 保元湯顆粒制備 根據(jù)《簡明醫(yī)彀》記載和明代衡制單位,換算為現(xiàn)代質(zhì)量單位的處方見表1。
取以上五味藥材,人參、肉桂破碎為細塊或粗粉,生姜切成薄片,黃芪、甘草取飲片,加20倍純化水分3次提取,每次煮沸30 min,合并提取液,過濾,濃縮,干燥,提取得率為21.42~24.82%,加入適量輔料,制成顆粒。包裝規(guī)格:6 g/袋;用法用量:每天2次,每次1袋。
2.2 溶液的制備
2.2.1 對照品溶液制備 稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品約10 mg,精密稱定,置于10 mL 容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,得濃度為1 mg·mL-1 的對照品儲備液。精密量取儲備液5 mL,置于100 mL容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,得50 μg·mL-1對照品溶液,置2~8℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
2.2.2 黃芪藥材供試品溶液制備 取黃芪藥材粉末1.0 g,置圓底燒瓶中,精密加入甲醇50 mL,稱定重量,加熱回流4h,放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,精密量取續(xù)濾25 mL,回收溶劑至干,殘渣加甲醇溶解,轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,即得[7]。
2.2.3 甘草藥材供試品溶液制備 稱取甘草藥材粉末5.0 g,置圓底燒瓶中,精密加入甲醇70 mL,稱定重量,加熱回流4h,放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,精密量取續(xù)濾35 mL,回收溶劑至干,殘渣加甲醇溶解,轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,即得。
2.2.4 保元湯黃芪、甘草雙陰性供試品溶液制備 按處方量稱取人參、肉桂、生姜各適量,依照2.2.2 供試品溶液的處理方法處理。
2.2.5 保元湯顆粒供試品溶液 取保元湯顆粒1袋,研細,稱取約2.0 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加甲醇30 mL,超聲處理(功率180W,頻率53kHz)30 min,濾過,濾渣同法再處理一次,合并濾液,蒸至近干,殘渣加甲醇適量溶解,轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
2.3 色譜條件優(yōu)化 按2.2.5制備供試品溶液,參考文獻[8]及中國藥典黃芪藥材項下毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定方法進行,出峰時間在5.9 min,附近峰比較密集,容易受溶劑干擾影響,后將流動相比例加以調(diào)整,出峰時間延后至8.9 min,分離度和理論塔板數(shù)均得到改善,改善后的毛蕊異黃酮葡萄糖苷成分與其他成分分離度良好,分離度大于1.5,符合藥典要求。流動相比例調(diào)整情況及結(jié)果詳見表2,調(diào)整前后HPLC圖譜見圖1。
根據(jù)實驗結(jié)果,得到優(yōu)化的色譜條件,色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse plus C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相:乙腈(A)-0.2%甲酸水溶液(B),梯度洗脫,0~20 min,15%~40%A;20~25min,40%A,流速:1.0 mL·min-1,柱溫:25℃,檢測波長260 nm,進樣量:10μL。保留時間為20min,理論塔板數(shù)以毛蕊異黃酮葡萄糖苷計不低于3000。
2.4 方法學驗證
2.4.1 專屬性考察
2.4.1.1 HPLC檢測 分別吸取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液、黃芪藥材供試品溶液、甘草藥材供試品溶液、保元湯黃芪甘草雙陰性供試品溶液、保元湯顆粒供試品溶液10 μL,依2.3方法檢測。結(jié)果表明,保元湯顆粒、黃芪、甘草tR8.9 min均有吸收峰,通過改變流動相比例和流速,該峰依然重合,而保元湯黃芪、甘草雙陰性供試品溶液無干擾,說明黃芪、甘草中均含有毛蕊異黃酮葡萄糖苷,保元湯顆粒中含有的毛蕊異黃酮葡萄糖苷來源于黃芪和甘草,以毛蕊異黃酮葡萄糖苷作為保元湯顆粒質(zhì)量控制成分具有較好專屬性。專屬性實驗HPLC圖譜見圖2。
2.4.1.2 TLC鑒別 吸取各供試品溶液及毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液(濃度為0.3 mg·mL-1)各10 μL,分別點樣于同一硅膠GF254 薄層板上,用三氯甲烷-甲醇-水(13∶ 7∶ 2)的下層溶液為展開劑,展開后,晾干,置紫外光燈254 nm下觀察[9]。保元湯顆粒、黃芪、甘草供試品溶液與對照品溶液在相應位置上顯示相同顏色的斑點,但保元湯黃芪、甘草雙陰性供試品溶液無相應斑點,與HPLC檢測結(jié)果一致,由此確定,同為豆科植物的黃芪和甘草兩種藥材均含有毛蕊異黃酮葡萄糖苷。TLC圖譜見圖3。
2.4.2 線性及范圍考察 分別精密吸取混合對照品溶液適量,依次稀釋成2.5、5.0、10、20、30、40、50 μg·mL-1的對照品溶液,分別精密吸取10μL注入液相色譜儀,按2.3色譜條件進行分析,測定峰面積,以峰面積積分值作為縱坐標(Y),毛蕊異黃酮葡萄糖苷進樣量作為橫坐標(X),繪制標準曲線,得到回歸方程Y=2496.2X+12.915,R2=0.9995,表明毛蕊異黃酮葡萄糖苷在25.23~504.5 ng范圍內(nèi),進樣量(ng)與峰面積(mAU)呈良好線性關(guān)系。線性關(guān)系數(shù)據(jù)見表3,標準曲線見圖4。
2.4.3 精密度考察 精密吸取40 μg·mL-1的對照品溶液10 μL,重復進樣6次,記錄峰面積。經(jīng)計算,毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD為0.26%,符合RSD≤2.0%的要求,表明該方法精密度良好。相關(guān)數(shù)據(jù)見表4。
2.4.4 重復性考察 取保元湯顆粒,按2.2.5項下平行制備6份供試品溶液,依法測定,結(jié)果6份供試品溶液含量依次為:93.861、95.871、93.213、93.865、93.787、85.363 μg·g-1,平均含量為92.660 μg·g-1,RSD為3.98%,符合待測成分含量為0.01%時重復性RSD≤4.0%的要求,表明方法重復性良好。相關(guān)數(shù)據(jù)見表5。
2.4.5 中間精密度考察 不同人在不同時間進行操作,取保元湯顆粒,按2.2.5項下平行制備6份供試品溶液,依法測定,結(jié)果6份供試品溶液含量依次為:89.829、89.499、93.170、92.749、91.761、95.022 μg·g-1,平均含量為92.005 μg·g-1,RSD為2.28%,與2.4.4中測定結(jié)果92.660 μg·g-1比較,平均含量為92.33 μg·g-1,RSD為3.12%,符合RSD≤4.0%的要求,表明方法中間精密度較好。相關(guān)數(shù)據(jù)見表5。
2.4.6 準確度(加樣回收)考察 稱取保元湯顆粒粉末9份,每份約1.0 g,精密稱定,分成3組,分別按已知質(zhì)量分數(shù)的50%、100%、150% 3個水平加入毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液(50.45 μg·mL-1)1、2、3 mL,按“2.2.5”項下方法制備,依法測定,計算回收率。毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均回收率為93.63%,符合待測成分含量為0.01%時回收率范圍達到85~110%的要求,回收率的RSD為3.98%,符合RSD≤4.0%的要求。保元湯顆粒中的原有量按2.4.5中計算的結(jié)果92.3μg·g-1計算而得,相關(guān)數(shù)據(jù)見表6。
2.4.7 穩(wěn)定性試驗 吸取同一供試品溶液(室溫放置)各10μL,分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定,比較峰面積變化,結(jié)果表明,毛蕊異黃酮葡萄糖苷供試品溶液在8h以內(nèi)均能保持穩(wěn)定,各時間點峰面積比較,RSD為1.47%,在24 h內(nèi)溶液穩(wěn)定性稍差,各時間點峰面積比較,RSD為2.06%。相關(guān)數(shù)據(jù)見表7。
2.4.8 耐用性試驗 在各色譜條件下,稱取同一批次保元湯顆粒(批號20181220),按2.2.5項下制備供試品溶液,依改變色譜條件相關(guān)參數(shù)及色譜柱,詳細參數(shù)變化及結(jié)果見表8,改變各條件測定結(jié)果與原條件比較,理論塔板數(shù)與分離度均能達到要求,與原條件比較相對平均偏差依次為1.84%、0.34%、0.63%、1.59%,均達到RAD≤2.0%的要求,另外各條件下結(jié)果比較RSD為1.60%,說明該方法耐用性較好。
2.5 毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定
2.5.1 甘草中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定 由2.4.1中專屬性考察結(jié)果可知,甘草與黃芪均含有毛蕊異黃酮葡萄糖苷。取市售4個不同生產(chǎn)商/供應商的甘草(飲片),測定其含量。稱取各批次甘草粉末5.0 g,按2.2.3方法處理樣品,結(jié)果見表9。各甘草藥材中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量差異大,其中1#為制備保元湯顆粒所用批次甘草,含量為0.0080%,四個樣品中內(nèi)蒙古所產(chǎn)的甘草含量最高,達到0.0161%。
2.5.2 黃芪含量測定 取制備保元湯顆粒所用批次的黃芪藥材,按2.2.2制備供試品溶液,依法檢測,計算含量為0.0687%。
2.5.2 保元湯顆粒含量測定 稱取保元湯顆粒,按2.2.5項下制備供試品溶液,依法測定,按外標法計算樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量,結(jié)果見表10。三個批次保元湯顆粒含量在87.98~97.46 μg·g-1范圍內(nèi)。
3 結(jié)論與討論
中醫(yī)的“虛癥”,指人體正氣不足,臟腑功能減弱或衰退所表現(xiàn)的證候,包括免疫力低下、易生病、久病不愈等,中醫(yī)以扶正固本作為治病的基本法則。而正氣的盛衰是一個動態(tài)的傳變過程,不僅與各臟腑及氣、血、精、液的狀態(tài)密切相關(guān),也與環(huán)境的變化有著緊密的聯(lián)系[10]。保元湯顆粒用于治療元氣虛弱、精神倦怠、肌肉柔慢等虛癥,通過調(diào)節(jié)五臟六腑氣血的陰陽平衡來改善患者的免疫功能,提高患者的免疫力水平[11,12]。作為保元湯方中的臣藥,黃芪用以補氣,藥用歷史悠久,黃芪的化學成分主要有黃酮類、皂苷類等成分,其中毛蕊異黃酮葡萄糖苷是黃芪中主要成分之一,也是藥典中收錄黃芪的質(zhì)量控制指標之一,不僅具有抗氧化活性、抗炎、免疫抑制的作用,還可以抑制病毒復制,改善心臟功能,調(diào)節(jié)細胞免疫、體液免疫功能[13,14,15]。這些藥理作用都與改善機體臟腑功能、改善虛證有關(guān),該質(zhì)量控制指標的建立具有實際意義。
氣血津液互根互用,共同發(fā)揮保護機體驅(qū)邪抗病的作用。若脾胃健運,氣血津液充盈,正氣充足,免疫功能多正常,則不易被病原微生物等邪氣侵襲;若脾虛氣血津液虧虛,正氣不足,免疫功能多缺陷或低下,則難以抵抗邪氣侵襲而患病[16]。
作為方中的使藥,甘草含有多種活性成分,其中,甘草酸、甘草苷為藥典中規(guī)定的甘草質(zhì)量控制指標,已有大量文獻報道了甘草中甘草酸、甘草苷的含量測定方法,但是,沒有關(guān)于甘草中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定的文獻報道。本研究首次對甘草中毛蕊異黃酮葡萄糖苷進行了鑒別及含量測定,這也為甘草藥材及含甘草中藥復方制劑的質(zhì)量標準制定提供了參考依據(jù)。甘草、黃芪同為豆科植物,均含有毛蕊異黃酮葡萄糖苷,其它豆科類植物藥材中是否含有該成分,有待深入研究。
根據(jù)實驗結(jié)果,毛蕊異黃酮葡萄糖苷在藥材黃芪中含量為0.0687%、甘草為0.0080%,3批保元湯顆粒含量為87.98~97.46 μg·g-1。保元湯顆粒(含有輔料)每袋6 g,每袋相當于含有黃芪3 g,甘草0.75 g,若毛蕊異黃酮葡萄糖苷成分轉(zhuǎn)移率為100%,保元湯顆粒應含毛蕊異黃酮葡萄糖苷353.5 μg·g-1,但實際轉(zhuǎn)移率僅為24.89~27.57%。本次實驗中,按照古籍文獻記載的傳統(tǒng)水煎煮方法制備保元湯顆粒,由于毛蕊異黃酮葡萄糖苷易受熱脫去葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)槊锂慄S酮[17,18],成分轉(zhuǎn)移率會受到較大影響,但作為具有生物活性且專屬于黃芪和甘草的成分之一,仍然可作為含量控制指標。經(jīng)方法學驗證,本研究建立保元湯中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定方法,專屬性較好,陰性無干擾,分離度能達到要求,重復性、中間精密度、耐用性等均符合要求,方法簡便,可操作性強,可用于保元湯顆粒的質(zhì)量控制。
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(收稿日期:2019-04-16)