糖痛方對(duì)糖尿病神經(jīng)病變大鼠坐骨神經(jīng)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3Ⅱ表達(dá)的影響

王明欣　田宇　朱曉云　王洪武　白文山　李鳴鏑

摘要：目的??觀察糖痛方對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變（DPN）大鼠坐骨神經(jīng)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3Ⅱ表達(dá)的影響，初步探討其作用機(jī)制。方法??雄性SD大鼠75只，隨機(jī)選取15只為正常組，其余60只采用2%鏈脲佐菌素誘導(dǎo)制作糖尿病大鼠模型，造模成功4周后，結(jié)合缺血再灌注制備DPN模型，成模大鼠隨機(jī)分為模型組和糖痛方低、中、高劑量組，每組15只，糖痛方低、中、高劑量組分別按成人6.25、12.5、25倍劑量給藥，正常組和模型組給予等量蒸餾水灌胃，每日1次，灌胃8周，Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測大鼠Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白和mRNA的表達(dá)，透射電鏡觀察坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果??與正常組比較，模型組大鼠Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白和mRNA表達(dá)均升高，髓鞘腫脹、變性，板層分離;與模型組比較，糖痛方各劑量組大鼠Beclin-1和LC3Ⅱ蛋白和mRNA表達(dá)呈下降趨勢，以糖痛方中、高劑量組降低明顯，髓鞘變性程度減輕。結(jié)論??糖痛方可能通過抑制模型大鼠過度自噬，發(fā)揮對(duì)DPN大鼠的治療作用。

關(guān)鍵詞：糖痛方;自噬;糖尿病周圍神經(jīng)病變;大鼠

中圖分類號(hào)：R285.5 ???文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ???文章編號(hào)：1005-5304（2019）09-0065-04

Effects of Tangtong?Prescription on Expressions of Beclin-1 and LC3Ⅱ?in Diabetic Neuropathy Rats

WANG Mingxin¹， TIAN Yu²， ZHU Xiaoyun¹， WANG Hongwu²， BAi Wenshan¹， LI Mingdi¹

1. Guanganmen Hospital， China?Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100053， China; 2. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 300193， China

Abstract： Objective To observe the effects of Tangtong?Prescription on beclin-1 and LC3Ⅱ?of autophagy related proteins in sciatic nerve of diabetic peripheral neuropathy rats; To preliminarily investigate its mechanism of action. Methods Seventy-five male SD rats were randomly selected， 15 for normal group， and other 60 rats were treated with intraperitoneal injection of STZ to build type 2 diabetic nice model. 4 weeks after modeling， diabetic peripheral neuropathy （DPN） model was prepared by combining with ischemia-reperfusion preparation of， the model of DPN rats were randomly divided into model group， and Tangtong?Prescription low-， medium- and high-dosage groups， with 15 cases in each group. Tangtong?Prescription low-， medium- and high-dosage groups were given medicine as 6.25， 12.5， 25 times of adult doses. The normal group and the model group were given the same amount of distilled water for gavage， once a day. After gavage for 8 weeks， Western blot and real-time fluorescent quantitative PCR were used to detect the expressions of Beclin-1 and LC3Ⅱ?proteins and mRNA， and the ultrastructure of sciatic nerve was observed by transmission electron microscope. Results?Compared with the normal group， expressions of Beclin-1 and LC3Ⅱ?protein and mRNA in the model group increased， with myelin sheath swelling and degeneration， and lamellar separation. Compared with the model group， expressions of beclin-1 and LC3Ⅱ?protein and mRNA showed a downward trend， and myelin degeneration was significantly reduced in Tangtong?Prescription medium- and high-dosage groups.?Conclusion Tangtong?Prescription may play a therapeutic role in DPN rats by inhibiting excessive autophagy in model rats.

Keywords： Tangtong Prescription; autophagy; diabetic peripheral neuropathy;?rats

糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，該病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，迄今對(duì)DPN患者尚缺乏有效的治療方法^[1]。糖痛方是中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院林蘭教授治療DPN的經(jīng)驗(yàn)方，多年臨床實(shí)踐表明其臨床療效較好^[2-3]。課題組前期研究表明，糖痛方可明顯減少細(xì)胞間黏附分子-1、腫瘤壞死因子-α、過氧化物酶的高表達(dá)，并通過降低雪旺細(xì)胞凋亡率和Caspase-3、Caspase-9蛋白和mRNA的表達(dá)，提高Bcl-2蛋白及mRNA的表達(dá)，顯示出其具有抑制細(xì)胞凋亡、減弱神經(jīng)組織的炎癥反應(yīng)，提高DPN大鼠模型坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度的作用^[4-8]。為進(jìn)一步探討糖痛方治療DPN的可能機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)觀察糖痛方對(duì)DPN大鼠坐骨神經(jīng)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3Ⅱ表達(dá)的影響，為臨床應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 ?實(shí)驗(yàn)材料

1.1 ?動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠75只，體質(zhì)量160～180 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可號(hào)SCXK（京）2016-0011;飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物房，溫度18～25 ℃，相對(duì)濕度50%～80%，明暗周期12 h，自由攝食飲水。

1.2 ?藥物

糖痛方（黃芪30 g，桂枝10 g，白芍10 g，細(xì)辛3 g，土鱉蟲10 g，姜黃15 g，川芎10 g），飲片購自中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院中藥房，經(jīng)水煎取汁濃縮，制成濃度為2.64 g/mL藥液。精蛋白鋅胰島素注射液，江蘇萬邦生化醫(yī)藥公司，規(guī)格400 IU/10 mL，批號(hào)030814。

1.3 ?主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素（美國Sigma公司），水合氯醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），磷酸鹽緩沖液（北京賽默飛世爾公司），注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司），4%多聚甲醛溶液（北京索萊寶科技有限公司），HRP標(biāo)記羊抗兔IgG（H+L，美國Jackson公司），HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG（H+L，美國Jackson公司BCA蛋白檢測試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號(hào)02912E），HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號(hào)CW2569），QPCR試劑盒（美國Biosystems公司KK4601）。羅氏卓越型血糖儀（美國羅氏診斷公司），高速冷凍離心機(jī)（德國Hettich公司），DM-300生物顯微鏡（德國Leica公司），JEM-1400透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社），JY300C電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司），ChampGel 5000凝膠成像儀（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）。

2 ?實(shí)驗(yàn)方法

2.1 ?糖尿病模型制作

75只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)選擇15只作為正常組，其余60只大鼠禁食不禁水12 h，次日使用pH 4.2檸檬酸鹽緩沖液配制濃度為2%鏈脲佐菌素溶液，按60 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射，72 h后血糖儀測量大鼠尾尖血糖，以持續(xù)隨機(jī)血糖>16.7 mmol/L作為糖尿病大鼠成模標(biāo)準(zhǔn)。正常組大鼠注射等量檸檬酸鹽緩沖液。造模期間，每2周測量1次尾尖血糖;對(duì)隨機(jī)血糖<16.7 mmol/L大鼠予以剔除;對(duì)隨機(jī)血糖>27 mmol/L大鼠，根據(jù)其血糖水平，予精蛋白鋅胰島素注射液1～4 U皮下注射，每日1次，維持血糖在19.4～25.0 mmol/L。

2.2 ?糖尿病周圍神經(jīng)病變模型制作

糖尿病大鼠飼養(yǎng)4周后，將10 g水合氯醛用無菌水配制成100 mL溶液，錫箔紙包裹避光保存。參照文獻(xiàn)[5]方法造模，按4 mL/kg體質(zhì)量腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定鼠板上，消毒備皮后，沿右側(cè)腹股溝韌帶剪開長約2 cm切口，鈍性剝離股動(dòng)脈，使用動(dòng)脈夾于腹股溝水平處夾閉股動(dòng)脈，再沿腹壁正中線切開長3 cm切口，鈍性剝離腹主動(dòng)脈和右側(cè)髂總動(dòng)脈，使用動(dòng)脈夾先后于髂動(dòng)脈分叉處下1 cm處夾閉右側(cè)髂總動(dòng)脈，于髂腰動(dòng)脈水平下0.5 cm處夾閉腹主動(dòng)脈。鹽水紗布保護(hù)切口，使用紅外線燈使右后肢體溫保持35 ℃。3 h后恢復(fù)供血，逐層縫合肌肉、皮膚。術(shù)后大鼠腹腔注射8萬U/只青霉素鈉，連續(xù)3 d。正常組大鼠不予處理。

2.3 ?分組和給藥

術(shù)后7 d待大鼠傷口愈合后分組、給藥。60只DPN模型大鼠隨機(jī)分為模型組和糖痛方低、中、高劑量組，每組15只。糖痛方低、中、高劑量組分別按每日成人劑量6.25倍（9.17 g/kg）、12.5倍（18.33 g/kg）、25倍（36.67 g/kg）灌胃給藥，正常組和模型組給予等量蒸餾水灌胃。給藥體積均為1 mL/100 g，每日1次，連續(xù)8周。

2.4 ?檢測指標(biāo)

2.4.1 ?Western blot檢測Beclin-1和LC3Ⅱ蛋白表達(dá)

大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，截取右側(cè)坐骨神經(jīng)，RIPA蛋白裂解液勻漿，冰上孵育20 min，4 ℃、13 000 r/min離心20 min，取上清液。按照BCA蛋白定量試劑盒使用說明書進(jìn)行操作，測定蛋白濃度。配制15%分離膠，濃縮膠濃度為5%，上樣，濃縮壓恒壓90 V，分離膠恒壓120 V，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜60 min，將膜浸入5%BSA-TBST中，室溫放置1 h。用5%BSA- TBST稀釋一抗，4 ℃水平搖床孵育過夜。次日洗膜，TBST沖洗3次×10 min。用封閉液稀釋HPR標(biāo)記的二抗，室溫孵育40 min，TBST沖洗3次×10 min，ECL曝光。

2.4.2 ?qRT-PCR檢測Beclin-1和LC3Ⅱ基因表達(dá)

按Trizol試劑盒說明提取總RNA，1.2%瓊脂糖凝膠電泳，反轉(zhuǎn)錄按HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進(jìn)行操作。反應(yīng)體系：SYBR FAST QPCR Kit Master Mix（2×）5 μL，上游引物F（10 μmol/L）0.2 μL，下游引物R（10 μmol/L）0.2 μL，cDNA模版1 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃、3 min;95 ℃、3 s;60 ℃、20 s，40個(gè)循環(huán)。引物設(shè)計(jì)見表1。

2.4.3 ?透射電鏡觀察坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)

大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，截取右側(cè)坐骨神經(jīng)。取1 mm³左右2.5%戊二醛固定，1%鋨酸后固定，乙醇丙酮梯度脫水，Epon812包埋，超薄切片，厚度為50～70 nm，乙酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡觀察有髓鞘神經(jīng)纖維脫髓鞘及細(xì)胞質(zhì)的病理改變并攝片，觀察有無損傷的細(xì)胞器（如線粒體的腫脹變性、自噬體等）。

3 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以x（—）±s表示，組間比較釆用方差分析，組間兩兩比較用LSD法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 ?結(jié)果

4.1 ?糖痛方對(duì)模型大鼠坐骨神經(jīng)Beclin-1和LC3Ⅱ蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠Beclin-1蛋白表達(dá)水平升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，糖痛方各劑量組大鼠Beclin-1和LC3Ⅱ蛋白表達(dá)均有下降趨勢，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見圖1、表2。

4.2 ?糖痛方對(duì)模型大鼠坐骨神經(jīng)Beclin-1和LC3Ⅱ基因表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠Beclin-1和LC3Ⅱ?mRNA表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）;與模型組比較，糖痛方各劑量組大鼠Beclin-1和LC3Ⅱ mRNA表達(dá)降低，其中糖痛方中、高劑量組Beclin-1明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見表3。

4.3 ?超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

正常組大鼠坐骨神經(jīng)髓鞘完整，髓鞘板層呈同心圓層狀排列，無變形、萎縮、分離;雪旺細(xì)胞及細(xì)胞核呈卵圓形，核仁明顯，染色質(zhì)均勻;模型組大鼠坐骨神經(jīng)髓鞘腫脹、變性，可見到板層分離，雪旺細(xì)胞細(xì)胞核為卵圓形，胞漿中可見空泡變性;糖痛方各劑量組大鼠坐骨神經(jīng)髓鞘變性不同程度減輕，糖痛方低劑量組可見坐骨神經(jīng)髓鞘變性和胞漿中空泡變性，但髓鞘板層排列整齊;糖痛方中劑量組坐骨神經(jīng)髓鞘變性、輕微崩解，板層結(jié)構(gòu)較完整，細(xì)胞核為卵圓形，胞質(zhì)清晰、均勻;糖痛方高劑量組坐骨神經(jīng)髓鞘腫脹，有部分崩解，但未見板層分離。結(jié)果見圖2。

5 ?討論

DPN以四肢遠(yuǎn)端對(duì)稱性感覺和運(yùn)動(dòng)障礙，運(yùn)動(dòng)、感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢及髓鞘和軸突變性為特點(diǎn)。其病理顯示節(jié)段性脫髓鞘改變與雪旺細(xì)胞損害，同時(shí)伴有明顯的神經(jīng)內(nèi)膜微血管病。自噬是真核細(xì)胞通過降解自身細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)實(shí)現(xiàn)“自我消化”的過程^[9-10]，被稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡。凋亡與自噬在生化代謝途徑及形態(tài)學(xué)方面都有顯著區(qū)別。有研究顯示，自噬可保護(hù)細(xì)胞免于發(fā)生凋亡^[11]。

Beclin-1是酵母自噬相關(guān)基因Atg6/Vps30的哺乳動(dòng)物同源基因，參與自噬體形成的啟動(dòng)過程，在自噬泡形成過程中起重要作用，其表達(dá)與自噬的發(fā)生正相關(guān)。LC3是自噬的標(biāo)志性蛋白，真核細(xì)胞中有2種LC3：位于胞漿內(nèi)LC3-Ⅰ在自噬相關(guān)酶的催化下發(fā)生反應(yīng)，與自噬體膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合，轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ位于自噬體膜上，其表達(dá)與自噬體的數(shù)量呈正相關(guān)。

本研究采用課題組前期建立的DPN模型^[5]。研究表明，當(dāng)腦組織發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí)，自噬水平上調(diào)^[12-13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠坐骨神經(jīng)Beclin-1和LC3Ⅱ的mRNA表達(dá)明顯升高，糖痛方干預(yù)后，Beclin-1和LC3Ⅱ?mRNA表達(dá)呈下降趨勢。Beclin-1和LC3Ⅱ mRNA表達(dá)升高提示自噬活動(dòng)旺盛，其水平回降提示自噬活動(dòng)趨于平穩(wěn)。自噬是把雙刃劍，既可在生理情況下對(duì)細(xì)胞內(nèi)殘損的細(xì)胞器、錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)進(jìn)行降解重吸收，保證細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，提高能量利用率，減少細(xì)胞的凋亡;又可在病理性亢進(jìn)下過分激活，導(dǎo)致整個(gè)細(xì)胞被溶解死亡^[14-16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與自噬呈正相關(guān)性的Beclin-1及LC3Ⅱ，在高血糖環(huán)境下大鼠坐骨神經(jīng)中含量顯著升高，糖痛方干預(yù)后，可降至接近正常水平，表明糖痛方能調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬活動(dòng)。

綜上所述，糖痛方可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬，提高細(xì)胞內(nèi)“垃圾”代謝的效率，抑制細(xì)胞凋亡，從而起到治療DPN及其并發(fā)癥的作用。

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