復(fù)方參鹿顆粒干預(yù)鈣結(jié)合蛋白S100A8/A9改善較低危骨髓增生異常綜合征患者無效造血機(jī)制研究

瞿瑋穎　邱仲川　陳珮　黃中迪　胡曉瑩　朱小勤　陸穎佳　談栩鋮　趙琳

摘要：目的 ?觀察復(fù)方參鹿顆粒對較低危骨髓增生異常綜合征（MDS）患者鈣結(jié)合蛋白S100A8、S100A9的影響，探討其改善無效造血的作用機(jī)制。方法 ?采用隨機(jī)數(shù)字表法將60例較低危MDS患者分為治療組和對照組各30例。治療組予復(fù)方參鹿顆粒，每次1包，每日3次，口服;對照組予十一酸睪酮膠丸，每次40 mg，每日3次，口服。2組均連續(xù)治療3個月。比較2組臨床療效，觀察2組治療前后外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），鈣結(jié)合蛋白S100A9、S100A8、S100A8/A9和p-p38蛋白表達(dá)及其相關(guān)性。結(jié)果 ?治療組總有效率為85.7%（24/28），對照組為71.4%（20/28），2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與本組治療前比較，2組治療后紅細(xì)胞、血紅蛋白、血小板計(jì)數(shù)明顯升高（P<0.05，P<0.01）。與本組治療前比較，治療組治療后TNF-α、IFN-γ、VEGF水平明顯下降（P<0.01）;2組治療后比較，治療組TNF-α、IFN-γ明顯低于對照組（P<0.05，P<0.01）。與正常組比較，2組治療前S100A8、S100A9、S100A8/A9水平明顯升高（P<0.01），p-p38蛋白表達(dá)明顯增加（P<0.05，P<0.01）;與本組治療前比較，治療組治療后S100A8、S100A9、S100A8/A9水平明顯下降（P<0.01），p-p38蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.01）。2組治療前S100A8、S100A9、S100A8/A9與TNF-α、IFN-γ、VEGF、p-p38蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（P<0.01）。治療組治療后S100A8、S100A9、S100A8/A9與總有效率、紅細(xì)胞、血紅蛋白呈正相關(guān)（P<0.01）。結(jié)論 ?復(fù)方參鹿顆?？捎行Ц纳戚^低危MDS患者無效造血，其機(jī)制可能與下調(diào)S100A8、S100A9、S100A8/A9活性，抑制p-p38表達(dá)，減少細(xì)胞因子分泌有關(guān)。

關(guān)鍵詞：復(fù)方參鹿顆粒;骨髓增生異常綜合征;S100A8;S100A9;S100A8/A9;磷酸化p38

中圖分類號：R259.513 ???文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）09-0020-05

Study on Mechanism of Intervention of Compound Shenlu?Granules in S100A8/A9 for Improving Ineffective Hematopoiesis in Patients with Lower-risk Myelodysplastic Syndrome

QU Weiying， QIU Zhongchuan， CHEN Pei， HUANG Zhongdi， HU Xiaoying， ZHU Xiaoqin，?LU Yingjia， TAN Xucheng， ZHAO Lin

Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200021， China

Abstract： Objective To observe the effects of Compound Shenlu?Granules on calcium binding protein S100A8 and S100A9 in patients with lower-risk myelodysplastic syndromes （MDS）; To explore its mechanism of improving ineffective hematopoiesis. Methods?Totally 60 lower-risk MDS patients were divided into treatment group and control group according to random number table method， with 30 cases in each group. Treatment group was given Compound Shenlu?Granules， 1 pack each time， three times a day， orally; while control group was given andriol capsule， 40 mg each time， three times a day， orally. The treatment for both groups lasted for 3 months. Clinical efficacy， blood cell counts， changes of cytokines such as TNF-α， IFN-γ， VEGF， calcium-binding proteins S100A8， S100A9， S100A8/A9， and p-p38 protein expression levels before and after treatment in the two groups and their correlation were observed. Results The total effective rate was 85.7% （24/28） in the treatment group and 71.4% （20/28） in the control group， without statistical difference?in the two groups （P>0.05）. Compared with before treatment， the erythrocyte，hemoglobin and platelet counts of the two groups significantly increased after treatment （P<0.05， P<0.01）. Compared with before treatment， the levels of TNF-α， IFN-γ and VEGF in the treatment group decreased significantly （P<0.01）; After treatment， the TNF-α and IFN-γ in the treatment group were significantly lower than those in the control group （P<0.05， P<0.01）. Compared with the normal group， the concentrations of S100A8， S100A9， and S100A8/A9 significantly increased in the two groups before treatment （P<0.01）， and the expression of p-p38 protein significantly increased （P<0.05， P<0.01）. The expressions of S100A8， S100A9 and S100A8/A9 were positively correlated with the expressions of TNF-α， IFN-γ， VEGF and p-p38 （P<0.01）?in both groups before treatment. S100A8， S100A9 and S100A8/A9 were positively correlated with total effective rate， red blood cells and hemoglobin （P<0.01）?in the treatment group after treatment. Conclusion?Compound Shenlu?Granules can effectively improve the ineffective hematopoiesis in lower-risk MDS patients. The mechanism may be related to down-regulate the activity of S100A8， S100A9 and S100A8/A9， inhibit the expression of p-p38， and reduce the secretion of inflammatory cytokines.

Keywords： CompoundShenluGranules; myelodysplastic syndromes; S100A8; S100A9; S100A8/A9; p-p38

骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes，?MDS）是一組異質(zhì)性克隆性疾病，以無效造血、進(jìn)展性的外周血細(xì)胞減少、高風(fēng)險向急性髓系白血病轉(zhuǎn)化及總體生存率低為臨床特征^[1]。其中70%的患者以無效造血、難治性血細(xì)胞減少為主要臨床表現(xiàn)的較低危MDS。目前西醫(yī)學(xué)仍缺乏有效治療手段。S100A8、S100A9是鈣結(jié)合蛋白S100蛋白家族中的重要成員，近年研究表明，S100A8、S100A9在較低危MDS患者中表達(dá)明顯升高，可能激活炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)，從而引起造血功能障礙，導(dǎo)致骨髓無效造血的發(fā)生^[2-3]。復(fù)方參鹿顆粒為本院血液科院內(nèi)制劑（滬藥制字Z06100005），臨床應(yīng)用20余年。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方參鹿顆粒可減少M(fèi)DS造血抑制因子的產(chǎn)生^[4]，下調(diào)p-p38蛋白表達(dá)從而減少CD34⁺細(xì)胞凋亡^[5]。本研究擬進(jìn)一步證實(shí)S100A8/A9表達(dá)與細(xì)胞因子、p38MAPK通路活化、骨髓無效造血間的關(guān)系，探討復(fù)方參鹿顆粒改善較低危MDS骨髓無效造血的作用機(jī)制?，F(xiàn)報道如下。

1 ?資料與方法

1.1 ?一般資料

選擇2016年1月-2017年12月本院血液科較低危MDS患者60例，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為治療組和對照組各30例。治療組男16例，女14例;年齡26～78歲，平均年齡（50.9±14.6）歲;難治性貧血伴環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞增多（RARS）1例，難治性中性粒細(xì)胞減少（RN）2例，難治性血細(xì)胞減少伴多系發(fā)育異常（RCMD）27例;國際預(yù)后評分系統(tǒng)（IPSS）0.5分26例，1分4例。對照組男17例，女13例;年齡20～79歲，平均年齡（54.2±15.6）歲;RARS 1例，RN 1例，RCMD 28例;IPSS 0.5分25例，1分5例。2組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。治療組疾病進(jìn)展為急性髓細(xì)胞白血病1例，失訪1例;對照組失訪2例。選擇本院骨科股骨骨折患者8例為正常組，經(jīng)知情同意后采集其手術(shù)時的骨髓液備檢。正常組男5例，女3例;年齡30～68歲，平均年齡（50.2±13.7）歲。本研究經(jīng)本院倫理委員會審查批準(zhǔn)（2014-124）。

1.2 ?西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)

MDS診斷參照維也納診斷標(biāo)準(zhǔn)，參照2008年世界衛(wèi)生組織分型診斷標(biāo)準(zhǔn)制定RARS、RN、RCMD標(biāo)準(zhǔn)^[6]。參照MDS IPSS積分判斷預(yù)后，IPSS 0.5～1分為中危-1（Int-1），即較低危。

1.3 ?中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)

參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》^[7]制定腎陽虛證辨證標(biāo)準(zhǔn)。主癥：周身乏力，形寒肢冷，面色、口唇、指甲蒼白。次癥：頭暈，腰膝酸軟，大便溏。舌脈：舌質(zhì)淡，脈沉細(xì)或虛大。符合主癥及2項(xiàng)以上次癥，結(jié)合舌脈即可辨證。

1.4 ?納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)、分型標(biāo)準(zhǔn)及中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn);②IPSS≤1分;③半年內(nèi)未用其他任何可能對造血功能有影響的藥物;④年齡18～80歲;⑤患者對本研究知情，并簽署知情同意書。

1.5 ?排除標(biāo)準(zhǔn)

①有明顯兼夾證或合并證者;②妊娠期或哺乳期婦女，過敏體質(zhì)及對本藥過敏者;③合并嚴(yán)重的心、腦、肝、腎疾病及精神病患者。

1.6 ?脫落及剔除標(biāo)準(zhǔn)

①受試者因故未完成本方案規(guī)定療程及觀察周期;②病例選擇違反納入標(biāo)準(zhǔn);③隨機(jī)化后無數(shù)據(jù)。

1.7 ?治療方法

2組予支持治療：血紅蛋白（Hb）<60 g/L予懸浮紅細(xì)胞輸注;血小板（PLT）<5.0×10⁹/L（無出血危險因子）或PLT<20.0×10⁹/L（有明顯出血傾向，或存在出血危險因子）予單采血小板輸注及對癥止血治療;合并感染及時予抗感染治療。

治療組在支持治療基礎(chǔ)上予復(fù)方參鹿顆粒，藥物組成：紅參須20 g、鹿角片10 g、炙龜甲10 g、熟地黃10 g、菟絲子10 g等，本院制劑室制備（批號20161209、20170302，12 g/包），每次1包，每日3次，口服。對照組在支持治療基礎(chǔ)上予十一酸睪酮膠丸（南京歐加農(nóng)制藥有限公司，批號175526），每次40 mg，每日3次，口服。2組均連續(xù)治療3個月。

1.8 ?觀察指標(biāo)

1.8.1 ?外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)

每2周采用COULTERLH750型全自動血細(xì)胞分析儀檢測外周血計(jì)數(shù)。

1.8.2 ?細(xì)胞因子和鈣結(jié)合蛋白S100A

于治療前后空腹采集2組患者外周血各2 mL，2000 r/min離心20 min，采集上清液，ELISA檢測TNF-α、IFN-γ、VEGF、S100A9、S100A8、S100A8/A9水平，嚴(yán)格按照試劑盒（德國西門子公司）說明書操作。

1.8.3 ?p-p38蛋白

Western blot檢測p-p38蛋白。2組于治療前后分別取肝素抗凝骨髓液5 mL，淋巴細(xì)胞分離液分離骨髓單個核細(xì)胞（BMMNC），收集細(xì)胞，BCA法蛋白定量，分離，凝固，加樣，蛋白電泳轉(zhuǎn)移，用3%BSA-TBST稀釋一抗，室溫孵育10 min，4 ℃過夜。次日TBST洗膜5次，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗，室溫輕搖40 min，ECL顯色，曝光，洗片。分別以GAPDH為內(nèi)參蛋白，用Quantity One分析各蛋白條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.9 ?療效標(biāo)準(zhǔn)

參照《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》^[8]制定療效標(biāo)準(zhǔn)?；揪徑猓贺氀统鲅Y狀消失，白細(xì)胞≥4×10⁹/L，PLT≥100×10⁹/L，Hb≥120 g/L（男）或110 g/L（女），治療期間無復(fù)發(fā)。部分緩解：貧血和出血癥狀消失，白細(xì)胞計(jì)數(shù)≥3.5×10⁹/L，PLT增加，Hb≥120 g/L（男）或110 g/L（女），隨訪3個月病情持續(xù)改善。進(jìn)步：Hb較治療前增加30 g/L以上3個月，貧血和出血癥狀明顯好轉(zhuǎn)。無效：癥狀、血象未達(dá)進(jìn)步?；揪徑?、部分緩解、進(jìn)步歸為有效?？傆行剩?）=有效例數(shù)÷總例數(shù)×100%。

1.10 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料用x（—）±s表示，采用t檢驗(yàn);不服從正態(tài)分布或方差不齊采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。采用Pearson分析進(jìn)行相關(guān)性分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 ?結(jié)果

2.1 ?2組臨床療效比較

治療組總有效率為85.7%（24/28），對照組為71.4%（20/28），2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2 ?2組治療前后外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

與本組治療前比較，2組治療后紅細(xì)胞、Hb、PLT明顯上升（P<0.05，P<0.01）;2組治療后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.3 ?2組治療前后細(xì)胞因子比較

與本組治療前比較，2組治療后TNF-α、IFN-γ、VEGF水平明顯下降（P<0.05，P<0.01）;2組治療后TNF-α、IFN-γ水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。見表3。

2.4 ?3組不同時點(diǎn)鈣結(jié)合蛋白比較

與正常組比較，治療組和對照組治療前S100A8、S100A9、S100A8/A9水平明顯升高（P<0.01）。與本組治療前比較，治療組S100A8、S100A9、S100A8/A9濃度明顯降低（P<0.01），治療組和對照組治療后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但仍高于正常組（P<0.01）。見表4。

2.5 ?3組不同時點(diǎn)p-p38蛋白表達(dá)比較

與正常組比較，2組p-p38蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05，P<0.01）;與本組治療前比較，治療組p-p38蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.01）。見表5、圖1。

2.6 ?2組治療前后鈣結(jié)合蛋白的相關(guān)性分析

2組治療前S100A8、S100A9、S100A8/A9蛋白表達(dá)與細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、VEGF及p-p38蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（P<0.01），見表6。治療組治療后S100A8、S100A9、S100A8/A9蛋白與總有效率、紅細(xì)胞、血紅蛋白呈正相關(guān)。見表7。

3 ?討論

MDS早期以無效造血為主要特征，其發(fā)病機(jī)制包括腫瘤克隆、炎性骨髓微環(huán)境、固有免疫異常等多種因素，其中TNF-α、IFN-γ、VEGF等異常高表達(dá)引起骨髓微環(huán)境改變及基質(zhì)免疫調(diào)節(jié)異常，可導(dǎo)致骨髓造血細(xì)胞的過度凋亡^[9]。

S100A8、S100A9是鈣結(jié)合蛋白S100蛋白家族中重要成員，是固有免疫系統(tǒng)最重要的病原模式受體之一TLR4的內(nèi)源性配體。二者可以鈣離子依賴性方式形成異源二聚體蛋白復(fù)合物S100A8/A9發(fā)揮作用，參與炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化、生長抑制、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等^[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，S100A8/A9在較低危MDS患者中顯著增加，并通過誘導(dǎo)分泌TNF-α等炎性因子導(dǎo)致促紅細(xì)胞生成素的表達(dá)受抑^[11]。S100A9轉(zhuǎn)基因小鼠可表現(xiàn)出與MDS患者一樣的骨髓的病態(tài)造血^[2]。另有研究表明，克隆性造血常見的基因突變可直接導(dǎo)致炎癥狀態(tài)的啟動，并可通過S100A8/A9誘導(dǎo)固有免疫系統(tǒng)異常激活，建立炎性環(huán)境，在抑制正常造血的同時使突變克隆獲得進(jìn)一步的優(yōu)勢擴(kuò)張^[12-13]。提示S100A8/A9可能為MDS基因異常、固有免疫異?；罨凸撬锜o效造血三者間重要的分子聯(lián)系。本研究中2例MDS-RARS患者（SF3B1基因EXON15突變），其S100A9濃度均超過20 ng/mL，顯著高于無體細(xì)胞基因突變患者。較低危MDS患者骨髓造血細(xì)胞存在p38組成性激活，使細(xì)胞內(nèi)p-p38表達(dá)升高，異?；罨膒38可直接導(dǎo)致骨髓CD34⁺細(xì)胞的過度凋亡^[14]，p38是S100A8/A9-TLR4信號通路的下游^[15]。2組治療前外周血中S100A8、S100A9、S100A8/A9較正常組明顯增加，且與TNF-α、IFN-γ、VEGF及p-p38蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，提示異常表達(dá)的S100A8、S100A9、S100A8/A9可能通過激活p38 MAPK信號途徑，進(jìn)而放大促炎因子應(yīng)答，導(dǎo)致骨髓無效造血。

MDS屬中醫(yī)學(xué)“虛勞”“血證”“髓毒勞”等范疇，其本質(zhì)為正虛邪實(shí)，治當(dāng)扶正虛祛邪毒。較低危MDS患者臨床表現(xiàn)以貧血癥狀多見，癥見面色萎黃或帶晦黯，倦怠納減，心悸頭暈，腰脊酸軟，苔薄白，舌淡，脈沉細(xì)弱。病機(jī)屬臟腑虛損，元?dú)馓撊?，治?dāng)以補(bǔ)虛為主。《素問·至真要大論篇》有“虛者補(bǔ)之”“勞者溫之”，《素問·陰陽應(yīng)象大論篇》云：“因其衰而彰之”，“形不足者，溫之以氣;精不足者，補(bǔ)之以味?！笨梢妼τ谔搫谥T證，溫補(bǔ)乃是第一要法?！鹅`樞·經(jīng)脈》載：“人始生，先成精，精成而腦髓生，骨為干，脈為營……血?dú)饽顺伞?，可見血?dú)庵墒加诰I藏五臟六腑之精氣，主骨生髓，腎中陽氣乃血液生化之原動力。因此，本病病機(jī)當(dāng)腎陽虛衰為本，治療當(dāng)溫腎益髓，補(bǔ)益氣血。