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    二氫楊梅素調(diào)節(jié)肝臟脂代謝及細(xì)胞外基質(zhì)生成的作用研究

    2019-09-17 06:22彭山珊
    中國(guó)科技教育 2019年8期
    關(guān)鍵詞:磷酸化高脂楊梅

    彭山珊

    非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已經(jīng)成為全球主要慢性病之一及我國(guó)重要的公共衛(wèi)生問題,但尚缺乏理想的防治措施。在網(wǎng)上查詢的時(shí)候,我發(fā)現(xiàn)了一種天然植物——莓茶,莓茶產(chǎn)地分布在長(zhǎng)江流域以南,如湖北西南部、云南東南部、福建、廣西、廣東、湖南等地,“長(zhǎng)壽之鄉(xiāng)”廣西巴馬也盛產(chǎn)莓茶。網(wǎng)上提到莓茶的保健功能有很多,尤其聲稱脂肪肝患者長(zhǎng)期飲用有明顯的效果?!拜枋欠袢缇W(wǎng)上所描述的那樣可以緩解脂肪肝和減輕肝纖維化?”帶著這個(gè)問題,我開始了本課題的研究。

    膳食營(yíng)養(yǎng)干預(yù)在慢性病防治中的重要作用已被廣泛關(guān)注,特別是植物性食物在慢性疾病防治中的作用日益凸顯。研究發(fā)現(xiàn),一些多酚類化合物能夠改善NAFLD患者肝脂肪變,抑制炎性反應(yīng),延緩NAFLD疾病進(jìn)程。二氫楊梅素(DHM)又名蛇葡萄素,屬于多酚類中的黃酮類化合物,在天然植物莓茶中含量甚高,在嫩莖葉中含量高達(dá)30%以上(以干重計(jì)),遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于莓茶中其他黃酮類化合物。因此,二氫楊梅素是莓茶中的主要天然活性成分。結(jié)合國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究進(jìn)展,我們率先提出了“莓茶可能防治NAFLD”的理論假說,并推測(cè)莓茶的健康功效可能主要與“二氫楊梅素改善肝臟脂質(zhì)代謝和調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生”有關(guān)。

    為闡明這一理論假說,我們擬利用高脂誘導(dǎo)的動(dòng)物模型,研究二氫楊梅素對(duì)NAFLD發(fā)生中脂代謝及肝纖維化的作用,并進(jìn)一步通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn),研究二氫楊梅素對(duì)肝星狀細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)的影響,并闡明腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/Smad介導(dǎo)的相關(guān)信號(hào)通路在其中的作用。本課題研究結(jié)果將為NAFLD防治提供新的膳食營(yíng)養(yǎng)干預(yù)策略。@實(shí)驗(yàn)方法

    取8周齡的雄性129野生型小鼠40只,隨機(jī)分為4組,每組10只,干預(yù)持續(xù)12周。①SD組:給予基礎(chǔ)飼料;②HFD組:給予高脂飼料;③HFD+DHM組:給予含有0.6%DHM的高脂飼料(相當(dāng)于);④DHM組:給予含有0.6%DHM的基礎(chǔ)飼料。

    利用高脂膳食誘導(dǎo)小鼠建立動(dòng)物模型,檢測(cè)二氫楊梅素(DHM)干預(yù)后對(duì)肝臟脂質(zhì)沉積、血脂譜、肝臟炎癥、肝纖維化發(fā)生等的影響;利用大鼠原代肝星狀細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞株HSC T6,DHM干預(yù)后,CCK 8法檢測(cè)細(xì)胞活力;Annexin V FITC/PI染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期;免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)活化蛋白a-SMA的表達(dá);ELISA法檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)COL-I、COL-III、TIMP-1及MMMP-1產(chǎn)生水平;qRT-PCR和We.stem Blot分別檢測(cè)AMPK、Smad家族蛋白及細(xì)胞外基質(zhì)基因mRNA和蛋白的表達(dá);進(jìn)而利用AMPK激動(dòng)劑(AICAR)和AMPK抑制劑(CompoundC)及AMPK和Smad7的siRNA干預(yù)HSC-T6細(xì)胞株,qRT-PCR和We.stem Blot法分別檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)及相關(guān)基因mRNA和蛋白的表達(dá)。

    主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    二氫楊梅素能夠改善肝臟脂代謝及延緩高脂誘導(dǎo)的NAFLD進(jìn)程

    通過建立高脂誘導(dǎo)小鼠模型,DHM干預(yù)后能夠顯著抑制小鼠體重增加,減少肝臟脂肪蓄積(圖1),改善血脂譜,減輕肝臟炎癥損傷和抑制肝谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平升高(圖2),并能夠改善肝纖維化程度(圖3)。結(jié)果表明:DHM能夠改善肝臟脂代謝及延緩高脂誘導(dǎo)的NAFLD進(jìn)程。

    二氫楊梅素能夠顯著抑制肝星狀細(xì)胞活化并調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)水平,可能與其對(duì)Smads蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用有關(guān)

    利用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1誘導(dǎo)原代肝星狀細(xì)胞(HSC)和HSC-T6細(xì)胞株建立細(xì)胞模型,DHM處理后能明顯抑制TGF-β1誘導(dǎo)的原代HSC細(xì)胞和HSC-T6細(xì)胞株的增殖活化,調(diào)節(jié)細(xì)胞周期,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,降低COL-I和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物TIMP 1及增加基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1等細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生,降低肝星狀細(xì)胞內(nèi)a-平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SMA)的表達(dá)。同時(shí),DHM還能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的COL-I、Smad3、Smad4的mRNA表達(dá)水平增加及MMP-1和Smad7的mRNA表達(dá)水平降低。最后DHM能抑制TGF-β1對(duì)HSC-T6細(xì)胞腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、Smad2/3、Smad4、Smad7蛋白表達(dá)的影響。

    二氫楊梅素通過促進(jìn)AMPK磷酸化及Smad7表達(dá),進(jìn)而抑制Smad4表達(dá)和Smad2/3磷酸化,最終減少TGF-β1誘導(dǎo)的HSC中ECM分泌和HSC活化

    采用AMPK抑制劑或siRNA分別抑制或沉默AMPK表達(dá)后,DHM對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HSC中Smad2/3磷酸化及Smad4和Smad7蛋白表達(dá)的影響被抑制;而利用AMPK激動(dòng)劑AICAR預(yù)處理后,DHM能夠協(xié)同AICAR促進(jìn)AMPK磷酸化、減少Smad2/3的磷酸化和Smad4蛋白表達(dá)及增加Smad7蛋白表達(dá)水平。以上結(jié)果提示:AMPK在介導(dǎo)DHM對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)HSC細(xì)胞內(nèi)Smad2/3磷酸化及Smad4和Smad7表達(dá)的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。利用siRNA沉默Smad7基因表達(dá)后,DHM對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞中COL-I、COL-III和TIMP-1 mRNA表達(dá)的抑制及對(duì)MMP 1 mRNA的促進(jìn)作用被削弱,提示Smad7在DHM調(diào)節(jié)HSC細(xì)胞ECM的mRNA表達(dá)中起關(guān)鍵作用。

    結(jié)論

    二氫楊梅素能夠調(diào)節(jié)肝臟脂代謝,減少肝脂質(zhì)沉積及改善NAFLD肝纖維化,并可能通過AMPK/Smad信號(hào)通路抑制肝星狀細(xì)胞活化及調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)水平,延緩NAFLD進(jìn)程。

    創(chuàng)新性

    本課題率先提出“莓茶可能具有防治NAFLD的功效”的理論假說,并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)莓茶中的主要天然活性成分二氫楊梅素具有改善肝臟脂代謝、減少肝脂質(zhì)沉積及調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生的作用。研究結(jié)果證實(shí)了本課題的理論假說。

    本研究通過實(shí)驗(yàn)研究,率先發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素能夠改變高脂誘導(dǎo)動(dòng)物的血脂譜,減少肝臟脂質(zhì)沉積和炎性反應(yīng),延緩肝纖維化進(jìn)程,并可能通過促進(jìn)肝星狀細(xì)胞AMPK磷酸化及Smad7表達(dá),進(jìn)而抑制Smad4表達(dá)和Smad2/3磷酸化,最終調(diào)節(jié)TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因表達(dá),調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生。研究結(jié)果初步闡明了二氫楊梅素調(diào)節(jié)脂代謝和細(xì)胞外基質(zhì)的作用機(jī)制,為其防治NAFLD提供了科學(xué)依據(jù)。

    小結(jié)

    二氫楊梅素是天然植物莓茶中富含的主要多酚類植物化學(xué)物,來源經(jīng)濟(jì)方便,人體食用安全。本課題為NAFLD人群(包括NAFLD肝纖維化患者)提供了新的膳食營(yíng)養(yǎng)干預(yù)策略。

    本課題研究為莓茶的保肝和抗纖效果提供了科學(xué)依據(jù),同時(shí)為基于莓茶的功能性食品研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

    本課題初步揭示了二氫楊梅素的作用分子機(jī)制,為NAFLD防治研究提供了新的研究思路和干預(yù)靶點(diǎn)。

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