質(zhì)譜法分析大腸癌組織中親核蛋白A的蛋白質(zhì)變體

洪欣

摘 要 采用超濾、 親和層析和雙向電泳分離并純化了人大腸癌組織中的親核蛋白，結(jié)合蛋白印跡分析，發(fā)現(xiàn)親核蛋白存在幾個(gè)蛋白質(zhì)變體的現(xiàn)象。采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜以及電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)親核蛋白的主要蛋白質(zhì)變體的胰酶水解肽段進(jìn)行了一級(jí)結(jié)構(gòu)的解析， 發(fā)現(xiàn)大腸癌組織中的親核蛋白主要存在N端乙酰化（Ac1Met及脫去N端甲硫氨酸后的Ac2Val）、 5Thr的磷酸化等修飾狀態(tài)，這些修飾形式單獨(dú)或者相互組合構(gòu)成了親核蛋白的主要蛋白質(zhì)變體。此外，在親核蛋白中還發(fā)現(xiàn)一些氧化修飾和脫氨基修飾的情況。研究表明，利用質(zhì)譜及串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，能夠快速、 準(zhǔn)確地鑒定人大腸癌組織中分離得到的親核蛋白的幾種蛋白質(zhì)變體。

關(guān)鍵詞 質(zhì)譜； 親核蛋白； 大腸癌； 乙?；?； 磷酸化

1 引 言

親核蛋白在從細(xì)菌到人類的幾乎所有生物體內(nèi)普遍存在， 是具有多種生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)。其結(jié)構(gòu)高度保守，屬于具有催化含脯氨酸的寡肽底物順?lè)串悩?gòu)作用的肽脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶（Peptidylprolyl cistrans isomerases， PPIase）。最初發(fā)現(xiàn)其能與一種免疫抑制劑環(huán)孢素A （Cyclosporin A， CsA）特異性結(jié)合， 故將其命名為親環(huán)蛋白（Cyclophilin）。目前發(fā)現(xiàn)， 親環(huán)蛋白家族成員廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)和細(xì)胞核、 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、 線粒體及葉綠體等細(xì)胞器中。其中，人親環(huán)蛋白A主要位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，在抑制T細(xì)胞活化信號(hào)的傳導(dǎo)、 肽基脯氨酸順?lè)串悩?gòu)酶活性、 蛋白折疊、 分子伴侶活性等方面具有重要作用。近來(lái)的研究表明，親核蛋白A與多種類型惡性腫瘤的發(fā)生、 侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1]。例如，在手術(shù)切除后進(jìn)行化療的惡性卵巢癌患者組織中的親核蛋白水平與后續(xù)化療的療效密切相關(guān)[2]。在腸型和彌散型胃腺癌患者組織中，親核蛋白A的表達(dá)與正常胃粘膜組織相比呈明顯上調(diào)趨勢(shì)[3]。對(duì)結(jié)直腸癌患者手術(shù)切除組織的蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果顯示，親核蛋白A在腫瘤區(qū)域的表達(dá)水平明顯高于正常癌旁組織[4]。將親核蛋白A以及其它家族成員作為腫瘤治療靶點(diǎn)已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[5]。

蛋白質(zhì)乙酰化是在乙?；D(zhuǎn)移酶的作用下，在蛋白質(zhì)N端α氨基或賴氨酸側(cè)鏈ε氨基上共價(jià)結(jié)合乙酰基的過(guò)程，是細(xì)胞控制基因表達(dá)、 蛋白質(zhì)活性或生理過(guò)程的一種重要機(jī)制[6]。與絕大多數(shù)蛋白類似，親核蛋白能夠被乙?；揎?，從而影響其生物學(xué)功能。有研究表明，親核蛋白A的乙?；揎椖軌虼龠M(jìn)其分泌，并且對(duì)于血管細(xì)胞的活化起著重要作用[7]。目前，關(guān)于親核蛋白A在腫瘤研究領(lǐng)域的報(bào)道大多集中于親核蛋白A在腫瘤組織中表達(dá)水平的變化，體現(xiàn)的是親核蛋白A各個(gè)蛋白質(zhì)變體的綜合變化結(jié)果。而對(duì)于蛋白質(zhì)變體類型， 特別是乙?；揎椀牡鞍踪|(zhì)變體在腫瘤組織中的表達(dá)狀態(tài)以及相應(yīng)的分子機(jī)制方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，研究親核蛋白A的乙?；揎?，特別是腫瘤等病理?xiàng)l件下的親核蛋白A的乙?；癄顟B(tài)，對(duì)于深入認(rèn)識(shí)腫瘤的發(fā)病、 轉(zhuǎn)移機(jī)理和研發(fā)新的抗腫瘤藥物具有重要的指導(dǎo)作用。

現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)飛速發(fā)展，在生命科學(xué)領(lǐng)域得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用[8～11]。應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)，不僅可以對(duì)蛋白質(zhì)等生物大分子進(jìn)行定性和定量的分析，還可對(duì)蛋白質(zhì)的各種翻譯后修飾進(jìn)行精確的定位[12～14]，質(zhì)譜技術(shù)已經(jīng)逐步發(fā)展成為蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究中最重要的分析手段。本研究采用超濾、 親和層析和雙向電泳分離并純化人大腸癌組織中的親核蛋白，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDITOF）以及電噴霧（ESI）串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)初步分離純化的親核蛋白進(jìn)行分析，鑒定了親核蛋白中N端乙酰化、 5Thr的磷酸化等幾種修飾狀態(tài)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Autoflex MALDITOF質(zhì)譜儀（德國(guó)Bruker Daltonics公司）； TripleTOF 5600質(zhì)譜儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）； 納升高效液相色譜儀（美國(guó)Eksigent Technologies公司）； Optima L100K超速離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coμlter公司）； PROTEAN i12等電聚焦電泳系統(tǒng)、 MiniPROTEAN Tetra Cell垂直電泳系統(tǒng)（美國(guó)BioRad公司）； C18毛細(xì)管色譜柱 （15 cm×75 μm，實(shí)驗(yàn)室自制）； Aurum AffiGel Blue Gel層析柱（美國(guó)BioRad公司）； 超濾離心管（MWCO 30 kDa，MWCO 3 kDa，美國(guó)Pall公司）； IPG預(yù)制膠條（7 cm，pH 3～10，美國(guó)BioRad公司）； BCA蛋白定量試劑盒（美國(guó)Pierce Chemicals公司）； 測(cè)序級(jí)TPCK修飾的胰蛋白酶（美國(guó)Promega公司）； a氰基4羥基肉桂酸（CHCA）＼， 尿素、 三羥甲基氨基甲烷（Tris）、 二硫蘇糖醇（DTT）、 TFA、 碘乙酰胺（IAA）、 乙腈、 苯甲基磺酰氟（PMSF）等試劑均購(gòu)自Sigma公司； 聚偏氟乙烯（PVDF）膜（美國(guó)Millipore公司）； 抗PPIA單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）； 增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物試劑（ECL Prime，美國(guó)GE Healthcare公司）； 其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。實(shí)驗(yàn)用水為MilliQ純水儀（美國(guó)Millipore公司）制備的超純水。

2.2 親核蛋白的分離純化

大腸癌組織樣本取自吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院就診并手術(shù)治療的大腸癌患者。標(biāo)本離體后，立即用生理鹽水將血液沖凈，加入少許液氮冷凍，再研磨成粉末狀。加入10倍體積的含15 mmol/L TrisHCl（pH 7.2），0.5 mmol/L蛋白酶抑制劑Phenylmethanesulfonyl fluoride （PMSF） 的生理鹽水，4℃下勻漿，以10000 g離心15 min，棄去沉淀。上清液于4℃， 以40000 r/min離心1 h，棄去沉淀。上清液用0.45 μm濾器過(guò)濾，濾液加到截留分子量為30 kDa的超濾離心管中，8000 g離心30 min，收集濾過(guò)液。將濾過(guò)液加到截留分子量為3 kDa的超濾離心管中，8000 g離心30 min，向濃縮的截留液中補(bǔ)充加入適量10 mmol/L KH2PO4緩沖液（pH 7.2），8000 g離心30 min，進(jìn)行緩沖液替換，重復(fù)3次。收集濃縮截留液，在預(yù)先平衡好的Aurum AffiGel Blue Gel層析柱上樣，依次用10 mmol/L KH2PO4緩沖液（pH 7.2）、 100 mmol/L KH2PO4緩沖液（pH 7.2）洗滌后，以300 mmol/L KH2PO4緩沖液（pH 7.2）洗脫，收集洗脫組分，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，分裝， 于 80℃保存。endprint

2.3 2二維電泳和蛋白印跡分析

取含10 μg蛋白的樣品溶液，加入10倍體積的 20℃預(yù)冷丙酮，充分混勻， 20℃靜置過(guò)夜。4℃下8000 g離心20 min，棄上清液。將蛋白沉淀溶解于水化上樣緩沖液（8 mol/L 尿素，30 mmol/L TrisHCl，0.5% 兩性電解質(zhì)，微量溴酚蘭），水化上樣于pH 3～10的膠條（17 cm）后，進(jìn)行等電聚焦電泳分離（60000 v.h）。將膠條依次用含有1% DTT和2.5% IAA的平衡母液（6 mol/L 尿素， 50 mmol/L TrisHCl，30% 甘油，2% SDS，微量溴酚蘭）平衡后，轉(zhuǎn)移至15% 的SDSPAGE凝膠頂部，用0.7% 低熔點(diǎn)瓊脂糖進(jìn)行封膠固定后，使用垂直電泳儀進(jìn)行分離。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。清洗PVDF膜、 用BSA封閉后，與抗PPIA單克隆抗體在室溫孵育2 h。將膜充分清洗后，再與HRP標(biāo)記的兔抗鼠二抗在室溫孵育2 h。將PVDF膜充分清洗后，利用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）底物進(jìn)行檢測(cè)，使用凝膠成像儀記錄蛋白印跡信號(hào)。相同條件下，重復(fù)進(jìn)行一次二維電泳（2 DE）的分離，電泳結(jié)束后，膠片用考馬斯亮藍(lán)R250染色，然后用掃描儀進(jìn)行掃描。

2.4 蛋白質(zhì)樣品的膠內(nèi)酶解

參照以上蛋白印跡結(jié)果，將未轉(zhuǎn)膜電泳凝膠上對(duì)應(yīng)的親環(huán)蛋白點(diǎn)取下，分別轉(zhuǎn)移至新的微量離心管中。經(jīng)脫色、 DTT還原和IAA烷基化，在37℃，用新配制的含測(cè)序級(jí)胰蛋白酶的50 mmol/L NH4HCO3溶液進(jìn)行膠內(nèi)水解16 h。加入少量 10%乙酸終止反應(yīng)，上清液分裝凍干后于 20℃保存。

2.5 質(zhì)譜分析

2.5.1 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDITOF MS） 將凍干樣品用基質(zhì)溶液（50%ACN， 0.1% TFA， 10 mg/mL CHCA）溶解，取0.5 μL點(diǎn)樣于樣品靶上，室溫自然干燥。利用Autoflex MALDITOF質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。用肽段校正標(biāo)準(zhǔn)品（Angiotensin Ⅱ， AngiotensinⅠ， Substance P， Bombesin， ACTH clip 1～17， ACTH clip 18～39， Somatostatin 28）作外標(biāo)，對(duì)質(zhì)譜儀進(jìn)行校正。采用陽(yáng)離子反射模式，加速電壓20 kV，延遲時(shí)間100 ns，激光頻率20 Hz。每張譜圖累積100次，每個(gè)樣品采集3～5個(gè)譜圖。

2.5.2 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜 （LCMS/MS） 樣品用流動(dòng)相A（水乙腈，99∶1，V/V，0.1%甲酸）溶解后，采用C18毛細(xì)管色譜柱 （15 cm×75 μm，實(shí)驗(yàn)室自制）進(jìn)行分離。流動(dòng)相B為乙腈水（99∶1，V/V，0.1%甲酸）。梯度洗脫條件： 0～60 min， 0～45% B； 60～61 min， 45% B； 61～62 min， 45%～90% B； 62～71 min， 90% B。利用TripleTOF 5600質(zhì)譜儀對(duì)反相色譜洗脫出的肽段進(jìn)行分析，質(zhì)譜采集模式為信息依賴分析方式（Information dependent analysis， IDA）。納升噴霧離子源的噴霧電壓為2.4 kV，每個(gè)質(zhì)譜采集循環(huán)包括一個(gè)全譜掃描和30個(gè)子離子掃描。全譜掃描范圍m/z 350～1250，掃描時(shí)間為300 ms。每張串聯(lián)譜的掃描范圍m/z 100～1800，采集累積時(shí)間為100 ms，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為15 s。

2.6 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索

將所得LCMS/MS質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)文件（.wiff和.wiff.scan文件）用Protein Pilot 5.0（AB Sciex， USA）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，所用數(shù)據(jù)庫(kù)為UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的人種屬（Homo sapiens）亞庫(kù)。檢索參數(shù)設(shè)置如下：胰蛋白酶切、 乙?；瘡?qiáng)調(diào)和生物學(xué)修飾，假陽(yáng)性率控制為1% FDR。

3 結(jié)果與討論

3.1 大腸癌組織親核蛋白同源異構(gòu)體的分離及蛋白印跡分析

大腸癌組織手術(shù)標(biāo)本離體后，迅速置于液氮中研磨成粉末狀。加入抽提液后勻漿，超速離心得上清液。利用不同截留分子量的超濾離心管處理上清液，得到3～30 kDa蛋白組分。再利用裝填有Cibacron Blue F3GA的Aurum AffiGel Blue Gel層析柱親和純化親核蛋白。Cibacron Blue F3GA是一種活性色素，能夠特異地結(jié)合一些蛋白，常被用作親和純化特殊蛋白，如各種細(xì)胞因子和一些酶類分子。2DE分離、 蛋白印跡分析（圖1）結(jié)果表明，共有兩個(gè)較明顯的蛋白印跡點(diǎn)，其分子量基本相近（20 kDa附近）。對(duì)照蛋白印跡結(jié)果，找到了雙向電泳凝膠上對(duì)應(yīng)的蛋白點(diǎn)（P1，P2）。

3.2 親核蛋白的質(zhì)譜分析

將考染后的凝膠上與蛋白印跡上的親核蛋白A顯色信號(hào)對(duì)應(yīng)的蛋白點(diǎn)（圖1B中的P1、 P2點(diǎn)）取下，分別進(jìn)行脫色、 膠內(nèi)水解，得到酶解肽段。首先，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，得到這兩個(gè)蛋白點(diǎn)的肽指紋圖譜（圖2）。由圖2可見(jiàn)，兩個(gè)蛋白點(diǎn)的肽指紋圖譜大致相似，說(shuō)明很可能來(lái)源于同一蛋白而互為同源異構(gòu)體，這與蛋白印跡的結(jié)果相互印證吻合。與親核蛋白序列的理論酶切肽段的質(zhì)荷比（m/z）對(duì)比，對(duì)一級(jí)質(zhì)譜圖中絕大多數(shù)分子離子峰進(jìn)行了歸屬（表1）。

值得注意的是，圖2的兩個(gè)質(zhì)譜圖中除了大部分共有的相同多肽的分子離子峰，還存在一些有明顯差異的信號(hào)峰，如圖2A中的m/z 1987.9、 2118.8和2134.8，圖2B中m/z 1732.9和1946.0。由表1可知，圖2B中m/z 1946.0的峰歸屬為2VNPTVFFDIAVDGEPLGR19，圖2A中的m/z 1987.9與1946.0相差41.9 Da，推測(cè)圖2A中的m/z 1987.9很可能為2VNPTVFFDIAVDGEPLGR19的乙?；揎椥问?。利用液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)來(lái)自P1和P2兩個(gè)蛋白點(diǎn)的酶解樣品進(jìn)行了分析，在P1樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)中找到m/z 994.5的雙電荷分子離子峰（對(duì)應(yīng)圖2A中的m/z 1987.9）所產(chǎn)生的二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜圖（圖3A）。在P2樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)中找到m/z 973.5的雙電荷分子離子峰（對(duì)應(yīng)為圖2B中的m/z 1946.0）所產(chǎn)生的二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜圖（圖3B）。其中，圖3B中的大多數(shù)碎片離子都?xì)w屬為2VNPTVFFDIAVDGEPLGR19的b、 y系列離子。圖3A中較多和3B中相同的碎片離子，也都?xì)w屬為y系列碎片離子，如y1～y13。圖3A中還有一系列碎片離子，分別比3B中b系列離子多42。因此，親核蛋白P1切去N端甲硫氨酸后，在2Val的N端發(fā)生了乙酰化修飾； 親核蛋白P2的N端則未發(fā)生乙酰化。除了以上帶2個(gè)電荷的分子離子（m/z 994.5和973.5）外，還檢測(cè)到了相對(duì)應(yīng)的帶3個(gè)電荷的分子離子峰（m/z 663.3和649.3），對(duì)其二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析也證實(shí)了以上結(jié)論。此外，在圖2B中有一個(gè)非常明顯的m/z 1732.9的分子離子峰，而在圖2A中沒(méi)有或豐度很小。通過(guò)分析，推測(cè)為N端序列VNPTVFFDIAVDGEPLGR分子內(nèi)斷裂產(chǎn)物PTVFFDIAVDGEPLGR，它是由于質(zhì)譜的源內(nèi)裂解而產(chǎn)生的。endprint

此外，在P1樣品的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)中， m/z 1060.0雙電荷的分子離子峰（對(duì)應(yīng)為圖2A中m/z 2118.8）所產(chǎn)生的二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜圖如圖4A。對(duì)比圖4A和圖3，二者擁有許多相同的碎片離子，且都為y系列離子。這說(shuō)明圖4A所對(duì)應(yīng)的肽段很有可能與圖3的非常相似。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步分析，推測(cè)其氨基酸序列應(yīng)為Ac1MVNPTVFFDIAVDGEPLGR19，即N端甲硫氨酸未被切去且被乙?；揎?。將圖4A中m/z 130～300局部區(qū)間放大（圖4B），可以更清楚地看到一些N端序列碎片離子。其中，m/z 174和273的碎片分別歸屬為b1和b2離子。因此，圖2A中的m/z 2118.8離子被歸屬為Ac1MVNPTVFFDIAVDGEPLGR19。 m/z 2134.8與2118.8相差16 Da，其對(duì)應(yīng)為相同多肽序列被氧化修飾的產(chǎn)物。

將LCMS/MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果，與以上關(guān)于親核蛋白N端乙?；揎椀姆治鼋Y(jié)果一致。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，在親核蛋白P1的N端序列中還鑒定到一個(gè)磷酸化修飾位點(diǎn)5Thr（圖5）。圖5A是m/z 681.3的三電荷分子離子的串聯(lián)質(zhì)譜圖，歸屬的肽段序列為1VNP*T*VFFDIAVDGEPLGR19（P*為氧化的Pro，T*為磷酸化的Thr）。檢索軟件基于Paragon算法給出的Peptide score為16，Peptide confidence為99。圖5B則為m/z 725.0的三電荷分子離子的串聯(lián)質(zhì)譜圖，歸屬的肽段序列也是5Thr 被磷酸化修飾的1MVNP*T*VFFDIAVDGEPLGR19。與圖5A相比，差別在于N端的甲硫氨酸（1M）未被切除。檢索軟件基于Paragon算法給出的Peptide score為15，Peptide confidence值為99。盡管這兩個(gè)磷酸化修飾肽段的信號(hào)強(qiáng)度并不高，但肽段檢索的Peptide confidence值達(dá)到99，說(shuō)明結(jié)果可信。在MALDI MS中沒(méi)有檢測(cè)到這兩個(gè)磷酸化肽段的信號(hào)，這可能是由于多肽被磷酸化后，引入了負(fù)電荷，在正離子模式的MALDI MS中，其信號(hào)會(huì)顯著減弱； 另外，在MALDI MS中，樣品中所有多肽（磷酸化和未磷酸化的）同時(shí)在基質(zhì)中被激光能量輔助離子化，帶有負(fù)電荷的磷酸化肽段的離子化效率很低，這經(jīng)常導(dǎo)致在MALDI MS中檢測(cè)不到磷酸化多肽。

研究發(fā)現(xiàn)，大腸癌組織中的親核蛋白存在蛋白變體形式（表2），這些蛋白變體在靠近蛋白質(zhì)N端附近的序列存在至少6種不同的修飾類型。其中，在P1蛋白點(diǎn)中檢測(cè)到了5種修飾類型，在P2蛋白點(diǎn)中只檢測(cè)到1種。在P1和P2蛋白點(diǎn)中都未檢測(cè)到N端甲硫氨酸（M）未切除且未被乙?；揎椀碾亩?，即2MVNPTVFFDIAVDGEPLGR19。

4 結(jié) 論

采用超濾、 親和層析分離純化人大腸癌組織中的親核蛋白，并通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜和電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)親核蛋白胰酶水解肽段進(jìn)行分析。結(jié)果表明，大腸癌組織中的親核蛋白存在N端乙?；ˋc1Met及脫去N端甲硫氨酸后的Ac2Val）、 5Thr的磷酸化、 4Pro的氧化等不同修飾狀態(tài)，這些修飾形式單獨(dú)或者相互組合，構(gòu)成了親核蛋白的主要蛋白變體。本方法為進(jìn)一步研究不同病理進(jìn)程的大腸癌組織中親核蛋白不同蛋白變體的類型、 組成、 修飾狀態(tài)與其生物學(xué)活性關(guān)系的研究提供了理論依據(jù)。

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Abstract Cyclophilin A was isolated from human colorectal carcinoma tissues by ultrafiltration， affinity chromatography， and two dimensional electrophoresis. By the aid of Western blot analysis， several isoforms of cyclophilin A were detected.， The tryptic digests from cyclophilin A were analyzed by matrixassisted laser desorption ionization timeofflight mass spectrometry as well as electrospray tandem mass spectrometry techniques. Several different modifications such as Nterminal acetylation （Ac1Met and Ac2Val） and phosphorylation of 5Thr were identified from these isoforms of cyclophilin A， which represented the majority of the proteoforms of cyclophilin A in this study. In addition， other kinds of modifications such as oxidation and deamidation were also found in these proteoforms. The results indicated that the developed method could be used to rapidly and correctly identify the several proteoforms of cyclophilin A isolated from human colorectal carcinoma tissues.

Keywords Mass spectrometry； Cyclophilin A； Colorectal carcinoma； Acetylation； Phosphorylation

（Received 6 November 2017； accepted 14 December 2017）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 81572082） and the Jilin Province Science and Technology Department （Nos. 20150414015GH， 2011713）.endprint