二甲雙胍對人臍帶間充質(zhì)干細胞形態(tài)、增殖、表面標(biāo)志及細胞周期的影響

弓勛 云升

人臍帶間充質(zhì)干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSC）是一類特殊細胞，具有可獲得性、可擴增性及多向分化能力[1]，還具有免疫調(diào)節(jié)作用，以及對損傷部位、炎性部位和腫瘤組織較為特異的趨向性[2]。MSC可直接抑制腫瘤細胞生長及惡性表達[3]，降低其侵襲性及生長增殖力[4]，還可促進腫瘤細胞凋亡[5]。因此其成為腫瘤靶向治療的理想載體，傳遞和表達多種抗腫瘤治療因子，參與抗腫瘤藥物的運輸、免疫應(yīng)答的激活以及新生血管的抑制[6]。與骨髓間充質(zhì)干細胞相比較，hUC-MSC取材方便，沒有倫理限制，來源豐富[7]，且具有更低的免疫原性、更短的增殖時間和更強的增殖性[8]。

二甲雙胍（metformin，METF）是目前治療糖尿病的一線藥物，研究表明，METF抑制電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅰ減少胞內(nèi)能量進而活化腺苷酸依賴的蛋白激酶[9]，并抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白發(fā)揮抗衰老作用[10]，同時METF還具有線粒體低毒興奮效應(yīng)[11]、促進線粒體生物合成[12]、自體吞噬[13]和介導(dǎo)mRNA表達，從而達到對抗衰老，延長生命的作用。已被證實的包括：骨骼肌細胞、肝細胞、胰腺β細胞、小膠質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞、皮層神經(jīng)元細胞[14]、秀麗隱桿線蟲[15]及亨廷頓疾病模型小鼠[16]。本實驗旨在明確METF對hUC-MSC是否具有抗衰老的作用，為間充質(zhì)干細胞及METF更廣泛的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、材料

1.實驗材料：臍帶取自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，經(jīng)產(chǎn)婦同意后取足月剖宮產(chǎn)后新生兒完整臍帶，用PBS保存，鹽酸二甲雙胍片（中美施貴寶制藥公司）。

2.實驗試劑：DMEM-LG低糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶（美國Gibco公司），胎牛血清（美國HyClone公司），MTT試劑盒（北京博奧拓達科技有限公司），碘化丙啶/核糖核酸酶染色溶液、Anti-human CD34 PE、Anti-human CD44 FITC、Anti-human CD90 APC、Anti-human CD105 PE 、Anti-human HLA-DR PerCP、Mouse IgG1 FITC（美國BD公司）。

二、實驗方法

1. hUC-MSC分離、培養(yǎng)與傳代：取新生兒臍帶，在無菌條件下，用含雙抗（青霉素、鏈霉素）的PBS反復(fù)沖洗后保留沃頓膠剪碎等距分散平鋪至培養(yǎng)皿，加入含有10%胎牛血清的DMEM-LG低糖培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 ～ 3天換液1次，細胞融合達80%后用0.25%胰蛋白酶消化并傳代。細胞培養(yǎng)至第6代，增殖速度下降，顯微鏡下見部分呈細胞扁平狀，細胞核附近出現(xiàn)黑色顆粒，考慮細胞老化。

2. MTT比色法檢測增殖率：取第6代對數(shù)生長期hUC-MSC制備單細胞懸液，接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后去除培養(yǎng)基，制備為單細胞懸液后分為對照組及實驗組，對照組不加入藥物，實驗組加入含不同濃度METF（格華止，規(guī)格：0.5 g，批號：H20023370）的培養(yǎng)基，按照藥物濃度分為0.1 mmol/ L組、1 mmol/L組、5 mmol/L組、10 mmol/ L組、20 mmol/L組，每組6個平行復(fù)孔，加入含藥培養(yǎng)基后的24、48、72 h加入5 mg/ml MTT溶液20 μl/孔，培養(yǎng)4 h，去上清液，加DMSO震蕩，用酶標(biāo)儀檢測其在490 nm處的吸光度（OD值）。通過OD平均值計算相對增殖率，相對增殖率 =（實驗組OD值 /陰性對照組OD值）×100%。

3.流式細胞儀檢測細胞表面標(biāo)記：取第6代hUC-MSC制備單細胞懸液，均分接種于6孔板，細胞貼壁后對照組中加入完全培養(yǎng)基，實驗組加入不同濃度METF培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，將各組細胞分3組進行染色，1組同型對照，加入IgG1，2組陰性配色，分別加入CD34、HLA-DR，3組陽性配色，分別加入CD44、CD90、CD105，避光孵育，離心去上清后加入PBS重懸細胞，濾后上流式細胞儀采用Cellquest進行分析。

4.流式細胞儀檢測周期：取第6代細胞制備單細胞懸液，接種于6孔板，細胞貼壁后對照組加入完全培養(yǎng)基，實驗組加入不同濃度METF培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，用胰酶消化離心后去上清，加入預(yù)冷的PBS沖洗細胞，用1 ml預(yù)冷PBS重懸細胞，緩慢將細胞懸液滴入3 ml預(yù)冷的無水乙醇中，至終濃度為75%，置于4 ℃避光固定18 h。取固定好的細胞，用預(yù)冷的PBS沖洗后重懸細胞，將各組細胞懸液分別置于1.5 ml EP管中，標(biāo)記并分別加入0.5 ml PI/ RNase染液，室溫避光染色15 min，過濾后用流式細胞儀分析細胞周期比例計算增殖指數(shù)，增殖指數(shù)（PI）=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

結(jié) 果

一、hUC-MSC形態(tài)分析

通過顯微鏡觀察，0.1 mmol/L組、1 mmol/L組第7代hUC-MCS細胞形態(tài)呈梭形，大小較均等，細胞數(shù)量呈倍數(shù)增加，呈平行或旋渦狀生長，細胞形態(tài)未見顯著改變。5 mmol/L組細胞形態(tài)開始改變，培養(yǎng)24 h后可見多角形細胞，細胞大而扁平，細胞核周黑色顆粒增多，48 h后細胞增大呈扁平不規(guī)則，細胞數(shù)量逐漸減少。10 mmol/L組、20 mmol/L組細胞呈不規(guī)則形，不再呈平行或旋渦狀排列，隨著藥物濃度的增加，死亡細胞數(shù)量增多，培養(yǎng)48 h、72 h后細胞開始縮小，呈不規(guī)則圓形或多角形，細胞呈散在分布，周圍毛糙（圖1）。

二、MTT檢測細胞增殖率

與對照組比較，0.1 mmol/L組能夠促進hUCMSC增殖，在48 h時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。1mmol/L組、5mmol/L組、10mmol/L組在24h時hUC-MSC的增殖率增加，隨著時間延長，hUC-MSC增殖逐漸被抑制，3組增殖率比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。20mmol/L組抑制細胞增殖，且抑制作用隨時間延長而增強（表1，圖2）。

三、流式細胞儀檢測細胞表面標(biāo)記

通過流式細胞儀檢測hUC-MSC表面CD44、CD90、CD105的表達。結(jié)果顯示，不同濃度的METF對表面標(biāo)記CD44、CD90的表達均無顯著變化。0.1mmol/L組，1mmol/L組對CD105未產(chǎn)生影響，5mmol/L組，10mmol/L組，20mmol/L組隨藥物濃度增加，CD105表達逐漸減弱，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。（圖3，表2）

圖1 倒置顯微鏡下觀察各組細胞在不同濃度METF影響下的形態(tài)（×100）

表1 不同時間各組培養(yǎng)的hUC-MSC相對增殖率（n = 3，%，± s）

表1 不同時間各組培養(yǎng)的hUC-MSC相對增殖率（n = 3，%，± s）

注：與對照組比較，aP ＜ 0.05，bP ＜ 0.01

分組24 h48 h72 h對照組100100100 0.1 mmol/L組101.28±0.98104.06±1.76a101.51±0.67 1 mmol/L組116.03±1.82b84.20±1.60b70.98±2.47b 5 mmol/L組115.13±3.06b64.64±1.20b43.83±2.38b 10 mmol/L組108.37±1.26b59.69±1.90b25.58±0.61b 20 mmol/L組86.64±0.66b58.38±2.52b17.75±1.35b F值140.275442.3401668.204 P值＜ 0.01＜ 0.01＜ 0.01

圖2 MTT比色法檢測相對增殖率

表2 共培養(yǎng)24 h后不同濃度METF對hUC-MSC表面標(biāo)記的影響（n = 3，± s）

表2 共培養(yǎng)24 h后不同濃度METF對hUC-MSC表面標(biāo)記的影響（n = 3，± s）

注：與對照組比較，aP ＜ 0.05，bP ＜ 0.01

分組CD44CD90CD105對照組0.75±0.1896.96±0.44 72.80±2.90 0.1 mmol/L組0.53±0.2596.93±0.8976.75±2.15 1 mmol/L組0.53±0.0897.54±0.2272.88±2.37 5 mmol/L組0.50±0.2497.21±0.4766.52±2.70a 10 mmol/L組0.60±0.1497.47±0.31 66.74±4.33a 20 mmol/L組0.62±0.2897.67±0.2257.25±6.92b F值0.7311.23217.539 P值＞ 0.05 ＞ 0.05 ＜ 0.01

四、流式細胞儀檢測細胞周期

與對照組相比較，0.1mmol/L組G0/G1期的比例下降，但S期未見顯著影響，G2/M期比例升高。1mmol/L組，5mmol/L組，10mmol/L組，20mmol/L組隨藥物濃度升高，G0/G1期的比例逐漸升高，S期的比例逐漸下降，G2/M期未見顯著變化。通過細胞周期計算增殖指數(shù)提示0.1mmol/L組可促進hUC-MSC的增殖，隨藥物濃度增加，細胞增殖逐漸被抑制。（圖4 ～ 5，表3）

圖3 不同濃度METF對CD105的影響

圖4 不同濃度METF對hUC-MSC細胞周期的影響

圖5 不同濃度METF對hUC-MSC增殖指數(shù)的影響

表3 不同濃度METF作用48 h后hUC-MSC細胞周期的影響（n = 3，%，± s）

表3 不同濃度METF作用48 h后hUC-MSC細胞周期的影響（n = 3，%，± s）

注：與對照組比較，aP ＜ 0.05，bP ＜ 0.01

分組G0/G1（%） S（%） G2/M（%）對照組66.40±2.6529.03±3.193.56±2.20 0.1 mmol/L組64.16±1.20b29.47±1.006.37±0.40a 1 mmol/L組72.89±1.14b24.19±2.16a 2.34±1.02 5 mmol/L組73.59±1.58b20.92±0.77b5.48±0.84 10 mmol/L組 77.55±1.25b 16.32±1.10b 6.18±1.01a 20 mmol/L組 83.85±1.68b 13.68±1.67b2.47±0.23 F值 122.4561.23217.539 P值＜ 0.01 ＜ 0.01 ＞ 0.05

討 論

MSC能特異的歸巢到腫瘤及腫瘤轉(zhuǎn)移部位[17]，并通過抑制細胞增殖及癌基因的表達、減少細胞集落形成從而抑制腫瘤生長[18]，hUC-MSC與其他來源的MSC相比較，其應(yīng)用不存在倫理學(xué)爭議，來源和分離更方便。且其來源更加原始，表現(xiàn)出更類似于胚胎干細胞的基因表達譜，具有更強的增殖能力[19-20]。但隨著傳代次數(shù)的增加，hUC-MSC分化及增殖能力逐漸下降。METF最常用于2型糖尿病的治療，且其抗衰老作用已在部分組織和細胞中得以證實，但目前關(guān)于METF在干細胞領(lǐng)域發(fā)揮抗衰老作用的相關(guān)研究甚少，因此具有廣闊的研究前景。METF能夠激活A(yù)MPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及下游靶點，降低細胞凋亡，促進細胞增生，并且具有調(diào)節(jié)細胞周期等作用[18]，這與本實驗研究結(jié)果METF為0.1 mM時能促進細胞增殖相符合。

完整的細胞增殖周期為G0/G1期-S期-G2期-M期[22]，G1/S是細胞分裂和增殖的重要調(diào)節(jié)點，通過分析細胞周期，比較細胞周期分布比例，計算細胞增殖指數(shù)，可以明確藥物是否對細胞具有促進或抑制增殖作用。本實驗說明，METF濃度為0.1 mM時G0/G1期的比例下降，G2期比例增高（P＜ 0.05），說明藥物可能影響了hUC-MSC的細胞周期分布，促進hUC-MSC從G0/G1期向G2期轉(zhuǎn)化，進而促進hUC-MSC的增殖，但隨著藥物濃度的增加，細胞增殖逐漸被抑制。因此，METF對細胞周期的調(diào)節(jié)，可能是促進其增殖的機制之一。

CD44、CD90、CD105為hUC-MSC常見的表達陽性的表面標(biāo)記物，本研究結(jié)果顯示當(dāng)METF濃度為0.1 mmol/L ～ 20 mmol/L時未對CD44、CD90產(chǎn)生影響。當(dāng)METF濃度為5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L時，隨著藥物濃度的增加，CD105的表達逐漸減弱（P＜ 0.05）。而CD105是特異表達于新生血管內(nèi)皮的糖蛋白，通過與轉(zhuǎn)化生長因子β相互作用，參與了血管的發(fā)生，并與腫瘤的發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移相關(guān)[23]。CD105表達的減弱是否與METF抗腫瘤的作用相關(guān)，這需要進一步的研究。