H型高血壓合并冠心病患者外周血中EMMPRIN、ADMA、Hcy、MMPs、Treg和Th17細(xì)胞水平檢測

李松 章陳晨 宋雙雙

近年來，冠心病作為威脅人類生命安全的一大病癥，發(fā)病率在逐年提高。冠心病是由于冠狀動脈粥樣硬化導(dǎo)致血管發(fā)生阻塞引起心肌缺氧與缺血的一種病癥，該病又被稱為“缺血性心臟病”。由于該病直接影響心臟的正常工作，且在老年人群中發(fā)病率較高，容易因?yàn)榍榫w激動而導(dǎo)致猝死，因此對生命安全帶來了極大的威脅，所以對冠心病患者應(yīng)采取及時，有效的治療。H型高血壓是伴有高同型半胱氨酸血癥的一種原發(fā)性高血壓[1-5]，由于高同型半胱氨酸血癥的發(fā)病特點(diǎn)，使其成為動脈粥樣硬化的一個重要危險因素[6-8]，同時與高血壓性心臟病的發(fā)生有密切關(guān)系。

目前認(rèn)為，冠狀動脈粥樣硬化斑塊，尤其是不穩(wěn)定斑塊中基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）的活性明顯升高，其同時也是不穩(wěn)定斑塊易于破裂引發(fā)臨床冠脈事件的主要原因。細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN），又稱CD147分子，是一種高度糖基化的跨膜糖蛋白，能刺激MMPs的產(chǎn)生，同時參與多種細(xì)胞間的黏附，故與冠脈硬化斑塊的穩(wěn)定性有關(guān)。不對稱二甲基精氨酸（asymmetric dimethylarginine，ADMA）是主要的內(nèi)源性一氧化氮（NO）合酶的抑制劑，具有抗動脈粥樣硬化的作用，參與了心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和Th17細(xì)胞都是免疫細(xì)胞中重要的淋巴細(xì)胞亞群，兩者之間的平衡紊亂參與了高血壓、冠心病等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。但上述指標(biāo)與H型高血壓合并冠心病的相關(guān)性未完全清楚，對此，本研究檢測了高血壓合并冠心病患者的外周血EMMPRIN、ADMA、ADMA、同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）、Treg、Th17細(xì)胞的含量，旨在探討這些指標(biāo)與H型高血壓合并冠心病的相關(guān)性，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

資料與方法

一、一般資料

選取陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院2015年5月至2018年2月收治的84例高血壓合并冠心病患者作為研究對象，平均年齡（63.35±5.72）歲，經(jīng)過血漿Hcy含量測定，其中H型高血壓（血漿Hcy含量＞ 10 μmol/L[9]）合并冠心病患者42 例，歸為H組，非H型高血壓（血漿Hcy含量≤10 μmol/L）合并冠心病患者42 例，歸為非H組。以上患者均經(jīng)冠狀動脈造影或冠狀動脈血管CT檢查后確診為冠心病，符合《中國高血壓防治指南》中高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]，其中排除近期受到感染者、肝腎功能嚴(yán)重異常者、心肌炎患者、糖尿病患者、甲狀腺功能異常者。隨機(jī)選取同期我院收治的50例未合并高血壓的冠心病患者為冠心病組，50例未合并冠心病的高血壓患者為高血壓組，45名健康成人為對照組。H組、非H組、高血壓組的收縮壓、舒張壓顯著高于冠心病組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）；各組的性別、年齡、病程等基線資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05，表1）。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會同意，患者均簽署知情同意書。

二、方法

1.外周血EMMPRIN的表達(dá)情況以及MMPs含量的測量：（1）外周血中EMMPRIN表達(dá)情況檢測：對研究對象采集4 ml外周靜脈血，在加入枸櫞酸鈉進(jìn)行抗凝后再次加入淋巴細(xì)胞分離液，利用密度梯度離心將單核細(xì)胞進(jìn)行離心，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液密度為2×106個/L，再加入藻紅蛋白標(biāo)記的CD14熒光抗體與異硫氰酸標(biāo)記的EMMPRIN熒光抗體，在30 min后使用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）進(jìn)行多次洗滌與離心，最后使用流式細(xì)胞儀測定外周血單核細(xì)胞表面的EMMPRIN熒光強(qiáng)度，采用平均熒光強(qiáng)度（MFI）來反映EMMPRIN表達(dá)水平的強(qiáng)弱[11-14]。（2） MMPs含量的測量：收集外周靜脈血4 ml，室溫存放30 min后進(jìn)行10 min的離心，在離心后采用酶聯(lián)免疫吸附法對血清中的MMP- 1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-14的含量進(jìn)行測量[15]。

表1 各組基線資料比較

2.血漿中ADMA、Hcy水平含量的測量：對觀察組患者以及對照組空腹采集[16]外周靜脈血4 ml，進(jìn)行10 min離心后分離血漿，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法對研究對象的血漿ADMA與Hcy含量進(jìn)行測量。

3.外周血中Treg細(xì)胞含量與Th17細(xì)胞的檢測：（1）Treg細(xì)胞含量的測量：兩組研究對象樣本使用兩只FCM試管，均加入2×106個PMBC，分別對兩只試管加入CD4-FITC與CD25-PE抗體10 ml，搖勻后進(jìn)行室溫避光培育30 min，再進(jìn)行清洗，離心除去上清后加入破核固定液[17]，進(jìn)行室溫避光培育30 min后再次進(jìn)行清洗、離心除去上清液；使用250 μl磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，再使用流式細(xì)胞儀對Treg細(xì)胞含量進(jìn)行檢測。（2）Th17細(xì)胞的檢測：使用細(xì)胞凍存培養(yǎng)基[18]重懸PBMC（密度調(diào)整為2×106個/ml），加入5 μl的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑，之后放于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5 %的二氧化碳培養(yǎng)箱孵育5 h。對細(xì)胞進(jìn)行收集，清洗，離心，去除上清后加入50 μl的PBMC，再加入5 μl的CD4-Percp抗體[19]，進(jìn)行混勻，室溫避光培育30 min后再次進(jìn)行清洗，離心，除去上清，之后加入破膜固定液，室溫避光培育30 min，清洗，離心，除去上清后加入IL-17A-PE抗體，最后進(jìn)行室溫避光培育30 min，清洗離心除去上清；使用250 μl PBS重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀對Th17細(xì)胞進(jìn)行檢測。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

使用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以± s表示，采用t檢驗(yàn)；同時計數(shù)資料以χ2檢驗(yàn)與回歸分析，以P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、外周血單核細(xì)胞表面EMMPRIN的表達(dá)情況與MMPs含量的測量

結(jié)果表明，H組、非H組、冠心病組、高血壓組患者外周血單核細(xì)胞表面的EMMPRIN表達(dá)量、各MMPs含量均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。而H組、非H組、冠心病組、高血壓組患者外周血單核細(xì)胞表面的EMMPRIN表達(dá)量、各MMPs含量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。（表2）

二、血漿中ADMA、Hcy水平含量測量結(jié)果

結(jié)果表明，H組、非H組、冠心病組、高血壓組患者血漿ADMA、Hcy、Th17細(xì)胞含量高于對照組，Treg細(xì)胞含量與Treg/Th17的比值低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。且H組患者血漿ADMA、Hcy含量高于非H組、冠心病組、高血壓組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。而H組、非H組、冠心病組、高血壓組患者血漿Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞含量與Treg/Th17的比值比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。（表3）

討 論

冠心病是由于冠狀動脈粥樣硬化導(dǎo)致血管發(fā)生阻塞導(dǎo)致心肌缺氧與缺血[20]的一種病癥，該病又被稱為“缺血性心臟病”。H型高血壓是伴有高同型半胱氨酸血癥的一種原發(fā)性高血壓，血漿Hcy含量的增高是高同型半胱氨酸血癥的特點(diǎn)，Hcy能夠?qū)е卵軆?nèi)皮細(xì)胞的損傷，使得血管的正常結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而引起其功能的紊亂。由于高同型半胱氨酸血癥的發(fā)病特點(diǎn)，使其成為動脈粥樣硬化的一個重要危險因素，同時與高血壓性心臟病的發(fā)生有密切關(guān)系[21]。

表2 各組的外周血單核細(xì)胞表面EMMPRIN的表達(dá)情況與MMP含量比較（± s）

表2 各組的外周血單核細(xì)胞表面EMMPRIN的表達(dá)情況與MMP含量比較（± s）

注：EMMPRIN為細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子；MMP為基質(zhì)金屬蛋白酶。與對照組比較，P均＜ 0.05

分組例數(shù)EMMPRIN（MFI）MMP-1（ng/ml）MMP-2（ng/ml）MMP-3（ng/ml）MMP-9（ng/ml）MMP-14（ng/ml）H組4212.76±2.381.72±0.13320.58±42.53167.57±22.75427.71±54.56138.59±32.15非H組4211.89±2.871.69±0.15317.29±38.11170.87±24.67433.16±49.92140.39±32.66冠心病組5011.53±3.331.60±0.23305.87±39.89163.33±35.58420.19±59.69133.19±50.59高血壓組5011.39±3.861.58±0.29299.29±55.83156.90±38.96409.36±63.33125.16±39.83對照組45 5.34±0.270.62±0.04146.37±13.65 50.86± 6.76174.55±22.85 39.25± 7.92 F 值9.2726.79818.89325.43730.39820.351 P值＜ 0.01＜ 0.01＜ 0.01＜ 0.01＜ 0.01＜ 0.01

表3 各組血漿ADMA、Hcy、Treg、Th17細(xì)胞含量對比（μmol/L，± s）

表3 各組血漿ADMA、Hcy、Treg、Th17細(xì)胞含量對比（μmol/L，± s）

注：ADMA為不對稱二甲基精氨酸；Hcy為同型半胱氨酸；Treg細(xì)胞為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。與對照組比較，aP ＜ 0.05；與高血壓組比較，bP ＜ 0.05；與冠心病組比較，cP ＜ 0.05；與非H型比較，dP ＜ 0.05

分組例數(shù)ADMAHcyTreg細(xì)胞（%）Th17細(xì)胞（%）Treg/ Th17的比值H組4211.01±2.67abcd17.78±3.32abcd5.68±3.76a2.23±0.76a4.32±1.65a非H組427.34±1.34a6.26±2.17a5.73±2.41a2.31±0.63a4.41±1.72a冠心病組509.11±2.28a7.39±3.09a6.16±2.89a2.56±0.89a4.58±1.69a高血壓組508.89±1.89a6.89±2.38a7.09±3.23a2.19±0.91a5.06±1.89a對照組453.44±0.692.46±0.678.13±2.210.89±0.129.78±4.81 F值13.3608.96110.2698.119 21.339 P值＜ 0.01＜ 0.01＜ 0.01＜ 0.01＜ 0.01

EMMPRIN是一種基質(zhì)金屬蛋白酶的上游調(diào)控因子，可以在單核細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的形成與釋放。但是，在患者體內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子所調(diào)控的基質(zhì)金屬蛋白酶的種類并不明確，而本次研究所檢測的MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-14與冠心病病理過程存在關(guān)聯(lián)，這幾種分子能夠?qū)λ庵鄻影邏K中的細(xì)胞外基質(zhì)，給斑塊帶來破裂的風(fēng)險[22]。Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞作為CD4+T細(xì)胞的兩種分化細(xì)胞，兩者之間相互拮抗[23]。本研究結(jié)果表明H組、非H組、冠心病組、高血壓組患者外周血單核細(xì)胞表面的EMMPRIN表達(dá)量、各MMPs含量、Th17細(xì)胞含量均高于對照組，Treg細(xì)胞含量與Treg/Th17的比值低于對照組，提示冠心病、高血壓、冠心病合并高血壓患者的EMMPRIN、MMPs表達(dá)水平均上調(diào)，同時有向Th17細(xì)胞分化的趨勢，可能參與了冠心病與高血壓的發(fā)生、發(fā)展。而H組、非H組、冠心病組、高血壓組患者外周血單核細(xì)胞表面的EMMPRIN表達(dá)量、各MMPs含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），提而H型高血壓可能與EMMPRIN、MMPs、Treg/Th17無明顯相關(guān)性，未發(fā)現(xiàn)兩者表達(dá)量的高低與高血壓類型有顯著聯(lián)系。

ADMA是一種天然存在的氨基酸，能明顯抑制一氧化氮合酶，血漿ADMA 濃度過高可引起NO合成受損，同時增加內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞黏附，從而損傷內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙，引起冠心病、高血壓等心血管疾病。Hcy是體內(nèi)含硫氨基酸的重要的代謝中間產(chǎn)物之一，其含量與遺傳因素、營養(yǎng)因素、雌激素水平和年齡因素等有關(guān)。大量國內(nèi)外研究表明，Hcy含量的增高是導(dǎo)致心腦血管疾病的一個重要原因，Hcy能夠?qū)е卵軆?nèi)皮細(xì)胞的損傷，使得血管的正常結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而引起其功能的紊亂[8]。本研究結(jié)果表明H組、非H組、冠心病組、高血壓組患者外周血ADMA、Hcy含量均高于對照組，提示冠心病、高血壓、冠心病合并高血壓患者的ADMA、Hcy表達(dá)水平均上調(diào)，可能參與了冠心病與高血壓的發(fā)生、發(fā)展。值得注意的是，H組患者血漿ADMA、Hcy含量高于非H組、冠心病組、高血壓組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示H型高血壓可能與ADMA有關(guān)，這可能是由于高Hcy升高促進(jìn)ADMA的表達(dá)，引起NO的合成障礙，加重了血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。

綜上，H型高血壓合并冠心病患者外周血中EMMPRIN、MMPs、ADMA、Hcy水平明顯升高，Treg/Th17比值明顯降低，其中ADMA的升高與H型高血壓有相關(guān)性。