臍血與老人外周血中TIMP2蛋白檢測(cè)的影響因素及意義

曾桂芳 曾偉杰 蔡菲子 胡樾 張沁坤 梁曉 劉沐蕓

干細(xì)胞是具有自我更新以及多能分化潛力的一類(lèi)細(xì)胞[1]。由于干細(xì)胞類(lèi)型較多，來(lái)源廣泛，在人體內(nèi)相對(duì)容易獲得，結(jié)合它們有更新和分化的潛能，因此具有很高的研究?jī)r(jià)值，特別是針對(duì)造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesenchymal stem cell，UCMSC）和脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cell，ADSC）等，在再生醫(yī)學(xué)中廣泛應(yīng)用于各種細(xì)胞組織的再生以及損傷修復(fù)。衰老是生物體必經(jīng)的生理過(guò)程，伴隨著細(xì)胞的功能及活性逐漸發(fā)生衰減，細(xì)胞結(jié)構(gòu)也隨著衰老進(jìn)程發(fā)生明顯的變化。而具有多能分化和自我更新等優(yōu)點(diǎn)的干細(xì)胞便成為對(duì)抗衰老，延緩衰老進(jìn)程發(fā)展的首要研究目標(biāo)。在多項(xiàng)抗衰老的初步研究中，不同來(lái)源的干細(xì)胞，如骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞、ADSC、真皮間充質(zhì)干細(xì)胞等也能直接或間接發(fā)揮抗衰老作用。此類(lèi)干細(xì)胞能夠更新已經(jīng)衰老的細(xì)胞，增強(qiáng)細(xì)胞已經(jīng)衰減的功能，通過(guò)自分泌或旁分泌方式產(chǎn)生游離的各種細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，改善衰老細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，清除各種因細(xì)胞功能衰退累積的代謝廢物、毒素或氧自由基等，促進(jìn)細(xì)胞的更新和再生[2]。因此，在對(duì)抗衰老或延緩衰老的治療中，干細(xì)胞常被用作原料藥或輔藥加以使用[3]。

新生兒臍血與外周血是兩種不同成分的血液，血漿成分存在很大差異，其干細(xì)胞數(shù)量或其它細(xì)胞亞群數(shù)量[4]、血液中的細(xì)胞因子存在的種類(lèi)[5]、血漿中不同蛋白的含量均有所不同，甚至到了老年期，外周血的血漿對(duì)比臍血血漿更是存在明顯差異。相對(duì)于外周血而言，臍血中富含較多的CD34+HSC，這是一類(lèi)原始的造血細(xì)胞，自身的異質(zhì)性已經(jīng)具有更新和多普系分化能力，血液中存在的紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞等均由HSC分化產(chǎn)生，能持續(xù)不斷的為機(jī)體血液中提供新產(chǎn)生的血細(xì)胞，有研究表示增強(qiáng)HSC的功能能增強(qiáng)抗衰老的能力[6]，所以富含HSC的臍血中具有一定抗衰老的作用。而作為機(jī)體內(nèi)最大的催化酶，且為金屬蛋白酶家族的成員基質(zhì)金屬蛋白酶，具有維持細(xì)胞外基質(zhì)平衡的作用，能特異性的與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）共價(jià)結(jié)合。

TIMPs共有4種蛋白，包括TIMP1～TIMP4[7]，其中，TIMP2蛋白約22 kDa，包含194個(gè)氨基酸殘基[8]，作為可溶性的蛋白存在于機(jī)體血液中，或結(jié)合在特定的細(xì)胞膜上。有臨床研究顯示，TIMP2蛋白與癌癥的發(fā)生存在相關(guān)性，并在癌癥的提前診斷或某些器官的損傷診斷中提供參考指標(biāo)[9-10]。在人臍血中，TIMP2蛋白被證實(shí)能提高小鼠海馬體的活性，導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)能力和空間探索能力增強(qiáng)[11]，而且在不同生理時(shí)期血漿中游離的TIMP2蛋白含量存在差異，預(yù)示著人血漿中TIMP2蛋白的含量可能伴隨著人的生長(zhǎng)發(fā)育或者生老病死，利用這些潛在的作用，血漿中TIMP2蛋白同樣具有針對(duì)延緩衰老的研究?jī)r(jià)值，讓利用臍血血漿聯(lián)合干細(xì)胞抗擊衰老成為可能。但是，對(duì)于不同生理時(shí)期中的人血漿中TIMP2含量檢測(cè)并沒(méi)有報(bào)道，而且也沒(méi)有一套成熟完善的人血漿TIMP2檢測(cè)方法，不同的血液處理方式會(huì)直接影響TIMP2蛋白的檢測(cè)結(jié)果。因此，本研究針對(duì)新生兒臍血和老人外周血兩組年齡的血漿，為了能更準(zhǔn)確的反應(yīng)機(jī)體當(dāng)前的TIMP2含量，建立一套穩(wěn)定的血漿TIMP2蛋白檢測(cè)方法，同時(shí)對(duì)比臍血和老人外周血血漿中TIMP2蛋白的含量，了解TIMP2蛋白在這兩個(gè)時(shí)期的含量差異，不僅為后續(xù)TIMP2蛋白臨床研究者提供借鑒，也為T(mén)IMP2蛋白聯(lián)合干細(xì)胞治療并延緩衰老的可能性研究提供參考。

材料與方法

一、材料

（一）新生兒臍帶血

采集前獲得產(chǎn)婦及其家屬的知情和同意，并簽訂知情同意書(shū)，詳細(xì)詢(xún)問(wèn)了產(chǎn)婦的妊娠史及遺傳病史，產(chǎn)婦年齡不低于20歲，不高于40歲，孕齡不低于36周；胎兒性別不限，體重大于2 500 g且無(wú)畸形、感染和先天性疾病等；對(duì)采集的臍血進(jìn)行人類(lèi)免疫缺陷病毒、梅毒、乙肝表面抗原及丙型肝炎病毒檢測(cè)。凡是不符合以上條件的臍血均不予以采集。共采集15份，平均采集量為57 g，利用5 ml真空采血管采集。

（二）老人外周血

采集前獲得捐贈(zèng)者的知情和同意，并簽訂知情同意書(shū)，詳細(xì)詢(xún)問(wèn)捐贈(zèng)者的病史、遺傳病史，捐贈(zèng)年齡不低于60周歲，不高于80周歲，性別不限；無(wú)傳染性疾病、血液系統(tǒng)疾病、腫瘤相關(guān)疾病等；對(duì)采集的外周血進(jìn)行人類(lèi)免疫缺陷病毒、梅毒、乙肝表面抗原及丙型肝炎病毒檢測(cè)；凡是不符合以上條件的老人外周血均不予以采集。共采集15份，平均采集量為60 g，利用5 ml真空采血管采集。

（二）主要儀器和試劑

日本久保田離心機(jī)，海爾低溫冰箱，TIMP2 Human ELISA檢測(cè)試劑盒分別購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司、美國(guó)Abnova公司和英國(guó)Abcam公司。

二、方法

（一）不同離心力中TIMP2蛋白含量的檢測(cè)

取新鮮采集到的5份臍帶血和5份老人外周血，收集于50 ml離心管，立即置于離心機(jī)中進(jìn)行離心，分別用1 000×g、1 500×g、2 000×g三種不同的離心力進(jìn)行離心15 min，收集上層的全部血漿于50 ml離心管，避免收集到紅細(xì)胞，立即利用R&D Quantikine ELISA Human TIMP-2檢測(cè)試劑盒檢測(cè)TIMP2含量。

（二）不同保存溫度中TIMP2蛋白含量的檢測(cè)

另取新鮮的5份臍帶血和5份老人外周血，收集于50 ml離心管，立即進(jìn)行2 000×g離心15 min，分離血漿和紅細(xì)胞，收集上層血漿于50 ml離心管，分別置于4 ℃、-20 ℃和-80 ℃保存一周，利用R&D Quantikine ELISA Human TIMP-2檢測(cè)試劑盒檢測(cè)TIMP2含量。

（三）不同試劑盒中TIMP2蛋白含量的檢測(cè)

另取新鮮的5份臍帶血和5份老人外周血，收集于50 ml離心管，立即進(jìn)行2 000×g離心15 min，分離血漿和紅細(xì)胞，收集上層血漿于50 ml離心管，分別采用R&D systems、Abnova、Abcam三種不同的酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑盒進(jìn)行TIMP2蛋白含量檢測(cè)。

1. R&D systems TIMP-2 ELISA法：血漿樣本用稀釋液稀釋50倍，加入1 ml滅菌超純水，混勻，以RD5P稀釋液配制10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156 ng/ml梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液，每孔加入100 μl TIMP2抗體和50 μl稀釋后的血清，室溫孵育2 h，棄上清加入400 μl洗液洗4次，每孔加入200 μl生物素偶聯(lián)，室溫2 h，洗板4次，200 μl底物試劑避光30 min，50 μl終止液，酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)，計(jì)算TIMP2蛋白含量。

2. Abnova TIMP-2 ELISA法：配制10 000、5 000、2 500、1 250、625、312、156 pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)液，與樣本血漿及空白對(duì)照各100 μl分別加入96孔板中，37 ℃水浴90 min，加入100 μl TIMP2抗體，37 ℃水浴60 min，棄上清，PBS洗滌3次，每孔加入100 μl 提前水浴30 min，稀釋100倍后的二抗，37 ℃水浴30 min，棄液，洗滌5次，每孔加入90 μl顯色試劑，避光37 ℃孵育25 min，加入100 μl終止液終止顯色，酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)。

3. Abcam TIMP-2 ELISA法：配制12 000、400、133.3、44.4、14.8、4.9、1.6 pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)液，與樣本血漿及空白對(duì)照各100 μl分別加入96孔板中，室溫孵育2.5 h，棄上清，每孔300 μl PBS洗滌4次，每孔加入100 μl TIMP2抗體，室溫1 h，洗滌4次，每孔加入100 μl HRP辣根過(guò)氧化物酶，溶液室溫45 min，洗滌4次，每孔加入100 μl 底物溶液，室溫30 min，每孔加入50 μl 終止液，酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

利用Graph prism 7.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，各組TIMP2蛋白數(shù)據(jù)以± s表示。兩組均數(shù)差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組均數(shù)間差異比較采用單因素方差分析，以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、離心力對(duì)TIMP2蛋白含量的影響

利用1 000×g、1 500×g、2 000×g三種離心力，了解不同離心力對(duì)全血中TIMP2蛋白沉降的影響。結(jié)果顯示，不同離心力無(wú)論對(duì)臍血還是老人外周血中的TIMP2含量均無(wú)顯著影響，每毫升血液中的TIMP2蛋白含量相當(dāng)（表1）。

表1 不同離心力對(duì)TIMP2蛋白檢測(cè)的影響（± s）

表1 不同離心力對(duì)TIMP2蛋白檢測(cè)的影響（± s）

離心力樣本數(shù)臍血（ng/ml）老人外周血（ng/ml）1 000×g5147.23±22.5991.36±5.19 1 500×g5147.64±18.3287.70±6.97 2 000×g5145.27±20.5789.25±5.63 F值0.0021.321 P值＞ 0.05＞ 0.05

二、保存溫度對(duì)TIMP2蛋白的影響

2 000×g離心后的血漿分別置于4 ℃、-20 ℃和-80 ℃保存一周和兩周后，了解不同血漿儲(chǔ)存溫度對(duì)TIMP2蛋白的影響。結(jié)果顯示，在血漿保存一周時(shí)，不同保存溫度無(wú)論對(duì)臍血還是老人外周血中的TIMP2含量均無(wú)顯著影響，每毫升血液中的TIMP2蛋白含量相當(dāng)；在血漿保存到第二周時(shí)，- 20 ℃和-80 ℃保存的血漿檢測(cè)TIMP2蛋白含量依舊相當(dāng)，但是4 ℃組對(duì)比第1周的結(jié)果出現(xiàn)TIMP2蛋白檢測(cè)值輕微下降，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。因此，第1周內(nèi)的血漿儲(chǔ)存檢測(cè)到的TIMP2蛋白含量的數(shù)值會(huì)更接近原始血液中的真實(shí)值（表2，3）。

表2 不同溫度保存血漿1周對(duì)TIMP2蛋白檢測(cè)的影響（± s）

表2 不同溫度保存血漿1周對(duì)TIMP2蛋白檢測(cè)的影響（± s）

溫度樣本數(shù)臍血（ng/ml）老人外周血（ng/ml） 4℃5148.40±18.5070.65±11.38-20℃5151.27±18.7073.00±10.48-80℃5150.00±16.8272.42±11.59 F值0.0890.169 P值＞ 0.05＞ 0.05

表3 不同溫度保存血漿2周對(duì)TIMP2蛋白檢測(cè)的影響（± s）

表3 不同溫度保存血漿2周對(duì)TIMP2蛋白檢測(cè)的影響（± s）

溫度樣本數(shù)臍血（ng/ml）老人外周血（ng/ml） 4℃5145.35±22.2566.99±10.58-20℃5151.59±19.6272.31±12.41-80℃5149.15±17.9071.22±13.12 F值0.3460.756 P值＞ 0.05＞ 0.05

三、不同ELISA試劑盒的檢測(cè)結(jié)果

分別利用市面上三大廠商的ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)臍血和老人外周血的TIMP2含量，優(yōu)選出精準(zhǔn)和操作簡(jiǎn)單方便的TIMP2蛋白檢測(cè)試劑盒。結(jié)果顯示，R&D systems、Abnova和Abcom的3款檢測(cè)試劑和檢測(cè)結(jié)果無(wú)論是臍血還是老人外周血均相近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，對(duì)比操作時(shí)長(zhǎng)，Abcom試劑盒檢測(cè)所需總時(shí)長(zhǎng)最短，其次是R&D systems，對(duì)比整個(gè)操作的復(fù)雜程度，R&D systems相對(duì)最簡(jiǎn)單，其次是Abcom（表4）。

表4 不同ELISA試劑盒對(duì)TIMP蛋白檢測(cè)的影響（± s）

表4 不同ELISA試劑盒對(duì)TIMP蛋白檢測(cè)的影響（± s）

試劑盒樣本數(shù)臍血（ng/ml）老人外周血（ng/ml）R&D5144.73± 8.2276.80± 8.98 Abnova5145.25±11.8077.17±11.34 Abcom5142.95±16.0176.76±11.58 F值0.1310.774 P值＞ 0.05＞ 0.05

四、不同來(lái)源的血漿TIMP2蛋白含量比較

將采集到的15份新生兒臍血和15份老人外周血進(jìn)行TIMP2蛋白含量的比較，將采集到的30份樣本全部統(tǒng)一采用2 000×g離心力分離血漿，均利用R&D Systems TIMP2的檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果所示，新生兒臍血血漿中TIMP2蛋白含量高于老人外周血中的，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01），且新生兒臍帶血中TIMP2含量均高于120ng/ml，老人外周血中的TIMP2蛋白含量均低于100ng/ml，證明老人外周血中的TIMP2含量相比于臍血出現(xiàn)了明顯的降低，新生兒時(shí)期和年老時(shí)期的人血漿TIMP2蛋白存在明顯差異，預(yù)示著TIMP2蛋白含量與衰老存在直接的關(guān)系，隨著年齡的增長(zhǎng)到年老期，TIMP2蛋白因某種原因?qū)е滤p（表5）。

表5 臍血和老人外周血TIMP2蛋白含量比較（± s）

表5 臍血和老人外周血TIMP2蛋白含量比較（± s）

血液類(lèi)型樣本數(shù)TIMP2蛋白含量（ng/ml）臍血15144.73±8.22老人外周血15 76.80±8.98 F值174.042 P值＜ 0.01

討 論

衰老被視為是一種復(fù)雜的，涉及整個(gè)機(jī)體的病理發(fā)展過(guò)程[12-13]，伴隨端?？s短、細(xì)胞自噬清除活性降低、線粒體機(jī)能下降和細(xì)胞呈現(xiàn)衰老等一系列特征表象[14-16]，同時(shí)出現(xiàn)表層皮膚代謝緩慢導(dǎo)致的色素沉淀、肌纖維伸縮性降低導(dǎo)致的萎縮和神經(jīng)元細(xì)胞減少導(dǎo)致的記憶力衰退等現(xiàn)象[17]。小鼠衰老模型顯示，移植了干細(xì)胞的衰老老鼠，改善了小鼠機(jī)體抗氧化能力，通過(guò)分泌更多的細(xì)胞因子促進(jìn)衰老細(xì)胞的更新[18]，如VEGF、EGF、bFGF、IGF等，加速血管及微小毛細(xì)血管的再生，增加了小鼠皮膚的厚度和皮膚中膠原蛋白的含量[19]，干細(xì)胞的移植在衰老的治療中起重要作用。另外，研究指出了臍血中的TIMP2蛋白有能力提高海馬體的功能和活性，成為海馬體神經(jīng)元可塑性的重要因子[11]，而海馬體又是機(jī)體對(duì)認(rèn)知和記憶的關(guān)鍵區(qū)域，無(wú)疑表明，TIMP2蛋白也許能對(duì)抗或延緩機(jī)體因衰老導(dǎo)致的記憶和認(rèn)知的衰退。因此，結(jié)合干細(xì)胞的抗衰老作用與TIMP2蛋白潛在的抗衰老能力，聯(lián)合干細(xì)胞與TIMP2蛋白的治療方式值得進(jìn)行更深入的嘗試。

在此前景上，明確對(duì)比了影響血漿中TIMP2蛋白檢測(cè)的影響因素，了解到臍血和老人外周血TIMP2蛋白含量差異，利用不同的離心力、保存溫度及檢測(cè)試劑盒分別評(píng)估了這些因素對(duì)新生兒臍血和老人外周血中TIMP2蛋白含量的影響。其中，采用1 000×g到2 000×g間的離心力均完全分離血漿和紅細(xì)胞，對(duì)TIMP2蛋白無(wú)顯著影響，但由于低于1 000×g的離心力會(huì)降低紅細(xì)胞的沉淀率，導(dǎo)致離心效果不佳，故沒(méi)有檢測(cè)未完全分離的全血TIMP2含量。另外，本研究利用的是真空采血管采集血液樣本，而不是使用更方便采集血液的采血袋，因采血袋中含有約28 ml的枸櫞酸鈉抗凝劑，與血液混合后相當(dāng)于稀釋了血漿中TIMP2蛋白，導(dǎo)致TIMP2蛋白含量低于原始值。

對(duì)于離心分離后的血漿無(wú)論保存在4 ℃還是-20 ℃或-80 ℃一周時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明短期的血漿保存均不會(huì)對(duì)血漿中TIMP2含量產(chǎn)生影響。在這里，4 ℃的血漿保存溫度使得TIMP2蛋白在1周內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)顯著的蛋白降解，第2周開(kāi)始，TIMP2蛋白對(duì)比第1周有出現(xiàn)檢測(cè)值的輕微下降，雖然沒(méi)有差異性，但這有可能是TIMP2蛋白具有更長(zhǎng)的半衰期，也可能是血漿復(fù)雜的成分維持了TIMP2蛋白結(jié)構(gòu)。而在臨床檢測(cè)中，為了獲得更接近機(jī)體真實(shí)數(shù)值的數(shù)據(jù)，更多的是針對(duì)新鮮采集的樣本進(jìn)行檢測(cè)，所以考慮到臨床檢測(cè)樣本的保存時(shí)間不會(huì)很長(zhǎng)，本研究并沒(méi)有更長(zhǎng)時(shí)間的檢測(cè)不同血漿保存時(shí)間點(diǎn)下TIMP2蛋白的變化，僅展示了第1和第2周時(shí)所檢測(cè)到的TIMP2蛋白含量。如果需要更加深入了解TIMP2蛋白的半衰期，則需要增加更長(zhǎng)時(shí)間以及更系統(tǒng)的蛋白降解的監(jiān)測(cè)。

檢測(cè)結(jié)果表明，臍血中的TIMP2蛋白含量高于老人外周血，TIMP2蛋白含量在新生兒中已經(jīng)出現(xiàn)，血漿中含量超過(guò)120 ng/ml，直到老年階段，TIMP2含量降低，低于100 ng/ml。雖然臍血中TIMP2蛋白的治療效果還未有臨床研究數(shù)據(jù)，但結(jié)合血液中TIMP2蛋白具有提高小鼠海馬體活性的能力，在人體中，TIMP2蛋白也許能展現(xiàn)出對(duì)抗衰老的能力，不僅能傳遞出某些疾病的信息，同時(shí)還能反映人體衰老的水平，為臨床的判斷提供有力的參考指標(biāo)，也為聯(lián)合干細(xì)胞在抗衰老的作用中提供新的思路和方向。