木霉耐鹽突變菌株的紫外誘變選育

張樹武，徐秉良，劉 佳，石成才

(甘肅農(nóng)業(yè)大學植物保護學院/甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州 730070)

土壤鹽漬化已成為一個世界性問題，可造成作物嚴重減產(chǎn)，每年由于其造成的經(jīng)濟損失達10億美元[1-3]。據(jù)報道，目前地球上已有超過6%的耕地嚴重受到鹽脅迫的影響，且在干旱和半干旱地區(qū)較為嚴重[4]。同時，已有研究表明鹽脅迫能夠引起或造成植物形態(tài)特征、生理和代謝反應(yīng)發(fā)生變化，以及改變植物滲透壓和活性氧反應(yīng)等過程，進而導致植物體內(nèi)過氧化脂質(zhì)和抗氧化物質(zhì)失活[5]。因此，急需開發(fā)有效技術(shù)來減輕和降低鹽脅迫對植物生長和發(fā)育帶來的負面影響。Phang等[6]研究表明，傳統(tǒng)育種和轉(zhuǎn)基因技術(shù)曾被廣泛用于耐鹽性植物品種的選育，但是傳統(tǒng)育種存在周期長和效率低，轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在高成本等問題[7-8]。同時，目前已有許多學者嘗試利用外源化合物減輕非生物脅迫對植物生長造成的負面影響，如已證明殼聚糖[1]、一氧化氮、硝酸鈣[9]及茉莉酸[10]等能夠顯著改善和提高小麥耐鹽水平，但對于其機理目前尚未明確。同時，隨著近年來在該方面研究的不斷深入，有關(guān)利用植物根際促生細菌和真菌誘導植物抗非生物脅迫方面已有相關(guān)的報道，如菌根真菌、根瘤菌、植物根際促生菌和內(nèi)生真菌等能夠改善植物生長[11]，但有關(guān)高效耐鹽微生物突變菌株紫外誘變選育方面的研究和報道較少。

木霉菌(Trichodermaspp.)作為土壤中存在的一類真菌，廣泛用于不同種類植物病害的生物防治[12-13]。此外，Mastouri等[14]研究表明在生物和非生物脅迫下，哈茨木霉T22(T.harzianum)菌株能夠提高番茄種子的萌發(fā)率，減輕幼苗的氧化損傷，但是隨著鹽濃度的升高，哈茨木霉T22菌株活性顯著降低，并且由于外界環(huán)境的影響其耐鹽性效果不穩(wěn)定。因此，如何提高木霉菌的耐鹽性已是目前急需解決的一個問題。

因此，本試驗通過利用NaCl溶液模擬鹽協(xié)迫逆境條件，并利用紫外誘變提高和改良深綠木霉(Trichodermaatroviride)T-YM菌株耐鹽性，旨在探明紫外誘變對深綠木霉T-YM菌株生長和耐鹽性的影響，將為進一步提高其耐鹽性奠定理論基礎(chǔ)，同時對于進一步改良和擴大木霉菌的應(yīng)用范圍具有重要的實踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 深綠木霉T-YM菌株分離于甘肅民勤縣玉米根際鹽堿土壤，并保存于甘肅農(nóng)業(yè)大學植物病理學實驗室。

1.1.2 供試化學試劑 NaCl分析純AR，無色晶體，由國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1 分生孢子懸浮液制備 將預先分離篩選并保存的深綠木霉T-YM菌株轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。培養(yǎng)6 d后，待其產(chǎn)生大量分生孢子后，向培養(yǎng)基表面加入5 mL無菌水和1滴吐溫-80，洗脫菌落表面分生孢子并將其收集于盛有玻璃珠的120 mL三角瓶中，置于溫度為25℃和轉(zhuǎn)速為200 rpm·min-1恒溫搖床振蕩30 min，使其分生孢子分散均勻，即為分生孢子懸浮液，并經(jīng)血球計數(shù)板計數(shù)，使其孢子濃度為1×106CFU·mL-1，備用。

1.2.2 深綠木霉T-YM菌株紫外誘變處理 誘變處理前30 min打開紫外燈(10 W)使其功率穩(wěn)定。將配制好的深綠木霉T-YM菌株分生孢子懸浮液(1×106CFU·mL-1)加入經(jīng)滅菌處理的1.5 mL離心管中，每管加入1 mL孢子懸浮液。然后，置于紫外燈(10 W) 10 cm處分別處理0.5、1、3、5 min和7 min。試驗以等量未經(jīng)誘變的原始菌株分生孢子懸浮液作為對照，每個處理和對照均重復6次。

1.2.3 紫外誘變對深綠木霉T-YM菌落生長和產(chǎn)孢量的影響 采用單孢分離法，對經(jīng)紫外誘變處理的深綠木霉T-YM和原始菌株分生孢子懸浮液進行單孢分離，然后將分離的單個孢子接種于PDA平板表面，并置于溫度為25℃，光照為16 h的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個處理和對照均重復6次。培養(yǎng)3 d后，將經(jīng)不同時間紫外誘變處理后生長較好的突變菌株，利用打孔器(Ф=5 mm)在其菌落邊緣打取菌餅，并轉(zhuǎn)接于新的PDA培養(yǎng)基，置于溫度為25℃和光照為16 h的培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d后，采用“十字交叉法”測量菌落直徑，每隔1 d測定和觀察1次，并于接種培養(yǎng)7 d時測定其產(chǎn)孢量。試驗以接種原始菌株作為對照，每個處理和對照均重復6次。

1.2.4 紫外誘變對深綠木霉T-YM菌絲生長的影響 配制相同濃度的原始和誘變后經(jīng)單孢分離且生長較好的突變菌株分生孢子懸浮液(1×106CFU·mL-1)，并吸取1 mL孢子懸浮液接種于60 mL PDB液體培養(yǎng)基中，置于溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為180 rpm·min-1的恒溫搖床振蕩培養(yǎng)5 d，并經(jīng)無菌濾紙過濾后收集菌絲。然后，經(jīng)60℃恒溫烘干，計算其菌絲干重。以接種等量原始菌株孢子懸浮液作為對照，試驗每個處理和對照均重復6次。

1.2.5 紫外誘變對深綠木霉T-YM菌株耐鹽性的影響 待PDA培養(yǎng)基(每三角瓶120 mL)冷卻到50℃～60℃時，分別加入NaCl晶體，并使NaCl溶液濃度分別為0、10、20、30、40 mg·mL-1和50 mg·mL-1。充分搖勻后，均勻倒入6個培養(yǎng)皿中制成平板。然后，將獲得的突變菌株經(jīng)單孢分離并純化培養(yǎng)5 d的菌落經(jīng)滅菌的打孔器(Ф=5 mm)制取菌餅接種于含有不同濃度NaCl溶液的PDA平板中央。將各處理和對照均置于25℃和16 h光照條件的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，試驗以原始菌株作為對照，每個處理和對照均重復6次。培養(yǎng)2 d后，采用“十字交叉法”測量菌落直徑，每隔1 d測定1次，并于培養(yǎng)第7天測量其產(chǎn)孢量。

待PDB培養(yǎng)基(每三角瓶60 mL)冷卻到50℃～60℃左右時，分別加入NaCl晶體，并使NaCl溶液濃度分別為0、10、20、30、40 mg·mL-1和50 mg·mL-1。配制相同濃度的原始和誘變后經(jīng)單孢分離并純化的突變菌株分生孢子懸浮液(1×106CFU·mL-1)，并吸取1 mL孢子懸浮液接種于60 mL PDB液體培養(yǎng)基中，置于溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為180 rpm·min-1的恒溫搖床振蕩培養(yǎng)5 d，并經(jīng)無菌濾紙過濾后收集菌絲。然后，經(jīng)60℃恒溫烘干稱重，計算菌絲干重。試驗以接種等量原始菌株孢子懸浮液作為對照，試驗每個處理和對照均重復6次。

1.2.6 耐鹽性突變菌株復篩及其耐鹽遺傳穩(wěn)定性測定 將經(jīng)紫外誘變獲得的耐鹽性較強的深綠木霉T-YM正突變菌株(誘變時間為0.5 min和NaCl濃度為10 mg·mL-1) 參考1.2.5方法接種于培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)，并以傳代培養(yǎng)后突變菌株的菌落直徑、產(chǎn)孢量和菌絲干重作為測定指標評價其耐鹽遺傳穩(wěn)定性。試驗每個處理和對照均重復6次。突變菌株傳代培養(yǎng)菌落直徑測定時間以接種培養(yǎng)4 d為1代，共傳代培養(yǎng)10次；產(chǎn)孢量測定時間以培養(yǎng)7 d為1代，共傳代培養(yǎng)10次；菌絲干重測定時間以培養(yǎng)5 d為1代，共傳代培養(yǎng)10次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003和SPSS 16.0軟件分別進行數(shù)據(jù)處理、圖表繪制和方差分析。采用單因素方差分析和Duncan氏新復極差法統(tǒng)計各處理平均數(shù)的差異和進行差異顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外誘變對深綠木霉T-YM菌落生長的影響

表1表明，紫外誘變處理獲得的深綠木霉T-YM突變菌株在活化培養(yǎng)第1天和第2天時，在不同誘變時間下其生長存在明顯的差異。與野生型菌株相比，突變菌株在培養(yǎng)第1天和第2天時，當誘變時間為3 min時能夠顯著提高突變菌株的菌落生長速度，其生長速率與對照相比分別提高了22.45%和12.92%，但當紫外誘變時間為7 min時，突變菌株菌落生長速度與對照相比顯著降低，其生長速率在誘變處理后培養(yǎng)第1天和第2天時分別降低30.61%和6.96%。然而，誘變處理培養(yǎng)后第3天，不同誘變時間下所獲得的突變菌株生長速率與對照相比均無顯著差異。

2.2 紫外誘變對深綠木霉T-YM菌株產(chǎn)孢量和菌絲生長量的影響

表2表明，與野生型菌株相比，當紫外誘變時間為0.5～5.0 min時，其對深綠木霉T-YM突變菌株產(chǎn)孢量和菌絲生長量均具有顯著促進作用，但當誘變時間為7.0 min時，突變菌株產(chǎn)孢量降低，但與野生型菌株相比差異不顯著。液體培養(yǎng)5 d，當紫外誘變時間為0.5 min和5 min時，能夠顯著增加深綠木霉T-YM突變菌株菌絲干重，且與對照相比，其菌絲干重分別增加42.22%和46.67%；液體培養(yǎng)7 d，當紫外誘變時間為3 min時，突變菌株產(chǎn)孢量增加最為顯著，其產(chǎn)孢量與對照相比增加 28.82%。

表1 紫外誘變對深綠木霉T-YM菌落生長的影響

注：表中數(shù)據(jù)均為6個重復的平均值。數(shù)據(jù)后不同字母表示經(jīng)Duncan氏新復極差法檢驗在P<0.05水平差異顯著，下同。

Note: The data in the
Table are means of six replicates. Different letters in the same column mean significant difference atP<0.05 level by Duncan’s new multiple range test, respectively. The same below.

2.3 NaCl脅迫下紫外誘變對深綠木霉T-YM菌株生長速率的影響

表3表明，不同濃度NaCl溶液脅迫下，不同紫外誘變時間對深綠木霉T-YM突變菌株菌落生長均具有明顯的影響。培養(yǎng)4 d時，不同誘變時間處理的菌落生長速度隨著NaCl溶液濃度增加，整體呈降低趨勢，但與對照(野生型菌株)相比，在不同濃度NaCl溶液(10～50 mg·mL-1)脅迫下，紫外誘變處理的菌落直徑基本高于野生型菌株。當NaCl溶液濃度為0～10 mg·mL-1時，突變菌株生長速率與野生型菌株無顯著差異，但當NaCl溶液濃度為20～50 mg·mL-1時，突變菌株生長速率均顯著高于野生型菌株，且在誘變處理3 min時，其生長速率顯著高于其它誘變時間獲得的突變菌株。

表2 紫外誘變對深綠木霉T-YM菌絲干重 和產(chǎn)孢量的影響

注：表中數(shù)據(jù)均分別為處理后第5天和第7天時菌絲生長量和產(chǎn)孢量的平均值。

Note: The data in the
Table are means of six replicates for the dry weight of mycelia and quantity of spore production at 5 and 7 days after treatment, respectively.

2.4 NaCl脅迫下紫外誘變對深綠木霉T-YM菌株產(chǎn)孢量的影響

表4表明，與野生型菌株相比，NaCl溶液脅迫下，不同紫外誘變時間對深綠木霉T-YM突變菌株的產(chǎn)孢量具有一定程度的影響，而且NaCl溶液濃度對誘變和野生型菌株的產(chǎn)孢量具有較明顯的影響。當NaCl溶液濃度為10～50 mg·mL-1時，其產(chǎn)孢量隨著NaCl溶液濃度增加顯著降低。當誘變時間為0.5～5.0 min時，10 mg·mL-1NaCl處理的產(chǎn)孢量顯著高于野生型菌株，但當誘變時間為7.0 min時，其產(chǎn)孢量顯著低于野生型菌株。當NaCl濃度增加至20 mg·mL-1以上時，原始菌株和突變菌株產(chǎn)孢量均急驟下降。

表3 NaCl脅迫下紫外誘變對深綠木霉T-YM菌落生長的影響

注：表中數(shù)據(jù)均為接菌第4天后6個重復的平均值。

Note: The data in the
Table are means of six replicates at 4 days after inoculation.

表4 NaCl脅迫下紫外誘變對深綠木霉T-YM菌株產(chǎn)孢量的影響/(106 CFU·mL-1)

注：表中數(shù)據(jù)均為接菌第7天后6個重復的平均值。

Note: The data in the
Table are means of six replicates at 7 days after inoculation.

2.5 NaCl脅迫下紫外誘變對深綠木霉T-YM菌株菌絲干重的影響

表5表明，與野生型菌株相比，10 mg·mL-1NaCl溶液脅迫下，培養(yǎng)后不同誘變時間獲得的突變菌株菌絲干重整體高于野生型菌株，尤其誘變時間為3 min時增加最為顯著。隨著NaCl溶液濃度增加，突變菌株和野生型菌株菌絲干重呈降低趨勢。

2.6 NaCl脅迫下紫外誘變對深綠木霉T-YM菌株耐鹽遺傳穩(wěn)定性的影響

表6為10 mg·mL-1NaCl脅迫下，紫外誘變0.5 min獲得的突變菌株經(jīng)傳代接種培養(yǎng)后的菌落生長狀況。NaCl脅迫下突變菌株傳代接種培養(yǎng)4 d后，不同代培養(yǎng)菌株間菌落直徑無顯著差異；培養(yǎng)5 d后，不同代培養(yǎng)菌株間菌絲干重無顯著差異；培養(yǎng)7 d后，不同代培養(yǎng)菌株間產(chǎn)孢量無顯著差異。

表5 NaCl脅迫下紫外誘變對深綠木霉T-YM菌株菌絲干重的影響/g

注：表中數(shù)據(jù)均為接菌第5天后6個重復平均值。

Note: The data in the Table are means of six replicates at 5 days after inoculation.

表6 NaCl脅迫下紫外誘變對深綠木霉T-YM 菌株耐鹽遺傳穩(wěn)定性的影響

注：表中菌落直徑、產(chǎn)孢量和菌絲干重數(shù)據(jù)均為接菌第4天、第7天和第5天后6個重復的平均值。

Note: The data of colony diameter, quantities of spores production, and dry weight of mycelia in the
Table are means of six replicates at 4 days, 7 days, and 5 days after inoculation, respectively.

3 結(jié)論與討論

前期研究表明，高濃度鹽脅迫對木霉菌生長速率、菌絲生長量和產(chǎn)孢量具有一定程度的抑制作用[15-16]，因而，為了獲得具有更強耐鹽性的木霉突變菌株，尋求改良和提高木霉菌耐鹽性的技術(shù)和手段已成為目前研究的一種新趨勢。據(jù)報道，改良微生物菌株的手段和方法主要有誘變、遺傳改良和原生質(zhì)體融合等技術(shù)[17-19]，其中誘變技術(shù)是目前應(yīng)用較為廣泛的一種技術(shù)，已被應(yīng)用于多功能木霉菌突變菌株的研究[20]。在現(xiàn)有的誘變技術(shù)中，紫外誘變作為簡便、實用和誘變效果明顯的物理誘變因子，已被廣泛應(yīng)用于菌種改良[21]。本試驗以鹽堿土分離獲得的1株深綠木霉T-YM菌株為原始菌株進行紫外誘變處理，結(jié)果表明當誘變時間為3 min時能夠顯著提高深綠木霉T-YM菌株的生長速率和產(chǎn)孢量，當誘變時間為5 min能夠顯著提高菌絲生長量。薛應(yīng)鈺等[22]研究表明在紫外照射強度20 W，照射時間40 min和照射距離30 cm時獲得的誘變菌株生長速率和產(chǎn)孢量顯著高于野生型菌株，其研究結(jié)果與本試驗基本一致，但是其誘變條件與本試驗存在差異，其原因可能由于不同微生物對紫外光的敏感性有所差異，進而導致其最佳的誘變條件不一致。

另外，在NaCl溶液模擬鹽脅迫條件下，當誘變時間為0.5～5 min時，與對照相比誘變菌落直徑、產(chǎn)孢量和菌絲干重整體高于野生型菌株，且當誘變處理時間為3 min時，誘變菌株的生長速率和產(chǎn)孢量顯著提高，即顯著提高其耐鹽性。Mohamed等[23]研究發(fā)現(xiàn)，通過利用-輻射誘導獲得2株具有穩(wěn)定耐鹽性的哈茨木霉突變體Th50M6和Th50M11，且在鹽脅迫下突變菌株生長速率和產(chǎn)孢量，以及其對尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)生物防治效果顯著高于野生菌株。同時，2個耐鹽性菌株在鹽濃度為0～69 mM的培養(yǎng)基上其菌絲能夠正常生長和產(chǎn)孢。另外，已有相關(guān)的研究報道了利用紫外誘變提高木霉菌的解磷能力和抗藥性。薛應(yīng)鈺等[22]通過紫外誘變獲得一株具備高效解磷能力的木霉突變株T2-8，其解磷能力顯著高于野生型菌株。尹婷等[24]通過紫外光照射獲得了4株對速克靈抗藥性較強的深綠木霉菌株，但是有關(guān)利用紫外誘變提高木霉菌耐鹽性方面尚未報道，在今后還有待進一步深入研究。

因此，紫外誘變可作為選育高效耐鹽木霉突變菌株的有效方法。同時，利用植物與鹽漬土中有益微生物的共生關(guān)系緩解鹽漬土對植物生長造成的不利影響，可為提高植物的耐鹽性及鹽漬土的生物改良提供一條新思路，但是目前有關(guān)木霉菌耐鹽機理還有待深入研究。