一株溶磷菌的分離鑒定及溶磷促生作用

薛應(yīng)鈺，葉 巍，楊 樹，李 培，徐秉良

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州 730070)

磷素是植物生長發(fā)育所必需的三大礦質(zhì)營養(yǎng)元素之一，它對植物的生長發(fā)育和品質(zhì)提高有重要意義[1]。然而，自然條件下土壤中90%以上的磷通常是以難溶的金屬螯合物形式存在的無效磷，植物難以直接吸收利用[2]，施用磷肥(包括有機(jī)和化學(xué)磷肥)是土壤磷素的主要來源，但是，施入的磷肥當(dāng)季利用率僅為5%～25%，大部分由于很快發(fā)生專性吸附和化學(xué)沉淀固定作用而形成Ca-P，F(xiàn)e-P 和Al-P 等難溶性磷酸鹽(無效態(tài))積累在土壤中[3-4]，土壤有效磷的缺乏已成為限制植物生長的主要因素之一。因此，挖掘土壤潛在的磷庫資源，尋求新的方法提高磷肥利用率迫在眉睫。研究表明，植物根際土壤中存在的大量溶磷微生物(Phosphate-soluble microorganisms，PSMs)可以將土壤中難溶性磷轉(zhuǎn)化成植物能夠吸收利用的可溶性磷，自Staltrom[5]發(fā)現(xiàn)土壤中存在溶磷微生物以來，至今已報道的溶磷微生物達(dá)36 個屬，89個種[6]，且真菌的溶磷能力大于細(xì)菌，溶磷性能穩(wěn)定[7]。溶磷微生物擁有溶解難溶磷的能力，被公認(rèn)為安全、經(jīng)濟(jì)、高效的活化土壤難溶磷的生物措施，具有重大的開發(fā)應(yīng)用價值。

土壤溶磷微生物種類繁多，生態(tài)環(huán)境、土壤類型、作物根際等條件下的差異均會導(dǎo)致溶磷微生物的分布不同[8]。易艷梅等[9]對不同生態(tài)環(huán)境土壤中溶磷微生物的研究發(fā)現(xiàn)，磷礦區(qū)溶磷微生物數(shù)量多、種類豐度高；鹽漬土溶磷細(xì)菌的優(yōu)勢種群單一；重金屬污染區(qū)最少，且以巨大芽孢桿菌為主。溶磷微生物在土壤中的數(shù)量、種類在不同的土壤類型中也有差異。各類土壤中溶磷微生物的數(shù)量分布呈現(xiàn)：黑鈣土>黃棕壤>白土>紅壤>磚紅壤>瓦堿土[10]；黃偉等[11]發(fā)現(xiàn)，我國熱帶亞熱帶的黃棕壤和紅壤中溶磷細(xì)菌種類繁多，東北黑鈣土中溶磷細(xì)菌的數(shù)量很多，但豐度低，以芽孢桿菌(Bacillus)和假單胞菌(Pseudomonas)為主。種植不同植物的土壤中主要溶磷微生物的分布有差異。林啟美等[12]通過對不同植物根際土壤溶磷菌的數(shù)量及種群結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)菜地土壤溶磷細(xì)菌的數(shù)量和種類最多，農(nóng)田、菜地和草地的土壤以假單胞菌屬為主，但農(nóng)田土壤有一半是沙雷氏菌屬(Serratia)，而菜地約有50%是歐文氏菌屬(Erwinia)，草地土壤有大量的芽孢桿菌屬和固氮菌屬(Azotobacter)。林地土壤沒有假單胞菌屬、芽孢桿菌屬和固氮菌屬。不同植物根際溶磷微生物的分布也有所不同。小麥根際溶磷菌主要為假單胞菌屬和埃希氏菌屬(Escherichia)[13]，水稻根際主要為芽孢桿菌屬和土壤單胞菌屬(Agromonas)[14]，玉米根際溶磷微生物主要是歐文氏菌屬[15]。而且，根際土壤中溶磷菌的豐富度比非根際土壤更加復(fù)雜[16]。

目前，絕大多數(shù)溶磷菌株是從作物根際土壤中獲得，而有些溶磷菌是從特殊環(huán)境中分離，以期更好地利用此類菌株具有溶磷功能和兼具適應(yīng)土著環(huán)境的特性[17]。Chatli 等[18]從低溫沙漠地區(qū)分離了溶磷青霉菌株FC28、FC39，對磷酸三鈣的溶解量分別為136.9 mg·L-1和103.3 mg·L-1；Bhattacharya 等[19]從蚯蚓糞便中分離到溶磷黑曲霉(Aspergillusniger)菌株V1，對磷礦粉最大溶解率為36%；Naveenkumar等[20]從檳榔殼廢棄物中獲得了構(gòu)巢曲霉(Spergillusnidulans)菌株Strain-1，對磷酸三鈣的溶解量為200 mg·L-1；Rinu 等[21]從海拔1 800～3 610 m 的喜馬拉雅山脈土壤中分離到溶磷菌株ITCC2546、ITCC4210 和ARIFCC771，在盆栽實驗中使玉米種子干重分別增加10.71%、33.33% 和21.43%；李海云等[22]從豬糞堆肥中篩選到溶磷產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)菌株P(guān)SM-1，對磷酸三鈣的溶解量為138.36 mg·L-1?？梢姡谔囟ōh(huán)境條件下溶磷菌具有其特有性和多樣性。目前，針對民勤荒漠綠洲過渡帶特殊的地理區(qū)域，關(guān)于溶磷菌篩選的研究報道較少。

因此，以生長在民勤荒漠綠洲過渡帶植物白刺為研究物種，對其根際土壤中的根際溶磷菌進(jìn)行分離和篩選，并對篩選獲得的高效溶磷菌株進(jìn)行 ITS 序列分析，確定其分類學(xué)地位，研究溶磷特性及促生作用，以期為植物根際促生菌的開發(fā)利用和土壤改良提供優(yōu)良菌種資源。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品來源

采樣點位于甘肅省民勤縣薛百鄉(xiāng)沙井子，地理位置E103°36′17.3″，N38°44′27.2″，海拔為1 378 m，屬典型的溫帶大陸性極干旱荒漠氣候區(qū)，是民勤綠洲向巴丹吉林沙漠過渡的地帶。年平均降水量113.2 mm，年平均蒸發(fā)量2 604.3 mm，年平均氣溫7.6℃，土壤類型為棕漠土，儲水能力弱，土壤有機(jī)質(zhì)含量低，屬白刺(N.tangutorum)集中分布地帶。于2014年8月采用五點取樣法采集白刺灌叢根際土樣，采樣時，選取采土點后鏟去表層土后深挖20～30 cm，以保證樣本中包含較多的根際微生物。將白刺根系上一些細(xì)根和黏附其上的土壤一起裝入事先準(zhǔn)備的無菌塑料袋，帶回實驗室，剔除石塊、植物殘根等雜物貯存于塑料袋內(nèi)，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2培養(yǎng)基

1.2.1 溶磷培養(yǎng)基(NBRIP培養(yǎng)基) (NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，Ca3(PO4)25 g，葡萄糖10.0 g，pH7.0～7.5，固體培養(yǎng)基加2%的瓊脂粉，115℃ 30 min滅菌備用。

1.2.2 PDA培養(yǎng)基 馬鈴薯200 g,葡萄糖20.0 g,瓊脂18.0 g,蒸餾水定容至1 000 mL。

1.3 方法

1.3.1 溶磷真菌的分離篩選 采用稀釋分離法，稱取10 g土樣加到盛有90 mL無菌水的三角瓶中，加入玻璃珠，置于180 r·min-1的搖床上 28℃恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，然后用10倍稀釋法分別配制10-3、10-4、10-5的土壤懸液，取0.1 mL分別接種到NBRIP固體平板上涂布均勻，每個濃度涂布3個平板。倒置于培養(yǎng)箱中，28℃培養(yǎng)7 d，記錄溶磷圈直徑(D′)與菌落直徑(D)。采用溶磷圈法(D′/D值)對溶磷菌的溶磷性能進(jìn)行定性測試，篩選出D/d值最大的菌株，轉(zhuǎn)接到PDA平板上進(jìn)行純化，將純化后的菌株轉(zhuǎn)接到PDA 斜面，4℃保藏。

1.3.2 溶磷特性研究

(1)固體培養(yǎng)條件下溶磷能力測定 將滅菌后的培養(yǎng)基在倒平板之前加入Triton X-100溶液，每100 mL培養(yǎng)基加入5 mL的1% Triton X-100，然后挑取菌株P(guān)-1407孢子分別接種于NBRIP平板培養(yǎng)基上，置于28℃光照培養(yǎng)，每隔1d觀察菌落周圍有無透明圈，測量記錄溶磷圈直徑(D′)與菌落直徑(D)，共測量10 d，并計算D′/D值。

(2)液體培養(yǎng)條件下溶磷能力測定 采用磷鉬藍(lán)分光光度法[23]，略作修改。制取菌株P(guān)-1407孢子懸浮液(108cfu·mL-1)，取1 mL菌液接種于盛有100 mL NBRIP液體培養(yǎng)基的三角瓶中，設(shè)不接菌為對照，每個處理重復(fù)3次，置于28℃，150 r·min-1搖床培養(yǎng)10 d，分別培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 d后過濾取上清液，將菌液6 000 r·min-1離心30 min，吸取上清液1 mL，加入準(zhǔn)備好的試管中，另準(zhǔn)備一支試管加入1 mL蒸餾水做對照，再向試管中加入2 mL水，2 mL反應(yīng)終止液，搖勻后37℃水浴加熱10 min，利用UV3010紫外可見分光光度計在415 nm處通過比色法測定吸光光度值(OD)并記錄數(shù)據(jù)，每個處理隔5 s測量1次，共測3次，取平均值；ΔOD415=樣品ΔOD415-對照ΔOD415，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出菌液中可溶性磷的含量；同時用pHS-29A 型酸度計直接測定培養(yǎng)液的pH值并記錄數(shù)據(jù)。

1.3.3 有機(jī)酸種類及含量的測定 采用喬志偉[24]和喬歡[25]等的方法。取1.3.2中(2)的培養(yǎng)液1 mL，在4℃，12 000 r·min-1、離心10 min，取上清液過濾，采用Agilent1200 液相色譜儀進(jìn)行HPLC分析，確定有機(jī)酸的種類和濃度。

有機(jī)酸色譜條件為：色譜柱反相C18柱；流動相—甲醇和1 mmol·L-1KH2PO4(V/V)3∶97；流速0.8 mL·min-1；測定波長：203 nm；進(jìn)樣量20 μL；柱溫25℃；出峰順序依次為草酸、甲酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸。

葡萄糖酸色譜條件為：色譜柱：AgilentZORBAX SB-Phenyl，4.6 mm×250 mm，5μm；流動相：A：0.1% H3PO4，B：CH3CN；流速：1 mL·min-1；梯度：0～4 min；B 相：40%；5～7 min；B：90%；測定波長：203 nm；進(jìn)樣體積：2 μL；柱溫25℃。

1.3.4 鹽堿度對溶磷真菌解磷能力的影響 將菌株P(guān)-1407在PDA液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)3 d后，取1 mL分別接種至0%、2%、4%、6%、8%、10% NaCl和pH值為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的NBRIP液體培養(yǎng)基中，30℃、160 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d，采用鉬銻抗比色法測定各處理的可溶性磷含量。

1.3.5 溶磷菌株的鑒定

(1)形態(tài)學(xué)鑒定 將保存的高效溶磷菌株轉(zhuǎn)接到PDA平板上，28℃培養(yǎng)7 d，對菌落生長速率、正反面顏色、氣味等培養(yǎng)性狀以及無性型的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生方式、孢子形態(tài)、顏色、大小、瓶梗形態(tài)、數(shù)目和著生方式等顯微形態(tài)進(jìn)行觀察并記錄，進(jìn)行初步鑒定。

(2)rDNA-ITS序列分析 將高效溶磷菌株取其孢子轉(zhuǎn)接于PDA液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)48 h，過濾，干燥，研磨，并用螯合樹脂法提取DNA。利用真菌通用引物ITS1、ITS4對提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為10×PCR buffer 5.0 μL，dNTPs 4.0 μL，Taq酶0.5 μL，10 mmol·L-1ITSl/ITS4 1.0 μL，模板2.0 μL，ddH2O 36.5 μL。反應(yīng)程序為94℃變性3 min，94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；最后，72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測，純化后送上海生物工程有限公司進(jìn)行序列測定。將獲得的DNA序列，輸入GenBank，與數(shù)據(jù)庫中的所有序列進(jìn)行Blast比對，選取同源性95%以上的菌株序列，并利用MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.6 菌株P(guān)-1407對番茄促生作用 (1)菌株P(guān)-1407發(fā)酵液的制備 將預(yù)先分離純化得到的菌株P(guān)-1407接種于PDA培養(yǎng)基，置于28℃培養(yǎng)箱中，28℃光暗交替(12 h/12 h)培養(yǎng)5 d后，加入5 mL無菌水和1滴Tween-80配制分生孢子懸浮液，利用血球計數(shù)板計數(shù)其濃度，無菌水稀釋，最終使其濃度為1×107cfu·mL-1，取1 mL懸浮液于50 mL NBRIP液體培養(yǎng)基，置于150 r·min-1的搖床25℃振蕩培養(yǎng)7 d，然后通過雙層濾膜過濾，將得到的濾液分別用無菌水稀釋為50、100倍和200倍液。以NBRIP液體培養(yǎng)基加入1 mL無菌水和1滴Tween-80為對照，處理和對照均為3個重復(fù)。

(2)菌株P(guān)-1407對番茄種子的影響 將供試的番茄種子經(jīng)5%NaClO溶液進(jìn)行消毒處理5 min，消毒后將其通過無菌水充分沖洗5次，然后將其置于直徑為9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行種子處理。處理的過程中培養(yǎng)皿中含有一層紗布和兩層濾紙進(jìn)行保濕處理，各處理和對照均為100粒種子，重復(fù)6次。然后將配制好的不同濃度P-1407發(fā)酵液分別加15 mL于每個處理中，對照加入等量的NBRIP濾液，于溫度為25℃和光照為16 h/8 h的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。處理后待種子的胚根長度超過種子長度一半時開始統(tǒng)計種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)[26]。

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子總數(shù))×100

發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt

式中，Gt為t時間內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

活力指數(shù)=發(fā)芽指數(shù)×單株平均干重

(3)溫室試驗 將經(jīng)過5%NaClO消毒(5 min)處理的番茄種子，經(jīng)無菌水充分沖洗后種植于裝入滅菌土壤的塑料缽中(100?！だ?1)。種植后待幼苗生長到兩葉一心期時，分別將配制的發(fā)酵液(20 mL) 澆灌于植株根系周圍的土壤中，以澆灌等量的NBRIP濾液為對照。試驗在溫度為25℃，光照為16 h/8 h的溫室中進(jìn)行，且各處理和對照均重復(fù)6次。處理后第30天，從每個處理和對照中分別隨機(jī)抽取60株幼苗，測定番茄幼苗形態(tài)指標(biāo)、葉綠素和丙二醛含量。根長和株高采用刻度尺進(jìn)行測量，整株鮮重采用電子天平稱量。同時將新鮮的植株通過干燥箱進(jìn)行殺青處理，處理溫度為105℃，時間為30 min，然后調(diào)節(jié)溫度為80℃烘干，并稱量干重[27]。番茄幼苗葉綠素含量測定采用分光光度法[28]，丙二醛含量測定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法[29]。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶磷菌株的分離

從民勤荒漠綠洲過渡帶白刺根際土壤樣品中篩選到具有溶磷效果的真菌13株。在NBRIP固體平板上培養(yǎng)7 d，菌株P(guān)-1407溶磷圈直徑(D′)最大，達(dá)5.25 cm，菌落直徑(D)為2.14 cm，溶磷菌圈直徑與菌落直徑之比(D′/D)最大為2.45，其余12個菌株的D′/D值均小于2(表1)。因此，選取菌株P(guān)-1407進(jìn)一步進(jìn)行分子鑒定以及溶磷特性研究。

由表2可以看出，菌株P(guān)-1407在NBRIP固體平板上培養(yǎng)了10 d，可以形成肉眼可見的透明溶磷圈，而且其溶磷圈直徑(D′)和菌落直徑(D)均隨著培養(yǎng)時間而不斷增大，菌落直徑由第1天的0.73 cm增大到第10天的2.61 cm，溶磷圈直徑由第1天的0.75 cn增大到第10天的5.79 cm。但是通過計算D′/D值發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)7 d的D′/D值最大，為2.52，表明該菌株在溶磷固體培養(yǎng)基上生長良好，其溶磷能力較好。

表1 13株真菌在固體培養(yǎng)條件下溶磷能力測定結(jié)果

注：同一列不同字母表示在0.05水平差異顯著。下同。

Note: The different letters in the same row indicate significant difference atP<0.05 level. The same below．

表2 菌株P(guān)-1407在固體培養(yǎng)條件下溶磷能力

2.2 菌株P(guān)-1407溶磷能力的測定

液體培養(yǎng)條件下溶磷能力試驗結(jié)果表明(圖1)，菌株P(guān)-1407在NBRIP液體培養(yǎng)基中的溶磷能力隨振蕩培養(yǎng)時間而變化，在一定時間范圍內(nèi)達(dá)到最高值后，可溶性磷含量開始下降，也就是說隨著培養(yǎng)時間的延長，菌株P(guān)-1407發(fā)酵液中的可溶性磷含量逐漸增多，最初1～2 d內(nèi)，發(fā)酵液中可溶性磷含量增加較慢，在2～6 d增加較快，在7 d時達(dá)到最大值557 μg·mL-1。此后發(fā)酵液可溶性磷含量略有降低，液溶磷量基本穩(wěn)定，而對照組中由于沒有接種解磷菌株，其發(fā)酵液里的可溶性磷含量很低，而且基本一直維持在最初的低水平。

圖1 菌株P(guān)-1407在液體培養(yǎng)條件下溶磷效果 和發(fā)酵液pH值變化Fig.1 Variation of phosphate solubilization capacity and pH value of P-1407 in liquid medium

2.3 不同培養(yǎng)時間下發(fā)酵液的pH值變化

由圖1可以看出，NBRIP液體培養(yǎng)基接種菌株P(guān)-1407后，發(fā)酵液的pH值隨著培養(yǎng)時間的延長而不斷變化，總體呈現(xiàn)出一個先降低，然后基本穩(wěn)定的趨勢，在最初的7 d有明顯的下降趨勢，在第7天時pH值降到最低為3.7，但到第8天后pH值略有回升并穩(wěn)定在4.5左右。與未接種培養(yǎng)液(pH=7)相比，整個培養(yǎng)周期內(nèi)接種菌株發(fā)酵液的pH值都有下降趨勢。

綜合2.2和2.3，發(fā)現(xiàn)在整個培養(yǎng)周期內(nèi)，發(fā)酵液液pH值與溶磷菌株P(guān)-1407溶磷量呈線性負(fù)相關(guān)，其線性方程為y=-203.14x+1037.6，R2=0.910,達(dá)極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。隨著溶磷量的增大，pH 值呈明顯下降趨勢，后期雖然變化幅度不大，但仍保持在較低水平，表明菌株P(guān)-1407在培養(yǎng)過程中會分泌弱酸性物質(zhì)。

2.4 菌株P(guān)-1407 分泌有機(jī)酸種類及含量

高效液相色譜分析結(jié)果表明，菌株P(guān)-1407在溶磷過程中主要分泌3種有機(jī)酸，即葡萄糖酸、草酸和甲酸，其總量為8.4 g·L-1。其中葡萄糖酸含量最高，為5.7 g·L-1，占所產(chǎn)有機(jī)酸總量的67.85%；其次是草酸為2.3 g·L-1，占27.38%，甲酸含量最少，僅為0.4 g·L-1(表3)。

2.5 NaCl濃度對溶磷真菌解磷能力的影響

將菌株P(guān)-1407接種到含有不同濃度NaCl的NBRIP液體培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d，結(jié)果表明，NaCl 濃度對菌株P(guān)-1407的溶磷能力有一定的影響。菌株P(guān)-1407在含有NaCl的發(fā)酵液中可溶性磷含量與對照(540.32 μg·mL-1)相比均有不同程度的下降，而且隨著NaCl 濃度的升高，菌株P(guān)-1407的溶磷能力不斷下降， NaCl 濃度為0～6%范圍內(nèi)，發(fā)酵液中的可溶性磷含量減少幅度較小，NaCl 濃度為6%時，可溶性磷含量仍保持在對照的80%左右，達(dá)468.29 μg·mL-1，而且與對照相比差異不顯著，但是當(dāng)NaCl 濃度高于6%時，發(fā)酵液中可溶性磷含量迅速下降，NaCl 濃度為10%時，發(fā)酵液中可溶性磷含量僅為305.33 μg·mL-1，仍達(dá)對照的56.51%，說明低濃度的鹽溶液對菌株P(guān)-1407的解磷能力影響較小。

表3 菌株P(guān)-1407分泌有機(jī)酸的種類和含量

菌株P(guān)-1407在含有不同濃度NaCl液體培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d，發(fā)酵液的pH值與對照相比均有所升高，而且隨著NaCl濃度的增大，pH值升高幅度也增大，即隨著NaCl 濃度的升高，發(fā)酵液的pH值逐漸升高，當(dāng)NaCl濃度為2%時，發(fā)酵液pH值為4.02,當(dāng)NaCl濃度升至10%時，發(fā)酵液pH值為4.97,表明高濃度NaCl抑制菌株P(guān)-1407產(chǎn)酸，溶磷能力降低。

2.6 堿性條件對溶磷真菌解磷能力的影響

由圖3可以看出，堿性條件下，隨著培養(yǎng)基pH值的升高，菌株P(guān)-1407的溶磷能力逐漸降低，pH值為7.5、8和8.5時，發(fā)酵液中的可溶性磷含量分別為489.27、469.02 μg·mL-1和433.19 μg·mL-1，但是與對照(pH=7)之間無顯著差異；當(dāng)培養(yǎng)基pH值為9時，培養(yǎng)基中可溶性磷含量急劇下降，僅為151.71 μg·mL-1，顯著低于對照。

圖2 NaCl 濃度對菌株 P-1407溶磷能力和 發(fā)酵液pH值的影響Fig.2 Effects of different NaCl concentration on phosphate solubilization capacity and pH value of P-1407

圖3 培養(yǎng)基pH值對菌株 P-1407溶磷能力和 發(fā)酵液pH值的影響Fig.3 Effects of different pH value on phosphate solubilization capacity and pH value of P-1407

發(fā)酵液的pH值隨著培養(yǎng)基pH值的升高而升高，培養(yǎng)基pH值為7.5、8和8.5時，發(fā)酵液pH值分別為4.32、4.43和4.85，與對照(pH=7)相比差異不顯著，而且增幅較小，分別為0.61、0.72和1.14，但是，當(dāng)培養(yǎng)基pH值為9時，發(fā)酵液pH值急劇升高，達(dá)5.98，增幅為2.27，顯著高于對照。

2.7 溶磷菌株P(guān)-1407的鑒定

2.7.1 培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征 在PDA培養(yǎng)基上菌絲生長迅速，28℃培養(yǎng)，初期產(chǎn)生白色菌絲，無色素，后期分生孢子結(jié)構(gòu)大量產(chǎn)生，呈灰綠色至暗綠色，無滲出液。7 d直徑為2.0～3.0 cm，正面灰綠色，背面灰黃色。分生孢子梗有隔膜，呈掃帚狀，在頂囊上生出2層小梗，下面一層為?；?，每個?；显僦鷰讉€小梗，從每個小梗的頂端相繼生出一串分生孢子，分生孢子灰綠色，圓形或橢圓形，直徑3.0～5.6 μm。初步確定為青霉屬一種(Penicilliumsp)。

2.7.2 分子鑒定 以溶磷真菌P-1407的DNA作為模板，利用通用引物ITS1和ITS4，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表明，在500～700 bp之間得到一條明亮的條帶，且沒有其他非特異性條帶(圖1)。切膠回收目的片段并進(jìn)行ITS序列測定，得到長度為567bp的序列。通過Blast將該序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行同源性比對，結(jié)果表明，解磷菌株P(guān)-1407與草酸青霉(Penicilliumoxalicum)的同源性為99%，其同源性系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖5。綜合形態(tài)特征和ITS基因序列同源性分析，將菌株P(guān)-1407鑒定為草酸青霉(Penicilliumoxalicum)。

注：A 菌落正面；B 菌落背面；C 分生孢子梗(40×)；D 分生孢子(40×)。 Notes：A：The front of colony；B：The back of colony；C：Conidiophore(40×)；D：Conidium(40×).圖4 溶磷菌株P(guān)-1407培養(yǎng)性狀和顯微形態(tài)特征Fig.4 The cultural characteristics and micromorphological characters of phosphate-solubilizing strain P-1407

2.8 溶磷菌株P(guān)-1407對番茄促生作用

2.8.1 菌株P(guān)-1407發(fā)酵液對番茄種子的影響 菌株P(guān)-1407發(fā)酵液對番茄種子活性有顯著的影響，不同濃度的發(fā)酵液處理番茄種子以后，其發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均顯著提高，尤其是100×發(fā)酵液處理后，番茄種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均最高，分別為96.54%、14.56和9.78，分別較對照提高了2.53%、49.33%和105.89%(表4)。

2.8.2 菌株P(guān)-1407發(fā)酵液對番茄幼苗生長的影響 由表5可以看出，菌株P(guān)-1407發(fā)酵液對番茄幼苗有明顯的促生作用，且與對照相比不同稀釋倍數(shù)發(fā)酵液對幼苗生長的影響存在顯著的差異，不同濃度的發(fā)酵液處理幼苗后，幼苗的株高、根長、地上部鮮重、地上部干重、地下部鮮重和地下部干重顯著高于對照，其中100×稀釋液處理后效果最好，幼苗的株高、根長、地上部鮮重、地上部干重、地下部鮮重和地下部干重分別為20.3 cm、18.3 cm、1.61 g、0.184 g、1.11 g和0.112 g，分別增加了109.27%、78.41%、82.95%、121.69%、94.74%和64.71%，顯著高于對照。

注：M: DNA marker DL2000; 1～3: PCR 產(chǎn)物。 Notes: M: DNA marker DL2000; 1～3: PCR amplification product.圖5 溶磷菌株P(guān)-1407的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.5 PCR amplification product electrophoretograms of phosphate-solubilizing strain P-1407

2.8.3 菌株P(guān)-1407發(fā)酵液對番茄幼苗葉綠素和丙二醛含量的影響 由圖7可以看出，不同濃度的菌株P(guān)-1407發(fā)酵液對番茄葉片中的葉綠素含量影響較大， 各個濃度梯度相較對照的葉綠素含量均有較大提高， 其中100×處理后的葉片葉綠素含量最高，達(dá) 3.22 mg·g-1， 顯著高于對照(2.45 mg·g-1)，提高了31.4%。

圖6 基于18S rDNA ITS 序列的溶磷菌株P(guān)-1407系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 The phylogenetic tree of efficient phosphate-solubilizing strain P-1407 based on 18S rDNA ITS sequences

濃度Concentration發(fā)芽率/%Germination rate提高率/%Increasing rate發(fā)芽指數(shù)Germination index提高率/%Increasing rate活力指數(shù)Vigor index提高率/%Increasing rate200×93.33±2.31b2.0210.38±0.98c6.465.38±0.92c13.26100×96.54±2.69a5.5314.56±0.57a49.339.78±1.03a105.8950×94.04±2.47b2.8012.32±0.98b26.366.95±0.63b46.32原液Stock solution93.58±1.87b2.3011.59±0.49bc18.876.07±0.94bc27.79對照Control91.48±1.05c09.75±0.81d04.75±0.59c0

表5 菌株P(guān)-1407發(fā)酵液對番茄幼苗生長的影響

菌株P(guān)-1407發(fā)酵液處理， 對番茄葉片丙二醛含量有較明顯的影響，不同濃度發(fā)酵液處理后，番茄葉片的丙二醛含量均出現(xiàn)不同程度的減少，其中100×處理后葉片中丙二醛含量最低，為1.85 mmol·g-1，與對照(2.84 mmol·g-1)差異顯著(圖8)。

3 討論與結(jié)論

土壤中的微生物是土壤肥力的核心，數(shù)量巨大，種類繁多，而且部分種類對土壤氮、磷和鉀等養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化和供給起到非常重要的作用[30]。土壤中的溶磷微生物主要有細(xì)菌、真菌和放線菌，與細(xì)菌相比，真菌的溶磷能力強而且穩(wěn)定，因此，挖掘可利用的溶磷真菌資源受到人們的高度重視。目前已報道的溶磷真菌主要有青霉(Penicillium)、曲霉(Aspergillus)、根霉(Rhizopus)、鐮刀菌(Fusarium)、小絲核菌(Sclerotium)等[31]，其中以曲霉和青霉的研究居多，尤其青霉達(dá)26 種之多[17]。本研究從甘肅民勤荒漠綠洲過渡帶白刺根際土壤中分離到一株溶磷菌株P(guān)-1407，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)特性鑒定為草酸青霉。

圖7 菌株P(guān)-1407發(fā)酵液對番茄葉片葉綠素 含量的影響Fig.7 Effect of strain P-1407 on chlorophyll content of tomato plant

圖8 菌株P(guān)-1407發(fā)酵液對番茄葉片丙二醛 含量的影響Fig.8 Effect of strain P-1407 on malodialdehyde content of tomato plant

溶磷圈法和液體培養(yǎng)是判定菌株是否具有溶磷能力以及解磷能力大小常用的方法。多數(shù)的研究表明，同一菌株而言，D/d值大小與菌株在液體振蕩培養(yǎng)條件下的溶磷量沒有必然的相關(guān)性，溶磷圈法只能對菌株有無溶磷能力作定性判斷，而液體培養(yǎng)法測出的菌株溶磷能力，理論上更為合理和科學(xué)[32]。本試驗采用溶磷圈法和液體培養(yǎng)對P-1407不同培養(yǎng)時間的溶磷效果進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)時間的D/d值大小與液體培養(yǎng)發(fā)酵液中可溶性磷含量的變化趨勢一致，說明對于P-1407菌株來說，通過測定其D/d值可以直觀反映出其溶磷能力的強弱。

菌株的溶磷能力與菌株種類、土壤環(huán)境、植物種類和根系分泌物不同有關(guān)[33]，因此，不同植物或同一植物根際溶磷菌的溶磷能力差異較大。范丙全等[34]篩選得到2株具有溶磷作用的草酸青霉菌P8和Pn1對磷酸鈣的溶解能力分別為 194.2 μg·mL-1和 136.4 μg·mL-1；王莉晶[35]測定的草酸青霉C2'菌株對于磷酸鈣的溶解量為557.68 μg·mL-1，史發(fā)超[1]測定的斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)P83菌株對磷酸鈣的溶解能力達(dá)956 μg·mL-1。本試驗分離的草酸青霉P-1407菌株對磷酸鈣的最高溶磷量達(dá)541.32 μg·mL-1，雖然溶磷能力低于P83菌株，但顯著優(yōu)于P8和Pn1菌株，也優(yōu)于Chatli等[18]從低溫沙漠地區(qū)分離的溶磷青霉菌株FC28(136.9 mg·L-1)、FC39(103.3 mg·L-1)，與C2'菌株解磷能力相當(dāng)，說明其具有良好的溶磷能力。

溶磷微生物培養(yǎng)液溶磷量與培養(yǎng)液pH值的變化關(guān)系比較復(fù)雜，有研究表明溶磷能力與溶液pH 值及可滴定酸含量相關(guān)[36-37]，但也有些結(jié)果證明兩者間不存在顯著相關(guān)性[38-39]。本研究顯示，草酸青霉P-1407菌株在培養(yǎng)時間內(nèi)，其溶磷能力與發(fā)酵液pH值呈顯著負(fù)相關(guān)，當(dāng)培養(yǎng)7d的溶磷量達(dá)最大值，此時其pH值最低，這說明溶磷真菌能夠分泌可滴定酸來溶解難溶磷源。多種研究表明，溶磷菌的溶磷機(jī)理具有多樣性[34]。一般認(rèn)為，溶磷真菌在生長過程中分泌低分子量有機(jī)酸類物質(zhì)是其溶磷的主要機(jī)理之一[40]。目前，溶磷菌產(chǎn)生的有機(jī)酸主要有葡萄糖酸、草酸、乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、檸檬酸、富馬酸、丙二酸和琥珀酸等[41-42]，這些有機(jī)酸通常一方面能夠降低培養(yǎng)液pH值，另一方面可與Fe3+、Ca2+和Al3+等金屬離子螯合，從而使不溶性磷或難溶磷轉(zhuǎn)化為有效磷[43-44]。而且，不同溶磷菌所分泌的有機(jī)酸數(shù)量和種類差異很大。喬歡[25]等研究得出嗜松青霉(P.pinophilum)分泌的葡萄糖酸和草酸在對磷酸鈣和磷酸鋁的溶解發(fā)揮了較大的作用。Cunnin-gham[45]認(rèn)為，拜萊青霉(P.bilaii)產(chǎn)生的草酸和檸檬酸是溶解磷酸鈣的主要機(jī)制。本研究使用液相色譜分析表明，草酸青霉P-1407J菌株可以分泌3種有機(jī)酸，其中葡萄糖酸含量最高，其次為草酸，說明該菌株對磷酸鈣溶解過程中，葡萄糖酸及草酸發(fā)揮了重要作用。與王莉晶等[20]報道的P.oxalicum在代謝過程中產(chǎn)生蘋果酸和酒石酸結(jié)果不一致，這可能是由于溶磷菌株的篩選地不同，其地理環(huán)境的差異所造成的。

另外，在自然條件惡劣的環(huán)境中，傳統(tǒng)物理化學(xué)技術(shù)難以發(fā)揮作用的情況下，溶磷微生物在改良土壤和推進(jìn)植被群落結(jié)構(gòu)演替中可發(fā)揮獨特的作用[46]。溶磷真菌不但能夠改良鹽堿土壤的磷素營養(yǎng)供應(yīng)，還可以降低鹽堿土的pH值，對鹽堿土壤的改良具有重要的作用。本試驗分離得到的草酸青霉P-1407菌株在NaCl濃度小于6%、pH<8.5時其溶磷能力所受影響不大，這對尋找發(fā)現(xiàn)可在鹽堿土壤中有效定殖的菌株，改善磷循環(huán)有實際的意義。以后應(yīng)該通過培養(yǎng)和非培養(yǎng)相結(jié)合的方法來關(guān)注長期定位實驗解磷菌的定殖效果以及與土壤土著微生物群落的相互作用。