微生態(tài)制劑對(duì)海水養(yǎng)殖系統(tǒng)硝化功能建立過(guò)程的影響

劉意康， 劉 洋， 徐愛(ài)玲， 宋志文

(青島理工大學(xué) 環(huán)境與市政工程學(xué)院，山東 青島 266033)

近年來(lái)，我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)量和規(guī)模迅速擴(kuò)大并多年居于世界首位。長(zhǎng)期以來(lái)，池塘養(yǎng)殖是我國(guó)對(duì)蝦的主要養(yǎng)殖模式，據(jù)統(tǒng)計(jì)，養(yǎng)殖1 kg對(duì)蝦要消耗20 t清潔水源，并且大多不經(jīng)處理直接排放，對(duì)環(huán)境造成了污染。在養(yǎng)殖過(guò)程中，對(duì)蝦排泄、殘餌分解等產(chǎn)生氨氮和亞硝酸鹽，如果不能及時(shí)去除，會(huì)造成氨或亞硝酸鹽積累。氨和亞硝酸鹽是誘發(fā)暴發(fā)性蝦病的重要原因，氨過(guò)高會(huì)使對(duì)蝦血氨升高，血液結(jié)合氧能力下降，產(chǎn)生毒血癥；亞硝酸鹽會(huì)使血液中血藍(lán)蛋白載氧能力下降，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致對(duì)蝦中毒死亡?？梢?jiàn)，對(duì)蝦養(yǎng)殖過(guò)程中，水質(zhì)凈化是需首要解決的問(wèn)題，而問(wèn)題的關(guān)鍵是氨和亞硝酸鹽的去除[1-3]?，F(xiàn)有池塘養(yǎng)殖、循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)(RAS)和生物絮團(tuán)技術(shù)(BFT)等方式，分別存在換水量大、病害頻發(fā)，投資、運(yùn)營(yíng)及技術(shù)要求高，操作和管理過(guò)程復(fù)雜等問(wèn)題[4-5]。有益微生物作為一種生態(tài)調(diào)控劑，能夠調(diào)節(jié)微生態(tài)平衡，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[6]。硝化菌、枯草芽胞菌和光合細(xì)菌是對(duì)蝦養(yǎng)殖中常用的微生態(tài)制劑，其中硝化菌包括氨氧化細(xì)菌(AOB)、氨氧化古菌(AOA)和亞硝酸鹽氧化菌(NOB)等，能夠?qū)焙蛠喯跛猁}轉(zhuǎn)化為毒性較低的硝酸鹽[7]。枯草芽胞桿菌能夠有效降解殘餌和排泄物，抑制致病菌生長(zhǎng)，并可利用同化作用去除部分氨和亞硝酸鹽[8]。光合細(xì)菌以小分子碳水化合物為碳源，利用銨、亞硝酸鹽、硝酸鹽等合成有機(jī)氮，起到凈化水質(zhì)的作用[9]。本研究通過(guò)投加不同微生態(tài)制劑、碳源以及生物膜載體，比較分析不同運(yùn)行條件下海水養(yǎng)殖系統(tǒng)硝化功能的建立過(guò)程，為實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 海水養(yǎng)殖系統(tǒng) 系統(tǒng)由塑料桶(直徑0.45 m，高0.8 m，有效容積150 L)、加熱棒、曝氣盤等組成。曝氣盤由PVC軟管與空氣壓縮機(jī)連接，置于系統(tǒng)底部，生物毛球包懸掛于水體中，實(shí)驗(yàn)前用高錳酸鉀對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行消毒。人工海水由海水素配制，鹽度為18‰。

1.1.2 微生態(tài)制劑 光合細(xì)菌和硝化細(xì)菌制劑由本實(shí)驗(yàn)室自行制備，其中硝化細(xì)菌為氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化細(xì)菌混合培養(yǎng)物，活菌數(shù)量為3.67×107cfu/mL，其中氨氧化菌比例為60%～65%，亞硝酸鹽氧化菌為35%～40%；光合細(xì)菌活菌數(shù)量為4.32×106cfu/mL；枯草芽胞桿菌購(gòu)自青島某公司，本實(shí)驗(yàn)室測(cè)定活菌數(shù)量為6.12×106cfu/mL。

1.1.3 載體 纖維毛球直徑(30±2) mm，孔隙率96%，比表面積3 000 m2/m3，實(shí)驗(yàn)前纖維毛球用蒸餾水清洗，1×105Pa滅菌30 min，然后將纖維毛球填充在35 cm×40 cm篩絹(100目)網(wǎng)兜中。

1.1.4 試劑 無(wú)菌蒸餾水、碳酸氫鈉(AR)、溴酸鉀(AR)、溴化鉀(AR)、對(duì)氨基苯磺酰胺(AR)、氫氧化鈉(AR)、磺胺(AR)、N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽(AR)、鹽酸(GR)、氨基磺酸(AR)。

1.1.5 儀器與設(shè)備 UVmini-1240光度計(jì)(島津國(guó)際貿(mào)易有限公司)、FA2004N電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、HQ30d溶解氧儀(哈希水質(zhì)分析儀器有限公司)、Brix/ATC FG-113鹽度計(jì)(山海雙旭電子有限公司)、HQ11d pH計(jì)(哈希水質(zhì)分析儀器有限公司)、MLS-3750高壓蒸汽滅菌器(SANYO)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方案 控制系統(tǒng)溫度(28±0.5) ℃，pH值為 (8.0±0.5)，7.5 mg/L≤DO≤8.5 mg/L。系統(tǒng)微生態(tài)制劑、碳源投加和載體設(shè)置情況如表1。硝化細(xì)菌每天投加一次，采取毛球包內(nèi)和水體內(nèi)交替投加的方式，枯草芽胞桿菌、光合細(xì)菌和糖蜜直接投加到水體中。添加氯化銨，使氨氮初始質(zhì)量濃度為2 mg/L，待氨氮與亞硝酸鹽氮降低至檢測(cè)不出時(shí)，再分別將氨氮初始質(zhì)量濃度提升至4 mg/L和6 mg/L。試驗(yàn)期間不換水且每5 d補(bǔ)充蒸發(fā)水量至150 L。每12 h測(cè)定水體中氨氮、亞硝氮、pH、溶解氧。

表1 海水養(yǎng)殖系統(tǒng)編號(hào)，微生態(tài)制劑、碳源投加和人工基質(zhì)設(shè)置情況Table 1 The Number, microecological preparation, carbon source and artificial substrate setting of mariculture system

注：“-”表示不添加相關(guān)菌劑和載體

1.2.2 分析方法 氨氮采用次溴酸鈉氧化法測(cè)定[10]；亞硝酸鹽氮采用重氮偶聯(lián)法測(cè)定[11]；硝酸鹽氮采用紫外分光光度法測(cè)定[11]；pH采用HQ11dpH計(jì)測(cè)定；DO采用HQ30d溶解氧儀測(cè)定；鹽度采用Brix/ATC FG-113鹽度計(jì)測(cè)定；數(shù)據(jù)處理采用Origin 9.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同微生態(tài)制劑對(duì)養(yǎng)殖系統(tǒng)硝化功能建立過(guò)程的影響

1 #和4 #系統(tǒng)均設(shè)置纖維毛球作為生物膜載體，其中1 #投加硝化細(xì)菌+枯草芽胞桿菌，4 #投加硝化細(xì)菌+光合細(xì)菌，試驗(yàn)過(guò)程中氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮濃度變化情況見(jiàn)圖1。從圖1可以看出，在試驗(yàn)過(guò)程中兩個(gè)系統(tǒng)氨氮均呈明顯下降趨勢(shì)，亞硝酸鹽氮呈先升高再降低趨勢(shì)，硝態(tài)氮濃度呈上升趨勢(shì)。在氨氮質(zhì)量濃度由2 mg/L升高到6 mg/L過(guò)程中，兩個(gè)系統(tǒng)氨氮和亞硝酸鹽氮變化情況存在差異，隨著氨氮濃度升高，兩個(gè)系統(tǒng)氨氧化強(qiáng)度均明顯提高，分別由0.68 mg/(L·d)、0.62 mg/(L·d)提升至1.36 mg/(L·d)、1.69 mg/(L·d)；亞硝酸鹽濃度峰值均呈升高趨勢(shì)，但差別不大，并且峰值濃度明顯低于氨氮初始濃度；硝酸鹽氮濃度在亞硝酸鹽氮濃度達(dá)到峰值后迅速增加，但其濃度低于氨氮初始濃度。

圖1 設(shè)置纖維毛球和投加不同微生態(tài)制劑的養(yǎng)殖系統(tǒng)氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮濃度變化情況Fig.1 The changes in the concentration of in the mariculture system with adding fiber ball and different microecological preparations

2.2 添加纖維毛球包對(duì)養(yǎng)殖系統(tǒng)硝化功能建立過(guò)程的影響

1 #系統(tǒng)設(shè)置纖維毛球，2 #系統(tǒng)未設(shè)置纖維毛球，二者均投加硝化細(xì)菌+枯草芽胞桿菌，其氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮濃度變化情況見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，試驗(yàn)過(guò)程中兩個(gè)系統(tǒng)氨氮均呈明顯下降趨勢(shì)，亞硝酸鹽氮呈先升高再降低趨勢(shì)，硝態(tài)氮濃度均呈上升趨勢(shì)。在氨氮質(zhì)量濃度由2 mg/L提高到6 mg/L過(guò)程中，兩個(gè)系統(tǒng)氨氮和亞硝酸鹽氮變化情況存在差異，隨著氨氮濃度提高，氨氧化強(qiáng)度均有明顯提升，分別由0.68、0.47 mg/(L·d)提升至1.36、0.98 mg/(L·d)；亞硝酸鹽濃度峰值均呈升高趨勢(shì)，并且峰值濃度明顯低于氨氮初始濃度，在氨氮濃度2 mg/L時(shí)，系統(tǒng)亞硝酸鹽氮濃度分別在72、84 h達(dá)到峰值(峰值濃度為0.33、0.39 mg/L)，并分別于96、120 h后完成系統(tǒng)硝化功能的建立，添加毛球包的生物膜系統(tǒng)硝化功能建立時(shí)間更短；硝酸鹽氮濃度在亞硝酸鹽氮濃度達(dá)到峰值后迅速增長(zhǎng)，且硝酸鹽氮濃度低于氨氮初始濃度。

圖2 設(shè)置與不設(shè)置纖維毛球但投加相同微生態(tài)制劑的養(yǎng)殖系統(tǒng)氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮濃度變化情況Fig.2 The changes in the concentration of in the mariculture system with adding fiber ball and not adding fiber bal

2.3 添加碳源對(duì)養(yǎng)殖系統(tǒng)硝化功能建立過(guò)程的影響

1 #和3 #系統(tǒng)均設(shè)置纖維毛球作為生物膜載體，并投加硝化細(xì)菌+枯草芽胞桿菌，但3 #系統(tǒng)試驗(yàn)過(guò)程中投加糖蜜作為有機(jī)碳源，其試驗(yàn)過(guò)程中氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮濃度變化情況見(jiàn)圖3。從圖3可以看出，試驗(yàn)過(guò)程中兩個(gè)系統(tǒng)氨氮均呈明顯下降趨勢(shì)，亞硝酸鹽氮呈先升高再降低趨勢(shì)，硝態(tài)氮濃度呈上升趨勢(shì)。在氨氮質(zhì)量濃度由2 mg/L提高到6 mg/L過(guò)程中，兩個(gè)系統(tǒng)氨氮和亞硝酸鹽氮變化情況存在差異，隨著氨氮濃度提高，氨氧化強(qiáng)度均有明顯提升，分別由0.68、0.85 mg/(L·d)提升至1.36、1.18 mg/(L·d)；亞硝酸鹽濃度峰值均呈升高趨勢(shì)，但差別不大，峰值濃度明顯低于氨氮初始濃度，在氨氮質(zhì)量濃度為2 mg/L時(shí)，亞硝酸鹽氮濃度分別在72、60 h達(dá)到峰值(峰值濃度為0.33 、0.31 mg/L)并分別在96、84 h后完成硝化系統(tǒng)建立，添加碳源會(huì)加快系統(tǒng)硝化功能的建立；硝酸鹽氮濃度在亞硝酸鹽氮濃度達(dá)到峰值后迅速增長(zhǎng)，且硝酸鹽氮濃度低于氨氮初始濃度。

圖3 投加與不投加碳源養(yǎng)殖系統(tǒng)氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮濃度變化情況Fig.3 The changes in the concentration of in the mariculture system with adding fiber ball or not adding carbon source

3 討 論

水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中由于生物排泄及殘餌、糞便分解，會(huì)造成有毒物質(zhì)增加，其中氨和亞硝酸鹽是主要去除目標(biāo)，有效控制系統(tǒng)中氮的存在形式和濃度、減少氨和亞硝酸鹽危害主要通過(guò)建立養(yǎng)殖系統(tǒng)硝化功能來(lái)實(shí)現(xiàn)。在該過(guò)程中，主要涉及三種微生物類群，即異養(yǎng)菌、氨氧化菌(包括Ammonium-oxidizing bacteria，AOB；Ammonia oxidizing archaea，AOA)和亞硝酸鹽氧化細(xì)菌(Nitrite-oxidizing bacteria，NOB)，異養(yǎng)菌將殘餌分解為氨氮，氨氮在氨氧化菌作用下轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽氮，后者進(jìn)一步被亞硝酸鹽氧化菌轉(zhuǎn)化為硝酸鹽氮。由于異養(yǎng)菌、氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化細(xì)菌間代時(shí)差別較大，產(chǎn)生的氨和亞硝酸鹽不能及時(shí)轉(zhuǎn)化，會(huì)出現(xiàn)氨和亞硝酸的積累并產(chǎn)生濃度峰值[12]。一旦水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)硝化功能建立完成后，在氨氮不超出系統(tǒng)負(fù)荷的情況下，其轉(zhuǎn)化過(guò)程則不會(huì)再出現(xiàn)亞硝酸鹽的積累。

許多研究和實(shí)際應(yīng)用表明，硝化細(xì)菌、光合細(xì)菌和芽胞桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)硝化功能建立過(guò)程中能夠發(fā)揮重要作用。投加硝化細(xì)菌制劑能夠加快硝化系統(tǒng)的建立，并且枯草芽胞桿菌和硝化細(xì)菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖水質(zhì)凈化方面可以優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)[13]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，投加硝化細(xì)菌制劑后，各系統(tǒng)亞硝酸鹽氮峰值均明顯低于氨氮初始濃度，表明投加制劑發(fā)揮了作用。加入光合細(xì)菌不僅可以凈化水質(zhì)，而且具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，在作為飼料添加劑、防治魚(yú)蝦病害、促進(jìn)魚(yú)蝦生長(zhǎng)等方面均有較好的作用[14-15]。芽胞桿菌成為優(yōu)勢(shì)菌種后能產(chǎn)生枯草素等物質(zhì)，能夠抑制其他細(xì)菌的生長(zhǎng)，減少甚至消滅病原體，改善和保持良好的養(yǎng)殖水環(huán)境[16-17]。

本研究結(jié)果顯示，不同微生態(tài)制劑組合的硝化功能建立過(guò)程存在差異，投加硝化細(xì)菌+枯草芽胞桿菌的1 #系統(tǒng)硝化功能建立時(shí)間比投加硝化細(xì)菌+光合細(xì)菌系統(tǒng)的4 #系統(tǒng)時(shí)間短。研究表明，枯草芽胞桿菌代謝過(guò)程中產(chǎn)生枯草素等物質(zhì)能有效抑制其他細(xì)菌繁殖，從而迅速成為優(yōu)勢(shì)菌，分泌的胞外酶可分解水中蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪等，產(chǎn)生的小分子物質(zhì)能促進(jìn)硝化細(xì)菌的化能合成作用[18]。光合細(xì)菌不能直接利用水中大分子有機(jī)物，必須先由其他微生物分解后才能被光合細(xì)菌分解利用，在硝化系統(tǒng)強(qiáng)化過(guò)程中，光合細(xì)菌成為優(yōu)勢(shì)種后，系統(tǒng)硝化強(qiáng)度高于硝化細(xì)菌+枯草芽胞桿菌系統(tǒng)，與劉軍義等[19]研究結(jié)果相類似。

生物絮團(tuán)技術(shù)(BFT)通過(guò)人為添加有機(jī)碳源，調(diào)節(jié)水體碳氮比，提高異養(yǎng)菌數(shù)量，利用微生物同化無(wú)機(jī)氮，將水體中氨氮等轉(zhuǎn)化成菌體蛋白，形成可被濾食性養(yǎng)殖對(duì)象直接攝食的生物絮凝體，起到凈化水質(zhì)、減少換水量、節(jié)省飼料、提高養(yǎng)殖對(duì)象存活率及增加產(chǎn)量等作用[20-22]。其缺點(diǎn)是操作和管理過(guò)程較為復(fù)雜，在實(shí)際生產(chǎn)中穩(wěn)定控制難度較大，如果調(diào)控不當(dāng)，會(huì)造成氨和亞硝酸鹽積累[23-24]。生物膜法是在養(yǎng)殖系統(tǒng)中添加微生物載體，利用附著生長(zhǎng)的好氧菌、厭氧菌等控制水質(zhì)，具有空間利用率高、抗沖擊能力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，可使養(yǎng)殖池同時(shí)具有對(duì)蝦養(yǎng)殖和水質(zhì)凈化雙重功能[25-27]。比較添加纖維毛球的1 #生物膜系統(tǒng)和2 #生物絮團(tuán)系統(tǒng)硝化功能建立過(guò)程顯示，生物膜系統(tǒng)有助于養(yǎng)殖系統(tǒng)硝化功能的快速建立，與張家松等[28]研究結(jié)果一致。在生物絮團(tuán)養(yǎng)殖系統(tǒng)建立過(guò)程中，有機(jī)碳源作為異養(yǎng)菌的能量來(lái)源，對(duì)于提高異養(yǎng)菌數(shù)量以及生物絮團(tuán)的形成至關(guān)重要[29-31]。研究發(fā)現(xiàn)添加碳源會(huì)加快投加硝化細(xì)菌+枯草芽胞桿菌的3 #系統(tǒng)硝化功能的建立過(guò)程，但添加碳源的3 #系統(tǒng)氨氧化強(qiáng)度低于未投加碳源的1 #系統(tǒng)，分析原因可能為投加有機(jī)碳源加快了枯草芽胞桿菌的繁殖，進(jìn)一步通過(guò)溶解氧、生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)等對(duì)硝化菌的生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生抑制作用，從而降低了系統(tǒng)硝化強(qiáng)度。