人核仁磷酸化蛋白1(NOLC1)影響禽流感病毒感染過程研究進展

朱春玉， 趙 瑩， 易文富， 劉宏生， 鄭方亮

(遼寧大學 生命科學院，遼寧 沈陽 110036)

禽流感疫情被稱為“雞瘟”，首次發(fā)現(xiàn)于1878年，該疫情導致意大利家雞大量死亡。此后，“雞瘟”在全世界的影響范圍逐漸擴大，直到1955年，Schafer發(fā)現(xiàn)并證實“雞瘟”的罪魁禍首是A型流感病毒，因其感染禽類而被稱為禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)。AIV感染能夠引起禽類從呼吸系統(tǒng)到嚴重全身敗血癥等多種癥狀，通常會引起家禽大批量死亡，給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來毀滅性打擊，自1997年首次報道禽流感感染人致死病例以來，全球爆發(fā)了多次禽流感感染人致死的疫情，給人類健康造成嚴重威脅，因此該病毒是一種人畜共患病毒[1-2]。AIV屬于正黏病毒科，基因組由8條RNA構成，根據(jù)病毒表面神經(jīng)氨酸酶和血凝素的不同分為眾多亞型[3]。目前已經(jīng)確認有7種病毒亞型能夠感染人類，多為H5和H7亞型的高致病性禽流感病毒。禽流感病毒通過表面血凝素(HA)與宿主細胞表面受體的特異性識別結合進入細胞，在宿主細胞內(nèi)復制后最終以出芽的方式釋放。在復制過程中，由其自身編碼的非結構蛋白1(non-structural protein 1，NS1)通過與宿主細胞多種蛋白的相互作用從而調(diào)節(jié)病毒的復制。其中人核仁磷酸化蛋白(nucleolar and coiledbody phosphoprotein 1，NOLC1)，又名hNopp140或Nopp140，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種NS1的相互作用蛋白，該蛋白參與核仁組裝、細胞發(fā)育和腫瘤發(fā)生等過程，同時在禽流感病毒感染過程中也發(fā)揮了重要作用[4]。

1 NOLC1蛋白的結構

NOLC1蛋白是一種核定位信號結合蛋白，大小為140 kDa，最早在大鼠肝細胞核中發(fā)現(xiàn)并鑒定。NOLC1蛋白能在細胞核和細胞質中穿梭[5]，在細胞間期NOLC1蛋白以顆粒狀形態(tài)存在于核仁之中，當細胞進入有絲分裂時期時，NOLC1蛋白的顆粒狀形態(tài)便不復存在，被均勻分配到兩個細胞的細胞質中，隨后與RNA聚合酶Ⅰ發(fā)生相互作用表達rRNA基因，參與核仁發(fā)生的過程[6]。NOLC1蛋白結構特殊，它不具有RNA結合域和富含谷氨酸/精氨酸的鏈段，而是包含保守的N-末端、C-末端以及一個由多個重復的酸性和堿性氨基酸構成的中心結構域。中心結構域由帶正電和帶負電的氨基酸交替組成，最可能的理由是為蛋白之間發(fā)生相互作用提供作用位點[7]。NOLC1蛋白具有多個磷酸化位點，是細胞內(nèi)磷酸化程度最高的蛋白之一[6]。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的可以使NOLC1蛋白磷酸化的蛋白激酶有酪蛋白激酶2(CK2)、細胞周期依賴性激酶2(cdc2激酶)和蛋白激酶A(PKA)[8]。NOLC1蛋白由于含有82個酪蛋白激酶CK2靶序列，因此主要依賴于CK2的磷酸化發(fā)揮作用[9]。同時，NOLC1蛋白還可與CK2結合，作為CK2的高度磷酸化蛋白抑制劑抑制該酶的催化活性[10]。

2 NOLC1蛋白的功能

現(xiàn)有研究證明，NOLC1蛋白能夠與多種核仁蛋白及核仁生物合成相關蛋白相互作用。NOLC1蛋白含有一段名為Nopp140.24的核定位信號序列，能夠保證其在細胞核和細胞質中穿梭[6]。NOLC1蛋白能夠同RNA聚合酶Ⅰ相互作用調(diào)節(jié)rRNA的合成，參與核仁裂解、組裝和維持完整的過程[11]。NOLC1蛋白能夠與核仁小核糖蛋白體顆粒(snoRNP)發(fā)生相互作用，幫助snoRNP在Cajal小體(Cajal body,CB)內(nèi)組裝成熟后穿過不同的核間隔并轉運到核仁中發(fā)揮作用[12]。He等[13]研究發(fā)現(xiàn)果蠅的Nopp140基因缺失會誘導亞細胞核糖體發(fā)生病變。Lee等[14]證實了新桿狀線蟲的一種核仁蛋白DAO-5基因是Nopp140基因家族的成員之一，DAO-5基因對早期胚胎細胞的細胞核的生物合成具有重要作用，DAO-5基因會導致cep-1基因發(fā)生反式激活進而降低rDNA的轉錄速率，誘導核糖體發(fā)生病變，生殖細胞系發(fā)生凋亡。

NOLC1蛋白還參與炎癥發(fā)生、細胞生長、細胞凋亡、腫瘤發(fā)生等相關信號通路的調(diào)控。Hwang 等[15]研究發(fā)現(xiàn)干擾NOLC1可以抑制鼻咽癌細胞的增殖，促進細胞的凋亡，其機制為NOLC1蛋白通過與TP53區(qū)的啟動子結合并與TP53的協(xié)同作用來調(diào)節(jié)MDM2表達，從而參與鼻咽癌的調(diào)節(jié)，這表明NOLC1蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起致癌基因的作用。NOLC1蛋白在肝癌細胞的生存發(fā)展中同樣具有十分關鍵的作用。與非癌細胞相比，NOLC1在肝腫瘤組織中被沉默或下調(diào)[4]。轉錄因子NF-κB和CREB能夠通過與NOLC1的最小啟動子結合對NOLC1蛋白的表達進行調(diào)控，通過對NOLC1啟動子的激活作用上調(diào)NOLC1的表達[11]。研究發(fā)現(xiàn)抑制NF-κB活化會導致轉化的肝細胞凋亡，從而無法發(fā)展成肝細胞癌[16]；CREB也被證實通過調(diào)節(jié)腫瘤生長、血管生成和細胞凋亡的過程在肝細胞癌進程中發(fā)揮重要作用[17]，以上可能是NOLC1調(diào)節(jié)肝癌細胞發(fā)生的作用機制。NOLC1蛋白在肺癌腫瘤發(fā)生的調(diào)節(jié)中也發(fā)揮作用，但具體作用機制仍未明了，肺癌腫瘤的抑制可能與受到p53上調(diào)導致的NOLC1下調(diào)有關[18-19]。

研究發(fā)現(xiàn)過表達和敲降NOLC1都會導致肺癌細胞凋亡增加，但過表達NOLC1會更加促進肺癌細胞凋亡。過表達NOLC1對肺癌細胞的促凋亡率明顯高于正常細胞，其可能通過線粒體介導的細胞凋亡途徑、TNF-α介導的細胞凋亡途徑以及cyclin Y介導的細胞凋亡途徑共同誘導肺癌細胞發(fā)生凋亡。實驗通過檢測線粒體膜電位發(fā)現(xiàn)過表達NOLC1使肺癌細胞膜電位下降，增加了肺癌細胞早期細胞凋亡的比例。進一步的qRT-PCR顯示促凋亡基因如TNF-α、BAX和CASP8均上調(diào)，這表明NOLC1的過表達能使NF-κB轉錄活性增強和TNF-α表達增加，這將導致細胞凋亡的發(fā)生。Western blot顯示caspase-8表達的上調(diào)和cyclin Y表達的下調(diào)，這表示NOLC1的過表達導致的細胞凋亡與cyclin Y介導的細胞凋亡途徑有關，但具體機制仍未明確，需要進一步的研究探索(結果待發(fā)表)。

3 NS1蛋白與NOLC1蛋白的相互作用

NS1蛋白是A型流感病毒唯一的非結構蛋白，NS1蛋白在不同亞型的禽流感病毒中均有表達，高度保守。NS1具有多種功能，如抑制宿主自身細胞蛋白的合成、調(diào)節(jié)流感病毒的致病力的大小、調(diào)控宿主細胞產(chǎn)生干擾素等，還具有促進和抑制凋亡的雙重作用[20-21]。宿主細胞被禽流感病毒侵染后，病毒的NS1與宿主細胞中的蛋白發(fā)生相互作用，通過調(diào)節(jié)宿主蛋白的分布、增強病毒蛋白的表達以及調(diào)節(jié)細胞周期等方式影響病毒的復制進程。

Zhu等通過T7噬菌體展示方法篩選發(fā)現(xiàn)NS1蛋白與NOLC1蛋白間存在特異性相互作用[22]，該作用也得到了免疫共沉淀、pull down等實驗的證實[23]。進一步研究表明NOLC1和NS1蛋白同時表達于細胞核內(nèi)，這為二者的相互作用奠定了空間基礎。Zhu等通過截短體及點突變等方式進一步確定了NS1蛋白與NOLC1蛋白相互作用發(fā)生在NS1效應結構域的第104～200位氨基酸區(qū)域[23]，并證實NS1蛋白第120位D和第195位R是參與NS1與NOLC1蛋白相互作用的關鍵氨基酸位點[24]。氨基酸序列比對表明第120位D和第195位R在A型流感病毒不同亞型NS1蛋白中具有高度保守性，由此可見NS1-NOLC1相互作用在所有A型流感病毒中具有普遍性。

4 NOLC1蛋白對流感病毒感染過程的影響

流感病毒的感染過程包括病毒侵入、病毒復制和宿主細胞對病毒的免疫反應等幾方面。NS1蛋白在病毒復制及應對宿主細胞免疫反應過程中發(fā)揮著重要作用，鑒于NS1蛋白和NOLC1蛋白存在相互作用，而且NOLC1蛋白在細胞周期調(diào)控、細胞凋亡和炎癥反應中扮演重要角色，兩者的相互作用必然影響病毒的復制進程。

4.1 NOLC1蛋白在流感病毒侵入后對宿主細胞的影響

研究表明NOLC1蛋白與NS1相互作用后會促進流感病毒敏感細胞A549細胞的凋亡，NS1蛋白與NOLC1蛋白作用強度越大，引起宿主細胞凋亡程度越高。研究表明，這與CK2存在一定的關系，CK2能夠通過磷酸化一系列細胞凋亡相關因子發(fā)揮其抗凋亡的作用，影響細胞的生長發(fā)育，抑制或過表達CK2都會影響細胞的生長周期及凋亡情況，因此CK2被認為是細胞凋亡的抑制劑之一，與多種癌癥相關。NOLC1含有多個CK2特異的磷酸化位點，CK2對NOLC1廣泛磷酸化后，磷酸化的NOLC1又可以與CK2發(fā)生相互作用從而抑制CK2活性[25]。進一步實驗發(fā)現(xiàn)NS1與NOLC1相互作用還會抑制CK2的表達，因此可以推斷NS1與NOLC1相互作用在降低CK2表達量的同時還抑制了其活性，從而促進了細胞凋亡。

4.2 NOLC1蛋白對流感病毒復制的影響

禽流感病毒的感染開始于病毒表面HA與細胞表面唾液酸α-2,3或α-2,6受體糖蛋白的結合，通過內(nèi)吞作用使病毒進入受體細胞[26]。在內(nèi)體小泡內(nèi)，病毒粒子HA蛋白被蛋白酶水解，構象發(fā)生改變使得位于HA N端的融合肽暴露，促使病毒囊膜與內(nèi)體小泡進行膜融合，病毒的核糖核蛋白體(vRNP)復合物從病毒內(nèi)釋放進入細胞質，然后轉運至細胞核。vRNP在細胞核內(nèi)進行病毒基因的轉錄和復制[27-28]。病毒基因的轉錄和復制需要依賴病毒的RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)，Rdrp是由PA、PB1和PB2蛋白質組成的三聚體復合物，RdRp與核蛋白NP一起構成病毒轉錄復制的最小單位。病毒RNA轉錄出互補的正義RNA鏈并以此為模板復制出更多的病毒RNA作為子代病毒的基因組[29-30]。同時病毒轉錄出mRNA，并進入細胞質翻譯，所翻譯出的PA、PB1、PB2和NP等蛋白重新進入細胞核，與病毒子代RNA結合形成子代vRNPs，隨后vRNP將會在核輸出蛋白(NEP)和基質蛋白1(M1)的協(xié)助下轉運進入細胞質中進行包裝。所表達的病毒胞膜蛋白NA、HA和M2在高爾基體內(nèi)修飾后嵌入細胞膜內(nèi)，M1協(xié)助vRNP和成熟的胞膜蛋白組成子代病毒顆粒并出芽，最后，由NA蛋白切割宿主細胞膜與病毒囊膜之間連接的唾液酸受體糖蛋白，將吸附在宿主細胞膜上的子代病毒粒子釋放出來[31]。

研究發(fā)現(xiàn)，NS1與NOLC1相互作用能夠影響病毒的復制。通過進行NOLC1的敲降和過表達發(fā)現(xiàn)，過表達NOLC1能夠促進病毒的復制，而敲降NOLC1穩(wěn)轉株則抑制流感病毒的復制，這表示病毒的復制水平與宿主內(nèi)NOLC1的表達量存在正相關的關系。由此可以推測，病毒進入細胞后，NS1通過與NOLC1結合影響了NOLC1的正常功能，從而降低了細胞內(nèi)病毒的復制水平。進一步研究表明，在禽流感病毒感染宿主細胞后的48 h內(nèi)，NOLC1 mRNA的表達量整體呈下降趨勢。這說明病毒不但通過NS1的結合抑制了NOLC1，而且還通過其他方式降低NOLC1的表達量從而進一步影響了NOLC1的功能(結果待發(fā)表)。鑒于NOLC1具有調(diào)節(jié)細胞周期的功能，可以推斷NS1與NOLC1的結合干擾了NOLC1的正常功能，促進了細胞的凋亡，從而影響了病毒的復制。另一方面，NOLC1具有調(diào)節(jié)炎癥反應的功能，NS1與NOLC1相互作用可能會影響宿主細胞內(nèi)某些抗病毒反應細胞因子的表達或某些與炎癥發(fā)生相關的信號通路，從而影響宿主細胞的天然免疫反應，影響病毒復制。這些問題的具體機制還有待進一步研究闡明。

5 展 望

禽流感是一種四季均可發(fā)病且具有嚴重預后的傳染病之一，因此防控其發(fā)生及疾病治療十分重要。禽流感病毒自身表達的非結構蛋白1(NS1)作為影響病毒復制的重要蛋白，是唯一不包裝到病毒顆粒的蛋白，并大量產(chǎn)生于感染細胞中，其能夠與宿主細胞內(nèi)如NOLC1蛋白等多種蛋白發(fā)生相互作用，是決定病毒感染能力的重要因素。人核仁磷酸化蛋白NOLC1，是一個高度磷酸化的哺乳動物蛋白，在細胞中與RNA聚合酶I相互結合，參與核仁的發(fā)生，調(diào)節(jié)rDNA(核糖體DNA)的轉錄，同時也參與到炎癥發(fā)生、細胞生長、細胞凋亡、腫瘤發(fā)生等相關信號通路的調(diào)控，對細胞生命周期在時間上的長短調(diào)控起到了十分重要的作用，這些細胞活動均與病毒感染有著密不可分的聯(lián)系，因此對非結構蛋白1(NS1)和NOLC1的研究在甲型禽流感病毒的致病機理、傳播及治療等眾多領域都具有深遠而重大的意義。

我們依據(jù)現(xiàn)有的研究證明NS1與NOLC1的相互作用能夠影響宿主細胞凋亡和病毒的復制，這只能在現(xiàn)象上說明NOLC1會影響流感病毒感染宿主細胞的進程，但更為精細的分子機制還需要深入研究。為了進一步明確NOLC1蛋白在禽流感病毒感染過程中的作用，我們在本實驗室前期研究成果基礎上擬通過反向遺傳學技術(即感染性克隆)拯救出NS1基因定點突變的甲型禽流感病毒，通過比較野生型病毒和突變病毒，在活病毒水平探究NS1與NOLC1的相互作用對病毒復制增殖、宿主細胞活性及細胞周期的影響。明確NOLC1蛋白在流感病毒感染過程中的作用及方式，將進一步揭示流感病毒感染宿主細胞的分子機制，并為新的抗流感病毒藥物的研發(fā)提供新的靶點和方向。

另一方面，由于NOLC1蛋白是人體細胞信號通路調(diào)控的一類非常重要的蛋白，病毒感染后NOLC1和NS1兩蛋白的相互作用必然對諸多細胞活動造成影響，比如對炎癥反應的信號通路的影響，與NS1作用后能否繼續(xù)與IP6共同對蛋白激酶CK2有調(diào)控作用，以及感染后NOLC1對端粒重復結合因子(TRF2)的調(diào)節(jié)等等。目前，NOLC1蛋白的分子功能研究報道較少，因此其對流感病毒感染影響的機制還有很多可深入研究的內(nèi)容，探明NOLC1對這些信號調(diào)控的具體分子機制不但具有一定的理論意義，而且能夠為新的抗病毒藥物的設計提供依據(jù)，具有十分重要的應用價值。