文化遺產(chǎn)微生物研究方法進(jìn)展

武發(fā)思，蘇敏#，田恬，汪萬(wàn)福,2,3,4，馮虎元*

(1. 蘭州大學(xué) 細(xì)胞活動(dòng)與逆境適應(yīng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；2. 敦煌研究院 國(guó)家古代壁畫與土遺址保護(hù)工程技術(shù)研究中心，甘肅 敦煌 736200；3. 古代壁畫保護(hù)國(guó)家文物局重點(diǎn)科研基地，甘肅 敦煌 736200；4. 甘肅省古代壁畫與土遺址保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 敦煌 736200)

文化遺產(chǎn)是指具有歷史、藝術(shù)和科學(xué)價(jià)值的文物。文化遺產(chǎn)類型多樣，主要包括歷史文物、歷史建筑和人類文化遺址等,其構(gòu)成材料千差萬(wàn)別，但微生物幾乎可以作用于任何材質(zhì)的文化遺產(chǎn)，造成其污損、退化甚至降解[1]，因此微生物對(duì)文化遺產(chǎn)的作用形式體現(xiàn)在多個(gè)方面(表1)。大多文化遺產(chǎn)和歷史建筑物長(zhǎng)期暴露在環(huán)境污染、化學(xué)處理及多變的氣候因素之中，這促進(jìn)了微生物的定殖和生長(zhǎng)代謝,導(dǎo)致其在物理結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成或美學(xué)特征方面發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的改變和損傷(圖1)，通常稱之為生物退化[2]。對(duì)于文化遺產(chǎn)系統(tǒng)科學(xué)的分析可以追溯到20世紀(jì)80年代，20世紀(jì)初已有地衣和植物體導(dǎo)致歷史紀(jì)念碑生物退化的相關(guān)報(bào)道[3]，早期針對(duì)文化遺產(chǎn)生物退化的大多數(shù)先驅(qū)研究都總結(jié)發(fā)表在了1991年的《國(guó)際生物退化和生物降解》特刊上[4]。從研究方法上來(lái)看，傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法在研究文化遺產(chǎn)微生物類型、生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)中被普遍使用，而由于該方法在微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性等研究中的自身局限性，促使研究人員不斷探索更為復(fù)雜和高效的方法與技術(shù)，如近年不斷更新的成像技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)和組學(xué)相關(guān)的代謝分析技術(shù)等。我國(guó)在文化遺產(chǎn)微生物學(xué)領(lǐng)域的研究目前尚處于探索發(fā)展階段，存在研究方法傳統(tǒng)單一、對(duì)微生物學(xué)中涌現(xiàn)的新技術(shù)應(yīng)用滯后、研究的系統(tǒng)性和連續(xù)性不強(qiáng)等突出問(wèn)題。隨著全球氣候變化加劇、極端天氣頻繁發(fā)生、環(huán)境污染日益加重以及旅游業(yè)的高速發(fā)展，文化遺產(chǎn)保護(hù)中面臨的微生物問(wèn)題日益凸顯，開展深入研究的需求十分迫切。為此，本文以文化遺產(chǎn)微生物病害及其防治研究方法為主線(圖2)，探討了國(guó)內(nèi)外相關(guān)方法技術(shù)的應(yīng)用范圍和已取得的最新進(jìn)展，以期為相關(guān)學(xué)者在研究方法與技術(shù)選擇及研究路線設(shè)計(jì)中提供借鑒，同時(shí)推動(dòng)我國(guó)文化遺產(chǎn)微生物學(xué)研究領(lǐng)域向前發(fā)展。

表1 文化遺產(chǎn)微生物退化與降解相關(guān)術(shù)語(yǔ)

圖1 文化遺產(chǎn)的生物退化、生物風(fēng)化及生物污損Fig.1 Biodeterioration, bioweathering and biofouling of cultural heritage

a: 敦煌莫高窟古代壁畫的微生物退化; b: 咸陽(yáng)乾陵石質(zhì)文物的生物風(fēng)化; c: 柬埔寨吳哥窟遺址的生物風(fēng)化; d: 洛陽(yáng)龍門石窟石質(zhì)造像的生物污損; e: 南昌?；韬钅管囻R陪葬坑的生物污損

a: Microbial deterioration ancient wall painting of Mogao Grottoes; b: Bioweathering of stone relics of Qianling Mausoleum; c: Biodeterioration of Angkor Wat in Cambodia; d: Biofouling of stone statue of Longmen Grottoes in Luoyang; e: Biofouling of burial chariot pit around the tomb of Haihonghou tomb in Nanchang

圖2 文化遺產(chǎn)微生物主要研究方法與技術(shù)框架Fig.2 The mainly framework of methods and techniques for cultural heritage microbial research

1 傳統(tǒng)基于培養(yǎng)的方法

縱觀多數(shù)環(huán)境微生物的研究歷史，現(xiàn)有知識(shí)主要來(lái)源于基于培養(yǎng)的方法。要研究文化遺產(chǎn)微生物，首先需要對(duì)出現(xiàn)在遺產(chǎn)材料上的微生物進(jìn)行表征和鑒定。在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)微生物，并維持和控制其生長(zhǎng)，是開展不同類群生長(zhǎng)和代謝特征研究最直接和最有效的方式。基于培養(yǎng)的技術(shù)包括通過(guò)利用富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基或寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，對(duì)菌株進(jìn)行富集和分離純化，其中富集培養(yǎng)應(yīng)用較為廣泛。分離得到的純菌株可以表征其生理生化等方面特性，因培養(yǎng)條件下的任何改變都可以直接歸因于菌體的生物學(xué)過(guò)程。表2對(duì)文化遺產(chǎn)微生物研究中常見(jiàn)術(shù)語(yǔ)和技術(shù)的縮略詞和釋義進(jìn)行了匯總。

Ikner等[7]在對(duì)亞利桑那州卡特那洞穴的研究中，用無(wú)菌棉簽蘸取無(wú)菌水擦拭有涂料的玻璃纖維和巖石表面，培養(yǎng)分離獲得純培養(yǎng)菌株，并利用16S rRNA 的PCR擴(kuò)增和測(cè)序技術(shù)鑒定了90個(gè)特定菌株。本課題組近年通過(guò)空氣微生物采樣、分離培養(yǎng)和測(cè)序等技術(shù)對(duì)敦煌莫高窟洞窟內(nèi)外空氣細(xì)菌[9-10]與真菌[11-12]濃度和多樣性的時(shí)空變化特征進(jìn)行了研究，并對(duì)搬遷復(fù)原保存于甘肅省博物館的嘉峪關(guān)魏晉五號(hào)墓內(nèi)外空氣微生物進(jìn)行了比較分析[13]，研究結(jié)果為石窟與墓葬環(huán)境空氣質(zhì)量評(píng)估及旅游開放提供了重要依據(jù)。

微生物學(xué)家在過(guò)去10年中引入了一些旨在滿足微生物生長(zhǎng)需求并能更好地模擬其自然條件的創(chuàng)新技術(shù)，試圖通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中微量元素和改變培養(yǎng)條件來(lái)獲得新菌株。模仿自然條件可以提高培養(yǎng)新菌株的成功率，但這種方法的效率卻很低[14]。而通過(guò)研發(fā)的選擇性培養(yǎng)基富集具有生物礦化功能的本土微生物，已被證明可用于風(fēng)化石質(zhì)文物的加固和保護(hù)[15]。

表2 縮略詞及其釋義

2 表觀形態(tài)學(xué)方法

表觀和形態(tài)學(xué)方法指涉及視覺(jué)和微生物物理外觀等方面的研究方法。環(huán)境樣品微生物的可視化及其活性研究長(zhǎng)期以來(lái)是微生物多樣性研究中的重要內(nèi)容。顯微技術(shù)常常依賴于基于培養(yǎng)的方法，對(duì)微生物樣本的微觀檢查是開展更為復(fù)雜研究的基本步驟。

2.1 顯微鏡技術(shù)

2009年，Santos及其同事[16]使用掃描電鏡-能譜分析儀(SEM-EDX)、環(huán)境掃描電鏡(ESEM)和熒光原位雜交技術(shù)(FISH)檢查了西班牙托萊多大教堂基督十字架油畫。分析表明：細(xì)菌和真菌的生物膜結(jié)構(gòu)與壁畫顏料層緊密結(jié)合；SEM-EDX分析在描述顏料與微生物群落間的相關(guān)性方面發(fā)揮了重要作用。例如，細(xì)菌是銅基顏料的主要污染物，并且在朱砂中的豐度低，在這兩類顏料中也存在少量真菌。同年Cappitelli 等[5]對(duì)意大利圣布里齊奧教堂中路加·西諾雷利壁畫上的玫紅色斑點(diǎn)進(jìn)行了全面研究，通過(guò)光學(xué)熒光顯微鏡和掃描電鏡(SEM)檢查了斑點(diǎn)中是否存在微生物及其大小和分布，發(fā)現(xiàn)形成生物膜的微生物細(xì)胞主要是直徑大于5 μm的球形細(xì)胞，樣本的自發(fā)熒光信號(hào)結(jié)果呈陽(yáng)性，而掃描電鏡分析顯示囊狀球菌細(xì)胞占主導(dǎo)地位。

Coutinho等[19]發(fā)表過(guò)關(guān)于一幅20世紀(jì)20年代后期釉面瓷磚上微生物的研究報(bào)告。光合微生物在藝術(shù)瓷磚上定殖，并影響釉面表現(xiàn)出部分剝落現(xiàn)象。作者使用LM識(shí)別了其中的部分微生物：兩種綠藻，一種真菌和一些不發(fā)達(dá)的地衣，使用此技術(shù)揭示了地衣演化過(guò)程的第一階段，并使用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(FESEM)來(lái)確定表面形貌、微生物形態(tài)和分布及其與基底材料的關(guān)系。FESEM圖像呈現(xiàn)了玻璃表面和材料內(nèi)部的生物膜，及胞外聚合物(EPS)對(duì)絲狀生物的黏附力。激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)的使用實(shí)現(xiàn)了對(duì)瓷磚上生物膜的生物學(xué)表征，其主要由細(xì)菌、藍(lán)藻、微型藻和一些地衣組成，從而證實(shí)了LM的觀察結(jié)果；而熒光模式的CLSM顯示出了光合色素和用刀豆球蛋白A鑒定的EPS小斑點(diǎn)，使用CLSM獲得的3D圖像還可用來(lái)確定生物膜結(jié)構(gòu)并測(cè)量其厚度。同樣，Cennamo及其同事[20]使用LM和SEM確定了生長(zhǎng)在意大利那不勒斯歷史遺址黃色凝灰?guī)r上的由藍(lán)藻和其他藻類形成的光合生物膜，利用SEM觀測(cè)證實(shí)了生物膜與石質(zhì)底物間的聯(lián)系，并表明藍(lán)藻緊密黏附在凝灰?guī)r上，而其他藻類則分布在其表面。Jrondi等[15]利用SEM-EDS、TEM和原子力顯微鏡(AFM)等從納米尺度上表征了產(chǎn)碳酸細(xì)菌群落的微生物礦化進(jìn)程和產(chǎn)物特征。本課題組近年使用SEM技術(shù)對(duì)存在于莫高窟、天梯山和麥積山壁畫彩塑上的微生物形貌特征進(jìn)行了分析研究，確定了菌體的存在形式、分布特點(diǎn)及其菌絲生長(zhǎng)對(duì)壁畫結(jié)構(gòu)的影響[21-23]。顯微鏡成像技術(shù)在文化遺產(chǎn)生物學(xué)研究中的應(yīng)用將會(huì)更為廣泛和深入。

2.2 光學(xué)熒光和光譜技術(shù)

真菌可對(duì)多種文化遺產(chǎn)材料造成侵蝕，對(duì)真菌污染進(jìn)行清除的成本很高，且可能造成新的損傷，常見(jiàn)微生物生物量檢測(cè)方法昂貴又耗時(shí)。因真菌生物量與熒光強(qiáng)度成線性關(guān)系，熒光測(cè)定法被用來(lái)檢測(cè)真菌對(duì)文化遺產(chǎn)材料的破壞性，以及材料表面是否使用過(guò)其他化學(xué)成分和溶液。Konkol等[24]對(duì)一種簡(jiǎn)單的熒光測(cè)定方法進(jìn)行了微調(diào)，用于檢測(cè)如紙張、帆布和大理石基質(zhì)等各類文物上的真菌生物量[25]，這種能在45 min內(nèi)完成的快速熒光測(cè)定的方法可檢測(cè)到早期生長(zhǎng)在紙質(zhì)文物上的真菌，從而幫助圖書檔案管理人員有效地保護(hù)資料，或及時(shí)制定補(bǔ)救措施。對(duì)該方法的進(jìn)一步改進(jìn)[26]，使其成為在無(wú)法應(yīng)用其他復(fù)雜檢測(cè)設(shè)備時(shí)的一個(gè)最佳選擇，因其只需一個(gè)紫外燈在很短時(shí)間就可完成測(cè)定，通過(guò)成像軟件(如常用于掃描瓊脂糖凝膠的軟件)進(jìn)行半定量和熒光量測(cè)定。

在對(duì)西班牙花崗巖類石質(zhì)文物的研究中，Sanmartín等[27]通過(guò)微調(diào)花崗巖遠(yuǎn)程色彩測(cè)量方法，成功測(cè)定了6個(gè)商業(yè)品種的顏色，這表明數(shù)碼相機(jī)和圖像處理技術(shù)在色彩測(cè)量裝置中的應(yīng)用已越來(lái)越多。Coutinho等[19]對(duì)藝術(shù)瓷磚損壞現(xiàn)象的研究中，運(yùn)用數(shù)字圖像分析技術(shù)確定了生物膜的覆蓋面積，根據(jù)此方法對(duì)定殖在釉面不同的真菌圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(PCA)，以識(shí)別生物污染區(qū)域。Jrondi等[15]通過(guò)拉曼光譜(Roman spectrum)驗(yàn)證了細(xì)菌礦化過(guò)程中方解石的生成。熒光和光譜技術(shù)今后必將在文化遺產(chǎn)圖像信息提取[28]和微生物病害研究中具有更為廣闊的應(yīng)用。

3 分子生物學(xué)方法

近年來(lái)，分子生物學(xué)相關(guān)方法和技術(shù)在揭示文化遺產(chǎn)微生物退化機(jī)制中發(fā)揮了重要作用，相關(guān)技術(shù)為鑒定、表征和描述微生物多樣性打開了新的大門。現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)和儀器可在更大范圍內(nèi)揭示生物膜中隱藏的微生物多樣性信息。同時(shí)，分子生物學(xué)在研究微生物功能方面已推動(dòng)了醫(yī)學(xué)和環(huán)境生物學(xué)等不同領(lǐng)域的重大發(fā)展。然而，分子生物學(xué)方法在文化遺產(chǎn)微生物學(xué)研究中應(yīng)用的時(shí)間還不長(zhǎng)。與培養(yǎng)方法相比，分子技術(shù)相對(duì)快速和可靠。在過(guò)去10年中，許多基于核酸的技術(shù)被廣泛用于微生物群落分析，DNA和RNA檢測(cè)和分析方法在文化遺產(chǎn)的生物退化研究中取得了較大進(jìn)展。隨著如基因組學(xué)、蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)等生物信息學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，微生物生態(tài)學(xué)研究的廣度和深度必將大大增加。微生物響應(yīng)其所處環(huán)境所產(chǎn)生的代謝物的分析可為微生物功能研究提供有用的途徑，宏基因組學(xué)和高通量測(cè)序的快速發(fā)展使得這些方法更易于在多種環(huán)境中使用，其不僅可以表征微生物多樣性，還可以更好地了解微生物群落在自然環(huán)境中的功能、活動(dòng)特征及其動(dòng)態(tài)[29-31]。

3.1 基于核酸分析的方法

目前，該領(lǐng)域的研究者可以充分利用分子技術(shù)，以不依賴于培養(yǎng)的方式對(duì)原位微生物進(jìn)行高靈敏度的檢測(cè)和鑒定，還可以利用電子顯微鏡之外的各種物理和化學(xué)表征方法，實(shí)時(shí)和三維分析微生物與底物間的相互作用。在20世紀(jì)80年代和90年代，PCR作為一項(xiàng)革命性的技術(shù)，能夠在不需要培養(yǎng)的條件下，定性檢測(cè)和定量分析不可培養(yǎng)微生物及整個(gè)復(fù)雜的群落結(jié)構(gòu)特征。

以核酸為基礎(chǔ)的各類方法都是基于rRNA或其他基因片段的PCR擴(kuò)增，再采用變性梯度凝膠電泳(DGGE)或克隆文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序；rRNA是目前在微生物分子鑒定中最為有用以及應(yīng)用最廣泛的分子標(biāo)記，由于其功能上高度保守，序列上包含可區(qū)分分類群的高變區(qū)；細(xì)菌和古菌16S rRNA基因(或18S / 28S rRNA基因/真菌的基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)區(qū)域)是識(shí)別的首選基因，而基因數(shù)據(jù)庫(kù)已發(fā)展到可以鑒定到物種的精確度。

在羅馬尼亞17世紀(jì)木質(zhì)教堂的微生物研究中，Lupan等[32]利用培養(yǎng)和分子技術(shù)分離并鑒定了木材上細(xì)菌和真菌群落的變化?；驒z測(cè)方法相比傳統(tǒng)鑒定方法更為省時(shí)，而傳統(tǒng)培養(yǎng)和觀察菌絲及孢子形態(tài)的鑒定手段一般需要數(shù)天至數(shù)周時(shí)間。對(duì)列入世界文化遺產(chǎn)的智利18至19世紀(jì)奇洛埃木制教堂也進(jìn)行過(guò)類似研究[33]，在木材中檢測(cè)到了白色、棕色和軟腐真菌；通過(guò)ITS區(qū)測(cè)序確定了大量木腐真菌，其中一些種屬在智利是首次被報(bào)道。Kusumi等[34]研究了柬埔寨12世紀(jì)巴戎寺砂巖的生物膜形成，使用PCR擴(kuò)增后用DGGE對(duì)生物膜中群落組成進(jìn)行了分析。DGGE技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)源于單個(gè)條帶容易分離后構(gòu)建克隆文庫(kù)，再測(cè)序鑒定，條帶的濃度可以反映出類群的豐度。另一項(xiàng)研究調(diào)查了巴戎寺真菌及其在群落演替中的作用[35]，通過(guò)分離真菌菌絲體、PCR擴(kuò)增、ITS區(qū)域測(cè)序及β-tubulin基因分析完成了真菌鑒定，使用兩個(gè)獨(dú)立的基因使鑒定更為準(zhǔn)確。Kusumi等[34]選用DGGE技術(shù)區(qū)分石材上生物膜的空氣來(lái)源，通過(guò)克隆文庫(kù)技術(shù)鑒定了生物膜樣品常見(jiàn)的種屬。

我國(guó)研究者應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)云岡石窟石質(zhì)文物樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行過(guò)分析研究[36]。吳明輝等[37]回顧了石生微生物的分類、分布、研究方法、生態(tài)適應(yīng)等方面的研究進(jìn)展，并探論了其與石質(zhì)文物保護(hù)間的關(guān)系。在對(duì)莫高窟壁畫微生物研究中，本課題組運(yùn)用PCR、克隆文庫(kù)和測(cè)序技術(shù)鑒定了壁畫表面白色菌斑中的細(xì)菌群落組成[21]；通過(guò)采用培養(yǎng)和分子方法研究了石窟可培養(yǎng)微生物在不同pH，鹽度和溫度范圍內(nèi)的生長(zhǎng)；使用相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)真菌群落與洞窟的建造年代相關(guān)[38]。

以上研究都是根據(jù)常規(guī)PCR，僅能提供定性結(jié)果。而通過(guò)定量PCR(qPCR)進(jìn)行定量分析則更為有趣，該測(cè)定可基于標(biāo)準(zhǔn)曲線評(píng)估模板的濃度。Meng等[39]使用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR方法比較了吳哥窟巴戎寺4個(gè)位點(diǎn)氨氧化古菌(AOA)和氨氧化細(xì)菌(AOB)的豐度，發(fā)現(xiàn)AOA基因豐度明顯高于AOB，這兩類功能菌群在氮循環(huán)中發(fā)揮著重要作用，其活性影響產(chǎn)酸過(guò)程并導(dǎo)致砂巖劣化。Kraková等[40]使用功能基因表征了博物館木質(zhì)和紙質(zhì)文物上的真菌，運(yùn)用可預(yù)測(cè)纖維素分解活性的基因引物，即纖維二糖水解酶I(cbh I)，并通過(guò)cbhI和ITS區(qū)鑒定分離的真菌，此類功能基因可用于表征微生物活性及其對(duì)文化遺產(chǎn)侵蝕能力的評(píng)估。根據(jù)對(duì)羅馬地下墓穴的研究，Krakova等[41]建議同時(shí)使用多種方法；雖然分子方法可快速獲得微生物多樣性的可重復(fù)數(shù)據(jù)，但如果沒(méi)有培養(yǎng)的菌株，就很難研究材料劣化的生物化學(xué)過(guò)程。

基于核酸的分子方法優(yōu)勢(shì)明顯，不需培養(yǎng)從而節(jié)省時(shí)間，并可獲得大量微生物信息，檢測(cè)敏感度更高。其局限性在于不能對(duì)代謝潛能做出判斷，雖然基因功能預(yù)測(cè)方法正在快速發(fā)展，基于mRNA的基因表達(dá)預(yù)測(cè)今后將更為普遍。

3.2 熒光原位雜交技術(shù)

熒光原位雜交技術(shù)是根據(jù)已知微生物不同分類級(jí)別上種群特異的DNA序列，以利用熒光標(biāo)記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，與環(huán)境樣品基因組中DNA分子雜交，然后通過(guò)熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡直接觀察和定量該特異微生物種群的存在與豐度[42]。具有不同熒光團(tuán)的多個(gè)熒光探針可應(yīng)用于同一樣本，以便同時(shí)觀察多個(gè)類群。由于熒光原位雜交(FISH)靶向rRNA轉(zhuǎn)錄，只有足夠核糖體數(shù)量的活性微生物體才會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號(hào)。

May等[43]已討論了熒光原位雜交技術(shù)在細(xì)菌生物退化中的作用。González-Pérez等[44]近期開發(fā)了一種RNA-FISH雙染懸浮法用于細(xì)菌和酵母的瞬時(shí)檢測(cè)，該技術(shù)可以證實(shí)那些直接參與文化遺產(chǎn)生物退化的活性微生物，通過(guò)RNA-FISH懸浮法，利用流式細(xì)胞儀(Flow cytometry)分析微生物群落也會(huì)成為可能。將這一技術(shù)應(yīng)用到葡萄牙阿倫特霍埃斯庫(kù)爾洞舊石器時(shí)代考古遺址上樣品的檢測(cè)，并深入討論了探針標(biāo)記熒光染料對(duì)分析結(jié)果的影響。

3.3 新興技術(shù)和生物信息學(xué)工具

近年來(lái)，新一代測(cè)序(NGS)技術(shù)被應(yīng)用于單個(gè)生物體全基因組研究，尤其是宏基因組學(xué)，已成為深入了解微生物多樣性的重要工具。全新的DNA測(cè)序技術(shù)能同時(shí)對(duì)幾十萬(wàn)甚至幾億的DNA分子進(jìn)行平行測(cè)定，與傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)相比具有高通量、高敏感性等優(yōu)勢(shì)，因此被稱作“高通量測(cè)序技術(shù)”，是對(duì)傳統(tǒng)Sanger測(cè)序的革命性改革。隨著技術(shù)成熟，費(fèi)用降低和實(shí)驗(yàn)周期縮短，使其大量應(yīng)用于臨床診斷和科學(xué)研究及單一生物的全基因組研究，實(shí)現(xiàn)了對(duì)各類環(huán)境樣品的深入測(cè)序和數(shù)據(jù)分析。

Vasanthakumar等[45]使用454焦磷酸測(cè)序研究了埃及圖坦卡蒙墓壁畫上的微生物群落，為壁畫棕色菌斑的形成機(jī)制提供了重要證據(jù)。雖然下一代測(cè)序在文化遺產(chǎn)領(lǐng)域仍屬新的技術(shù)，但它是當(dāng)前微生物群落分析的最佳選擇。本課題組應(yīng)用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)天水麥積山石窟和武威天梯山石窟壁畫微生物進(jìn)行了全面研究，評(píng)估了壁畫病害菌群落結(jié)構(gòu)特征及其劣化過(guò)程[22-23]。其他學(xué)者，如Xu等[46]運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)研究了考古埋藏環(huán)境中細(xì)菌多樣性和群落分布；Li等[47]運(yùn)用該技術(shù)分析了石質(zhì)文物上微生物群落，討論了微生物誘導(dǎo)的碳酸鈣沉降。

生物信息學(xué)工具已普遍應(yīng)用到文化遺產(chǎn)微生物學(xué)研究中，如16S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育樹分析，BLAST-NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的同源性檢索分析[8]，以及運(yùn)用MEGA軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹，如鄰接法(NJ)[48]、最大似然法(ML)和最大簡(jiǎn)約法(MP)等[49]。

高通量平臺(tái)的選擇目前更加多樣化。Adamiak等[50]首次利用半導(dǎo)體芯片測(cè)序技術(shù)平臺(tái)(PGM，Ion TorrentTM)調(diào)查了波蘭羅茲19世紀(jì)磚石質(zhì)歷史建筑上參與生物退化的細(xì)菌、古菌，尤其是嗜鹽微生物的群落結(jié)構(gòu)，并討論了因引物選擇造成的結(jié)果偏離。毫無(wú)疑問(wèn)，新興技術(shù)和生信分析工具在未來(lái)10年將會(huì)有更多突破和發(fā)展，這對(duì)于促進(jìn)文化遺產(chǎn)微生物退化及其防治有重要意義。

4 生物化學(xué)分析

利用生物化學(xué)分析手段，通?？蓹z測(cè)到原位微生物的活力，并判斷因微生物生長(zhǎng)增殖和代謝活動(dòng)對(duì)文化遺產(chǎn)材料造成的可能侵蝕、退化和危害。

4.1 ATP測(cè)定法

三磷酸腺苷(ATP)生物發(fā)光測(cè)定法是一種用于確定微生物活力的較為敏感的方法。Rakotonirainy等[51]應(yīng)用這種方法對(duì)書籍中的斑點(diǎn)進(jìn)行了成功檢測(cè)，通過(guò)分別檢測(cè)書本斑點(diǎn)區(qū)和無(wú)斑點(diǎn)區(qū)，無(wú)斑點(diǎn)區(qū)沒(méi)有檢測(cè)到ATP。但這種方法是有損分析，必須將紙張樣本切下來(lái)，因此該方法不太適用于文化遺產(chǎn)微生物常規(guī)檢測(cè)。在對(duì)17世紀(jì)的羊皮紙手稿的研究中，Troiano等[52]通過(guò)顯微鏡觀察和ATP分析，顯示微生物污染水平很低，表明其變色與當(dāng)前活躍的微生物關(guān)系不大。另外，ATP測(cè)定試劑盒主要是針對(duì)細(xì)菌設(shè)計(jì)的，在病害菌為真菌時(shí)其檢測(cè)能力明顯不足，但ATP法在人為污染的紙張被切碎的情況下能產(chǎn)生可靠數(shù)據(jù)[51]。ATP生物發(fā)光測(cè)定結(jié)果證實(shí)，變色與作為主要損傷來(lái)源活性微生物的定殖可能無(wú)關(guān)。在國(guó)內(nèi)，葛琴雅等[53]利用ATP生物發(fā)光法檢測(cè)了抑菌劑的作用效力，取得了較好的效果。

4.2 酶分析手段

微生物在環(huán)境中的重要功能可通過(guò)測(cè)定酶的方法確定，蛋白質(zhì)分析可用來(lái)檢測(cè)微生物活性，如常見(jiàn)酶測(cè)定的方法已應(yīng)用很多年，但在文化遺產(chǎn)微生物學(xué)中的應(yīng)用卻很有限。

與微生物相關(guān)的酶，如在紙質(zhì)材料上，常存在可降解纖維素的微生物且具有代謝活性。纖維素酶可由真菌產(chǎn)生并在纖維素底物上表達(dá)。Bergadi等[54]研究了分離自古代手稿上的真菌的纖維素酶活性及其對(duì)濾紙的降解能力，通過(guò)使用含羧甲基纖維素(CMC)的培養(yǎng)基，用半定量方式篩選真菌纖維素分解能力，并使用濾紙來(lái)定量測(cè)定其酶活性，這一指標(biāo)是通過(guò)分析在適宜條件下真菌對(duì)濾紙作用時(shí)釋放的還原糖的量來(lái)計(jì)算的，稱其為濾紙酶活(FPU)。Hu等[38]研究發(fā)現(xiàn)，從巴戎寺砂巖中分離的曲霉屬真菌在體外表現(xiàn)出較高的纖維素降解能力，主要測(cè)定了纖維二糖水解酶，半乳糖苷酶和其他纖維素酶。有趣的是，真菌在形成生物膜的區(qū)域生長(zhǎng)可能通過(guò)酶活性消除生物膜，即真菌可能在去除石材表面生物膜方面發(fā)揮重要功能。

此外，一些參與氮或硫循環(huán)的酶在體外也較容易研究。如Villa等[55]分析了古墓石灰石上微生物對(duì)于硫污染的響應(yīng)，測(cè)定了負(fù)責(zé)硫代謝的酶，特別是其基因轉(zhuǎn)錄水平較高的酶。酶分析是微生物生態(tài)學(xué)研究中的有力工具，蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)步增加了酶譜研究的易用性，色譜和質(zhì)譜技術(shù)則提供了極好的靈敏度。隨著大型數(shù)據(jù)庫(kù)的公開，這些優(yōu)越的方法正變得更具吸引力。

4.3 代謝物分析方法

微生物代謝產(chǎn)物可為微生物生態(tài)學(xué)研究提供證據(jù)。微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物，因其具有的各種性質(zhì)在歷史上被廣泛關(guān)注。如鏈霉菌和青霉菌產(chǎn)生抗菌化合物以抵御其他微生物；另一類次級(jí)代謝產(chǎn)物包括色素，如吩嗪(由假單胞菌屬 (Pseudomonasspp.) 和鏈霉菌屬(Streptomycesspp.) 產(chǎn)生)，已被證明在微生物存活和適應(yīng)性中起到關(guān)鍵作用[56]。

文化遺產(chǎn)上微生物代謝產(chǎn)物檢測(cè)相對(duì)容易，一旦發(fā)現(xiàn)黑色素或有機(jī)酸，將有助于設(shè)計(jì)用于微生物分離的特定培養(yǎng)條件。而通過(guò)氣相色譜/質(zhì)譜(GC/MS)和基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)等方法也為代謝物分析提供了巨大的潛力。Kirby等[57]使用多肽質(zhì)量指紋圖譜(一種小分子分析方法)，鑒定了文化遺產(chǎn)上的膠原材料。該方法具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏和具體等優(yōu)勢(shì)。Vasanthakumar等[48]使用GC/MS對(duì)圖坦卡門墓壁畫上棕色斑點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，棕斑中的蘋果酸(一種常見(jiàn)的微生物代謝物)及其形成與青霉菌代謝有關(guān)。色譜和質(zhì)譜方法目前仍處于快速發(fā)展階段，并成為蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)方法的基礎(chǔ)。這些方法已經(jīng)成為微生物學(xué)研究的主流，因此將很快成為文化遺產(chǎn)研究中有用的方法。

另外，Corsaro等[58]使用質(zhì)子高分辨率魔角旋轉(zhuǎn)(HR-MAS)核磁共振(NMR)技術(shù)分別檢測(cè)了古代和人工老化手稿中纖維素降解的代謝物，并檢測(cè)到了纖維中的低分子量化合物。該研究的一個(gè)主要目標(biāo)是展示這種技術(shù)對(duì)文化遺產(chǎn)對(duì)象研究的價(jià)值。Rosa等[59]最近利用核磁共振和表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)研究了分離自法國(guó)拉斯科洞穴史前巖畫上兩株微生物新種(Ochroconislascauxensis和Ochroconisanomala)產(chǎn)生的黑色素結(jié)構(gòu)，其對(duì)巖畫造成了嚴(yán)重污染。上述研究凸顯了代謝物分析方法的最新進(jìn)展，此類方法有望為文化遺產(chǎn)微生物生理生態(tài)學(xué)研究提供可靠數(shù)據(jù)。

5 生物防治方法

生物防治指使用生物殺滅劑及相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行微生物消除，或利用活生物體及產(chǎn)物清洗或清除污染物。在這兩種情況下，該過(guò)程必須尊重藝術(shù)品材料的物理化學(xué)性質(zhì)及其美學(xué)外觀。

5.1 生物清洗方法

然微生物通常對(duì)建筑材料和結(jié)構(gòu)有負(fù)面影響，但越來(lái)越多的證據(jù)表明，它們也可以用作生物清洗過(guò)程中的清潔劑[60-61]。在20世紀(jì)80年代末至90年代初，微生物在文化遺產(chǎn)的修復(fù)或清潔過(guò)程中發(fā)揮了積極的作用。目前，隨著新型微生物技術(shù)的發(fā)展，文化遺產(chǎn)的生物清洗和生物修復(fù)得到了新的關(guān)注。

砂巖表面生物膜對(duì)基底材料的完整性是有害的，它們是造成砂巖破壞的主要生物因素。Hu等[38]對(duì)巴戎寺的研究中觀察到真菌在先前由自養(yǎng)和異養(yǎng)微生物定殖的區(qū)域形成了致密的生物膜，導(dǎo)致石材表面變黑；這些真菌可以清除模擬的生物膜，將這種具有去除生物膜能力的真菌進(jìn)行鑒定確定為曲霉屬真菌(Aspergillusallahabadii)，其具有應(yīng)用潛力。Valentini等[62]研究中，基于葡萄糖氧化酶的新型生物清潔流程已用于石灰華和白榴擬灰?guī)r以去除生物膜；用作模型酶系統(tǒng)的葡萄糖氧化酶能在室溫下酶促反應(yīng)中原位產(chǎn)生具有氧化特性的清潔劑過(guò)氧化氫(H2O2)，就其清潔效果和表面蝕刻程度而言，石灰華樣品的效果更好，可能是因?yàn)閮煞N石材的孔隙度不同。使用基于飽和碳酸銨溶液、EDTA緩沖溶液和酶脂肪酶處理的傳統(tǒng)方法相比，葡萄糖氧化酶的清潔方法效果最好，可能是因?yàn)槊父鶕?jù)孔隙率優(yōu)先控制H2O2的濃度并且將H2O2保留在存在生物斑的地方。與其他酶(如脂肪酶和蛋白酶)的協(xié)同作用，可以提高清潔效率以應(yīng)用于不同材質(zhì)。

2011年，Gioventù等[63]將生物清洗技術(shù)與化學(xué)和激光清洗相比較，認(rèn)為生物清洗方法在去除石材硫酸鹽時(shí)能得到最好效果。Lustrato等[64]對(duì)位于意大利米蘭紀(jì)念園濕壁畫進(jìn)行了清洗，該壁畫因第二次世界大戰(zhàn)進(jìn)行移除，保護(hù)工作包括清除早期修復(fù)過(guò)程中殘留的酪蛋白和動(dòng)物膠，并將繪畫重新粘貼到更合適的支撐體上；通過(guò)將施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)A29菌株的整個(gè)活菌細(xì)胞快速施用于壁畫表面2 h，并使用分析熱解來(lái)評(píng)估生物清洗的有效性。短期和中期微生物監(jiān)測(cè)證實(shí)，活細(xì)胞在生物處理后不存在于壁畫中，且沒(méi)有任何可能存在由于代謝引起的潛在負(fù)面影響，即該方法安全、環(huán)保、無(wú)風(fēng)險(xiǎn)。Jrondi等[15]指出基于微生物礦化的石質(zhì)文物加固技術(shù)，并從納米尺度上表征了產(chǎn)碳酸細(xì)菌群落的微生物礦化進(jìn)程和產(chǎn)物。這種生物清洗工藝的成本相對(duì)較低，代表了一種極具競(jìng)爭(zhēng)力，低成本高效益的解決方案。

Troiano等[65]展示了將化學(xué)和生物處理與石材藝術(shù)品清潔相結(jié)合的協(xié)同效應(yīng)。在該研究中，建立了一種運(yùn)用生物學(xué)方法來(lái)清除壁畫中由石膏、花崗巖、碳酸鈣、磷灰石、硝酸鹽和老化蛋白質(zhì)物質(zhì)組成的黏附沉積物。所選細(xì)菌非孢子形成菌株，含有微生物的代謝濃縮物用于原位生物清潔測(cè)試顯示，清潔后不會(huì)有任何殘留物，清洗修復(fù)方法成功。我國(guó)文物保護(hù)工作者對(duì)絲織文物的生物技術(shù)清洗、微生物注漿加固磚石砌體，及生物技術(shù)在文物保護(hù)中的應(yīng)用也進(jìn)行了有益的探索和討論[66-68]，為相關(guān)技術(shù)的應(yīng)用提供了參考。

5.2 生物殺滅方法

在使用一種殺菌劑或相關(guān)產(chǎn)品前，必須充分研究目標(biāo)菌落的微生物生態(tài)學(xué)特征。近年來(lái)，尋找天然殺菌劑也成為一種趨勢(shì)[69-70]。使用拮抗生物體或其代謝產(chǎn)物為生物防治提供了新思路，其具有對(duì)人體健康無(wú)害、環(huán)境影響小、選擇性高、成本低廉等優(yōu)勢(shì)。

Cappitelli等[5]測(cè)試了兩種生物殺菌劑對(duì)奧維多大教堂壁畫上藍(lán)藻的殺滅能力，使用ATP檢測(cè)法證明其中一種(Metatin)效果更好。已知的許多植物精油亦具有抗微生物活性，Jeong等[70]提出了利用生態(tài)友好型丁香油酚防治韓國(guó)和老撾石質(zhì)文化遺產(chǎn)上地衣和生物膜的新方法，取得了較好的效果。Borrego等[71]利用通過(guò)蒸餾獲得的精油，使用瓊脂擴(kuò)散法分析了其對(duì)4種真菌和6種細(xì)菌的抗菌活性；發(fā)現(xiàn)茴香和大蒜油在所有濃度下均顯示出最好的抗真菌活性，而牛至油還能抑制真菌形成孢子；但甜橙精油和月桂油對(duì)真菌無(wú)效。丁香、大蒜和牛至油對(duì)成團(tuán)腸桿菌(Enterobacteragglomerans)和鏈霉菌(Streptomycessp.)有最佳抗菌活性，而只有丁香和牛至油對(duì)芽胞桿菌(Bacillussp.)有效。我國(guó)學(xué)者也對(duì)植物精油化學(xué)成分及其抗菌活性的研究進(jìn)展進(jìn)行了評(píng)述[72]。同時(shí)，基于傳統(tǒng)殺菌劑和ZnO、TiO2等納米材料的殺菌方法在近年快速發(fā)展并在多類文物上得以應(yīng)用[73-74]。殺菌劑的時(shí)效性是保護(hù)工作者最為關(guān)注的問(wèn)題之一，一項(xiàng)長(zhǎng)達(dá)8年的監(jiān)測(cè)研究表明，經(jīng)加固劑和殺菌劑(包括銅納米粒子)處理意大利佛羅倫薩一處考古遺址不同類型石材后，微生物膜是否會(huì)再建殖主要是由石材本身的生物易感性和當(dāng)?shù)貧夂驔Q定的[75]。這些研究對(duì)于利用植物天然產(chǎn)物和納米材料控制文化遺產(chǎn)微生物病害具有重要意義。Cennamo等[20]研究了在意大利那不勒斯歷史遺址黃色凝灰?guī)r上的光合生物，通過(guò)光學(xué)、電子顯微鏡和分子生物學(xué)技術(shù)鑒定發(fā)現(xiàn)藍(lán)藻是生物膜的主要成分；通過(guò)采用射頻非致熱效應(yīng)的新技術(shù)，暴露于射頻電磁場(chǎng)7 d后，生物膜減少了約50%，處理1個(gè)月后生物膜完全消失，并且在6個(gè)月后沒(méi)有再生。Mascalchi等[76]激光清洗配合微波方法能夠有針對(duì)性、高效、安全地清除石面生和石內(nèi)生生物病害體。Calvo等[77]討論了γ射線在紙質(zhì)文物病害真菌防治中的應(yīng)用。姚娜等[78]討論了紙質(zhì)文物防霉、除霉保護(hù)技術(shù)，并利用紙漿修復(fù)方法對(duì)霉變文物進(jìn)行修復(fù)實(shí)驗(yàn)。此類傳統(tǒng)的物理方法配套新型生物殺滅技術(shù)，將在文化遺產(chǎn)生物防治中發(fā)揮重要作用。

6 問(wèn)題與展望

文化遺產(chǎn)微生物研究的主要目的是為了鑒定和判斷它們的退化潛力，并減少其對(duì)文化遺產(chǎn)造成破壞。本綜述介紹并舉例論證了文化遺產(chǎn)微生物研究中已使用的主要方法及其適用性，但這些方法各自也存在一些缺點(diǎn)。如基于培養(yǎng)的方法在很大程度上篩選限制了潛在的微生物類群，這類方法僅能獲得當(dāng)前微生物多樣性的有限部分?；诤怂岬姆治霾⒉荒塬@得關(guān)于微生物代謝潛能的信息，因此不能作為微生物群落表征的唯一方法；與其他方法相比分子方法有其優(yōu)越性，但因擴(kuò)增偏好性引起的偏差不容忽視，該方法對(duì)操作過(guò)程技術(shù)要求較高，且費(fèi)用高昂。就采樣而言，無(wú)損的非侵入性采樣，其內(nèi)在局限性是不能收集生長(zhǎng)在文物材質(zhì)內(nèi)并正與底物發(fā)生相互作用的微生物[79]。

新一代測(cè)序技術(shù)對(duì)于提取文化遺產(chǎn)上微生物多樣性信息非常有用，其在揭示微生物的功能方面亦具有優(yōu)勢(shì)，但將顯微鏡成像、培養(yǎng)技術(shù)、多組學(xué)技術(shù)和多學(xué)科分析方法相結(jié)合來(lái)評(píng)估文化遺產(chǎn)微生物的作用形式及其生理生態(tài)功能仍是該領(lǐng)域未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。在大量的檢測(cè)信息支持下，微生物風(fēng)險(xiǎn)綜合管理對(duì)于人力和財(cái)力相對(duì)有限的文化遺產(chǎn)保護(hù)至關(guān)重要；需要強(qiáng)調(diào)的是，預(yù)防性保護(hù)是當(dāng)前解決文化遺產(chǎn)微生物退化問(wèn)題最理想的答案，這就需要找出制約生物退化的關(guān)鍵因子，如水是影響吳哥窟砂巖中微生物和鹽分活動(dòng)的主要因子[80]。因此，涉及預(yù)防性保護(hù)的研究應(yīng)最大限度地挖掘已有信息，并應(yīng)著眼于開發(fā)和改進(jìn)監(jiān)、檢測(cè)儀器設(shè)備，以推動(dòng)無(wú)損分析技術(shù)的應(yīng)用和基于大數(shù)據(jù)的預(yù)防性保護(hù)的發(fā)展。尤為重要的是，今后有必要建立從采樣到生物學(xué)信息分析整個(gè)流程的方法規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)，增加微生物活性方面的模擬研究，促使研究平臺(tái)與數(shù)據(jù)庫(kù)信息的全球共享[81]，并推進(jìn)文化遺產(chǎn)微生物學(xué)學(xué)科建設(shè)和專業(yè)人才培養(yǎng)，以保護(hù)屬于全人類的文化遺產(chǎn)并將其傳承給下一代。