微生物菌種保藏方法及關(guān)鍵技術(shù)

郭玲玲

(遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧 朝陽 122000)

1 菌種保藏的重要性及其發(fā)展

菌種是國(guó)家的重要生物資源，也是生產(chǎn)、教學(xué)和科學(xué)研究的基本材料。近年來，越來越多的微生物菌種被研究并運(yùn)用到食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域，菌種作為生產(chǎn)的源頭，其質(zhì)量好壞直接關(guān)系到產(chǎn)品的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。在微生物領(lǐng)域，不管是基礎(chǔ)科研工作還是生物技術(shù)的應(yīng)用研究，都需要正確的菌種保藏方法和技術(shù)，以保證菌種的質(zhì)量和活力。

為使自然界分離菌株原有的優(yōu)質(zhì)性能持久保存，最大程度地發(fā)揮作用，為人類服務(wù)，世界各國(guó)陸續(xù)開始重視微生物菌種的保藏工作。菌種保藏研究始于1890 年，1906年各國(guó)相繼建立了菌種保藏機(jī)構(gòu)。目前，世界上約有近600個(gè)菌種保藏機(jī)構(gòu)。其中著名的有美國(guó)典型菌種保藏中心(ATCC)于1925年建立，是世界上規(guī)模最大、保存微生物種類和數(shù)量最多的機(jī)構(gòu)，保存病毒、衣原體、細(xì)菌、放線菌、酵母菌、真菌、藻類、原生動(dòng)物等約 29 000株，均為典型株。荷蘭真菌菌種保藏中心(CBS)于1904年建立，保存酵母菌、絲狀真菌約 8 400種、18 000株，大多是模式株﹔英國(guó)全國(guó)菌種保藏中心(NCTC)保存醫(yī)用和獸醫(yī)用病原微生物約2 740株﹔英聯(lián)邦真菌研究所(CMI)保存真菌模式株8 000株﹔日本大阪發(fā)酵研究所保存普通微生物菌種和工業(yè)微生物菌種約9 000株[2]。中國(guó)的菌種保藏機(jī)構(gòu)于 20 世紀(jì)50年代才開始建設(shè)，直到1979年成立了中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)(CCCCM，北京)，并正式成立6個(gè)專業(yè)性保藏管理中心[3]。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，人們逐漸認(rèn)識(shí)到好的菌種保藏技術(shù)是獲得優(yōu)良菌種的保證，研究和選擇一種適宜的保藏方法成為專家學(xué)者們重要的研究工作[4]。

2 菌種的常規(guī)保藏方法

常用菌種保藏方法優(yōu)缺點(diǎn)見表1。

表1 常用菌種保藏方法優(yōu)缺點(diǎn)比較

2.1 定期移植法

定期移植法是當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室使用最多的短期保藏菌種方法。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)通常放置于 4 ℃ 冰箱進(jìn)行短期的菌種保藏。在培養(yǎng)和保存的過程中，由于代謝產(chǎn)物的累積而改變了原始菌種的生活條件，致使菌落群體中的個(gè)體不斷衰老和死亡，因此每5～15 d或 1～4個(gè)月需要重新移植一次，具體間隔時(shí)間因種而異。凡能人工培養(yǎng)的微生物都可用此法保存[5]。

2.2 礦物油保藏法

礦物油保藏法是法國(guó)人Lumiere 于1914 年發(fā)明的，在世界范圍內(nèi)廣泛采用[6]。該方法通過礦物油防止培養(yǎng)基因水分蒸發(fā)而干燥﹐隔絕斜面菌體與空氣接觸，降低微生物代謝活性，使其處于休眠狀態(tài)，可以延長(zhǎng)微生物的壽命，保持菌種優(yōu)良的種性?？杀２?～5 a，是一種中長(zhǎng)期的菌種保藏方法。

2.3 甘油法

甘油法是利用無菌生理鹽水將菌種制備成菌懸液，再用滅菌的40%～50%甘油作為保護(hù)劑，不破壞菌種的原生質(zhì)層和細(xì)胞膜，可保藏3～5 a[7]。

2.4 真空冷凍干燥保藏法

微生物在低溫、干燥和缺氧的條件下，菌種的代謝活動(dòng)相對(duì)靜止。該方法結(jié)合了多種菌種保藏方法的特點(diǎn)，從而營(yíng)造一個(gè)不宜菌種生長(zhǎng)而又能長(zhǎng)期保藏的環(huán)境。此法適用于病毒、衣原體、支原體、細(xì)菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌等的長(zhǎng)期保存，真空冷凍干燥保藏法是專業(yè)機(jī)構(gòu)保藏菌種使用最多的方法。

2.5 干燥保藏法

干燥保藏法也叫載體保藏法，保藏期限可達(dá)2～5 a。根據(jù)載體不同，干燥保藏法主要有沙土管保藏法、濾紙保藏法、明膠片保藏法、硅膠保藏法、麩皮保藏法等。其中沙土管保藏法、濾紙保藏法、明膠片保藏法使用最多。

2.6 液氮超低溫保藏法

液氮超低溫保藏法的特點(diǎn)是微生物代謝降低到完全停止的狀態(tài)，不需定期移植。常用的保護(hù)劑有甘油、血清蛋白、糊精、吐溫-80等。液氮超低溫保藏法是保藏菌種較理想的方法，變異的可能性較低，保存時(shí)間長(zhǎng)達(dá)5～8 a。

3 菌種保藏目前存在的問題

我國(guó)在菌種保藏技術(shù)研究領(lǐng)域起步較晚，還沒有形成系統(tǒng)性的操作規(guī)程，主要存在以下問題：對(duì)照試驗(yàn)次數(shù)有限，試驗(yàn)種類少，研究技術(shù)手段有待進(jìn)一步更新，對(duì)于試驗(yàn)因子(如菌種的菌齡、接種菌絲塊的大小、培養(yǎng)基類型、降溫冷凍和升溫復(fù)蘇的速度、檢測(cè)指標(biāo)、防凍保護(hù)劑類型等)的控制研究不足。

目前常用的菌種保藏方法為液氮超低溫保藏法、真空冷凍干燥保藏法、定期移植法、礦物油保藏法等。部分研究表明前兩種方法保藏效果較好，適合菌種長(zhǎng)期保藏。然而仍存在著問題，例如即便是同一物種的蛹蟲草，不同研究人員使用相似的方法，得出的結(jié)論卻不盡相同。同時(shí)，液氮超低溫保藏法和真空冷凍干燥保藏法，需要良好的設(shè)備及技術(shù)，投入過高，不能廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)；后兩種方法雖然簡(jiǎn)單、廉價(jià)，但占據(jù)的保藏空間較大，且由于轉(zhuǎn)管次數(shù)過多，變異的可能性增大，極易造成菌種退化，給生產(chǎn)帶來損失。因此，探討高效廉價(jià)、操作簡(jiǎn)單的菌種保藏方式非常必要，從而獲得更加科學(xué)和實(shí)用的結(jié)果[8-12]。

4 菌種保藏技術(shù)研究

4.1 斜面培養(yǎng)基成分對(duì)菌種保存活性的影響

4.1.1 多種保藏培養(yǎng)基同時(shí)使用 由于低溫狀態(tài)菌種的代謝仍未停止，較低的碳氮比是保藏培養(yǎng)基設(shè)計(jì)關(guān)鍵。例如：使用鉀細(xì)菌培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基進(jìn)行保存，前者保存鉀細(xì)菌6個(gè)月時(shí)已經(jīng)死亡，而后者保存8個(gè)月時(shí)活力仍然旺盛。

4.1.2 經(jīng)常更換培養(yǎng)基配方 同一菌種長(zhǎng)期使用同一培養(yǎng)基，菌絲的生長(zhǎng)速度會(huì)減慢，這是因?yàn)榫z一直生長(zhǎng)在半合成的培養(yǎng)基上，與其自然環(huán)境不同，某些酶和活性物質(zhì)長(zhǎng)期得不到啟用，會(huì)鈍化或喪失活力。例如，金針菇更替使用綜合麩皮培養(yǎng)基和黃豆芽培養(yǎng)基可減少節(jié)孢子產(chǎn)生。

4.2 有孔膠塞封口能適當(dāng)延長(zhǎng)保存期

試管斜面用棉塞封口，培養(yǎng)基易失水干縮；而用無孔膠塞封口，有些不耐低氧的菌種易死亡。在膠塞上鉆孔，孔徑1.5 mm，再用棉花封孔，來協(xié)調(diào)保水與通氣的矛盾,可有效延長(zhǎng)保存期。

4.3 石蠟油保藏法

石蠟油保藏法保存期限見表2。

表2 石蠟油保藏法保存期限

石蠟油保藏法不適宜保藏下列菌種：①真菌：布拉氏霉屬(Blaskeslea)、毛殼霉屬(Chaetomium)、卷霉屬(Circinella)、笄霉屬(Choanephora)；②細(xì)菌：固氮菌屬(Azotobater)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leucoustoc)、分枝桿菌屬(Mycobacter)、紅螺菌屬(Rhodospirillum)、沙門氏桿菌屬(Salmonella) 等。

4.4 冷凍保藏法的改進(jìn)

4.4.1 普通冰箱法 以普通冰箱的冷凍室代替液氮罐進(jìn)行菌種的冷凍保藏，大大增加了冷凍保藏的實(shí)用性。本實(shí)驗(yàn)室利用普通冰箱法進(jìn)行試驗(yàn)，將培養(yǎng)好的食用菌麥粒菌種分裝到針劑瓶中，用滅過菌的雙層報(bào)紙封口，放入大罐頭瓶中，每個(gè)罐頭瓶可放7～9個(gè)小瓶，再向罐頭瓶?jī)?nèi)放生石灰，一直裝到瓶口，最后用塑料薄膜將罐頭瓶封口扎緊，新鮮石灰具有很強(qiáng)的吸濕性，可將麥粒菌種的含水量降到20%。同時(shí)，用麥粒菌種直接冷凍作為試驗(yàn)CK1；麥粒菌種加10%甘油作保護(hù)劑后冷凍作為CK2；斜面菌種加保護(hù)劑冷凍作為CK3，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CK1、 CK2和CK3的菌種成活率分別為41.5%、56.2%、75.3%，改進(jìn)后的保藏方法菌種成活率為100%。

4.4.2 培養(yǎng)基中加入保護(hù)性物質(zhì) 在培養(yǎng)基中加入保護(hù)性物質(zhì)，使培養(yǎng)出的菌體對(duì)冷凍和冷凍干燥有較好的耐性。乳酸桿菌和其他的乳酸菌相比，在進(jìn)行冷凍和冷凍干燥處理時(shí)存活力較低，在培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基加入50 μg/mL 亞油酸，其存活率可提高幾十倍。

4.4.3 合成液體培養(yǎng)基 合適的培養(yǎng)基可以維持微生物在半休眠狀態(tài)下的營(yíng)養(yǎng)，礦物質(zhì)及微量元素是微生物酶的激活劑。培養(yǎng)基中加入硫酸鋅、硫酸銅、枸櫞酸鈉、鹽酸吡咯醇等，-20 ℃冰凍保存，可使微生物保存10 a以上。

4.5 特殊基質(zhì)保藏法

4.5.1 具有馴化功能的土壤保藏法 從土壤中篩選出來的膠質(zhì)芽胞桿菌往往由于定殖能力不強(qiáng)，在土壤中難以維持基本的菌群數(shù)量，達(dá)不到應(yīng)有的解鉀效果。膠質(zhì)芽胞桿菌經(jīng)未滅菌的自然土壤馴化4個(gè)月后，在硅酸鹽細(xì)菌分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，菌落平均直徑從7.17 mm增加到15.63 mm，其方差分析差異達(dá)到極顯著水平。

4.5.2 具有馴化和篩選功能的液體保藏法 醋酸菌在斜面培養(yǎng)基上易退化，生產(chǎn)性能不穩(wěn)定，選用合適的液體培養(yǎng)基，如在常規(guī)培養(yǎng)基中加入8%～10%乙酸、3%～5%乙醇，然后按10%接種，密封，30 ℃靜止培養(yǎng)8～12 h，放入冰箱保存。結(jié)果表明既可保藏菌種，又具有馴化和篩選功能。

4.6 真空冷凍干燥保藏法

4.6.1 保護(hù)劑的改進(jìn) 在分散劑中添加低分子物質(zhì)，可使冷凍干燥后的樣品含水量不至于過低，起到緩沖作用(見表3)。

表3 用于真空冷凍干燥保藏法的保護(hù)劑

4.6.2 極端嗜鹽菌保存 極端嗜鹽菌必須在20%～25% NaCl存在下才能很好生長(zhǎng)，而且需要一定濃度NaCl維持完整的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。以5% NaCl溶液配成6%海藻糖代替10%脫脂牛奶作冷凍干燥的保護(hù)劑，可提高存活率。

5 展 望

菌種質(zhì)量的高低直接影響著后期代謝功能的強(qiáng)弱[13]，優(yōu)質(zhì)菌種在相關(guān)產(chǎn)業(yè)中起著決定性作用，是其能否正常運(yùn)行的物質(zhì)基礎(chǔ)[14]。菌種保藏是優(yōu)質(zhì)菌種研究的核心，是種質(zhì)資源研究的重要方面，是菌種質(zhì)量的前提和保證。建立經(jīng)濟(jì)有效的菌種保藏方法，不僅可以有效保存菌種的優(yōu)良性狀，保持其活力與產(chǎn)量，而且對(duì)于種質(zhì)資源的保存與后續(xù)研究都有極其重要的作用[15-18]。

目前菌種保藏的研究基礎(chǔ)還比較薄弱, 還需要行業(yè)內(nèi)的科研人員繼續(xù)努力，從方便生產(chǎn)的角度出發(fā)，本著簡(jiǎn)便、高效、廉價(jià)等目標(biāo)，結(jié)合多學(xué)科知識(shí)，在常規(guī)菌種保藏方法的基礎(chǔ)上，不斷進(jìn)行改進(jìn)優(yōu)化，以期獲得可推廣應(yīng)用的菌種保藏技術(shù)。