衰老對小鼠小腸上皮形態(tài)和增殖速度的影響

彭秀穎 劉慧玲 徐敏儀 陶金 吳斌

【關(guān)鍵詞】 衰老;小腸上皮細(xì)胞;增殖;β-catenin;CyclinD1

The effect of aging on the morphology and proliferation rate of small intestinal epithelial cells in mice Peng Xiuying， Liu Huiling， Xu Minyi， Tao Jin，Wu Bin. Department of Gastroenterology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Wu Bin， E-mail： binwu001@ hotmail. com

【Abstract】 Objective To observe the changes of the morphology， cell count and the proliferation rate of the small intestinal epithelium in mice during aging. ?Methods Mice were divided into the young （3-month group， n=9）， the middle-aged （12-month group， n=9） and the old groups （19-month group， n=9）. Each mouse received intraperitoneal injection of 5-Bromo-2-deoxyUridine （Brdu） at a dose of 100 mg/kg body weight. At 24-， 48- and 72-h after administration， 3 mice were sacrificed in each group and the jejunum and ileum tissues were collected and prepared for morphological observation. The proliferation rate of cells was analyzed by Brdu immunofluorescent staining. The expression levels of β-catenin and cyclinD1 were quantitatively measured. ?Results Compared with 3-month-old mice， 12-month-old mice had longer villus， deeper crypt， more goblet cells， Paneth cells and stem cells. In the 19-month-old mice， the number of goblet cells and Paneth cells in the ileum， and the number of stem cells in the ileum and jejunum were significantly less compared with those in the 12-month-old mice. Brdu staining demonstrated that the number of Brdu positive cells and the migration length in the 19-month-old mice were significantly reduced compared with those in the other two groups（all P < 0.017）. The expression levels of β-catenin and cyclinD1 were significantly down-regulated in the 19-month-old mice（all P < 0.017）. ?Conclusions During the process of aging， the proliferation rate of the small intestinal epithelial cells is reduced， the crypt depth， the number of goblet cells， Paneth cells and stem cells are decreased in mice.

【Key words】 Aging;Small intestinal epithelium;Proliferation;β-catenin;CyclinD1

小腸黏膜的主要功能是吸收和防御，其中腸上皮發(fā)揮了重要作用。小腸上皮細(xì)胞主要分為吸收性腸上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞、干細(xì)胞等，小腸上皮更新速度快，約4 ～ 5 d

更新1次，而隱窩中的潘氏細(xì)胞壽命約1個(gè)月。隨著年齡增長，腸道功能逐漸減退[1-3]。對此已有相關(guān)研究，但因?yàn)槿〔奈恢?、年齡選取等原因，結(jié)果各不相同。

本實(shí)驗(yàn)選取3個(gè)年齡段的小鼠，分別為3、12和19個(gè)月，分別對應(yīng)人類年齡的青年、中年和老年階段[4]。重點(diǎn)研究小腸增殖功能隨衰老發(fā)生的變化，計(jì)數(shù)絨毛和隱窩長度以及各類細(xì)胞的個(gè)數(shù)，測定腸上皮更新的速度，并檢測增殖相關(guān)的蛋白含量。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無特定病原體（SPF）C57BL/6野生型小鼠27只，分為3 ～ 4個(gè)月（3個(gè)月組）、12 ～ 13個(gè)月（12個(gè)月組）、18 ～ 20個(gè)月（19個(gè)月組）3個(gè)年齡段。每年齡段各9只，雌雄不限。其中3 ～ 4個(gè)月小鼠體質(zhì)量25 ～ 30 g、12個(gè)月以上小鼠體質(zhì)量30 ～ 40 g，在中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院動(dòng)物房繁育養(yǎng)殖。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合倫理學(xué)要求。

二、主要試劑

5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu，Abcam）;蘇木

素染液、伊紅染液、PAS染液;Brdu抗體、cycli-nD1抗體（Abcam）、MMP-7抗體、Olfm4抗體、

PCNA抗體、β-catenin抗體（Cell Signaling Techn-ology）、β-actin抗體（Sigma）;DAB顯色液（DAKO）、488波長抗大鼠熒光染液、594波長抗兔熒光二抗（ThermoFisher）。

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1.動(dòng)物處理

按100 mg/kg的量腹腔注射Brdu溶液，分別在24、48和72 h之后，每組隨機(jī)取3只小鼠處死。小鼠處死后，從幽門往下5 cm取2 cm進(jìn)行石蠟包埋切片，再取45 cm刮取黏膜蛋白（空腸）;再從回盲部開始，向上取2 cm進(jìn)行石蠟包埋，再取4 ～ 5 cm刮取黏膜蛋白（回腸）。本實(shí)驗(yàn)已通過中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2.石蠟包埋

將小腸標(biāo)本在10%甲醛固定12 ～ 24 h后，放入LeicaASP200s自動(dòng)脫水機(jī)脫水，約15 h，程序完成，取出樣本，在Leica包埋機(jī)中進(jìn)行石蠟包埋。

3.蘇木素-伊紅（HE）染色

將玻片脫蠟、水化后，在玻片上滴加蘇木素染液，90 s后用PBST洗去，返藍(lán)后，將玻片浸入伊紅染液80 s，用清水洗去染液，脫水封片。在顯微鏡下觀察，每個(gè)玻片隨機(jī)取10個(gè)視野，30個(gè)左右絨毛和隱窩統(tǒng)計(jì)其長度（每組9只小鼠）。

4. PAS糖原染色

將玻片脫蠟、水化后，滴加過碘酸染液，避光染色10 min，用PBST洗去染液后，再滴加Schiff試劑，避光染色15 min，用清水洗去染液，浸入PBST數(shù)分鐘后滴加配套的蘇木素染1 min，返藍(lán)后脫水封片。在顯微鏡下觀察，每個(gè)玻片隨機(jī)取10個(gè)視野，約30個(gè)絨毛-隱窩軸統(tǒng)計(jì)其PAS陽性個(gè)數(shù)（每組6只小鼠）。紫紅色為PAS陽性，藍(lán)色為蘇木素。

5. MMP-7免疫組織化學(xué)染色

將玻片脫蠟、水化后，在3%過氧化氫溶液中浸泡10 min，用pH 8.0的EDTA抗原修復(fù)液高壓鍋130℃ 3 min，自然放涼后滴加MMP7抗體（1∶100），放在孵育盒中，4℃冰箱放置14 h，PBST洗去一抗，滴加兔二抗（1∶200），37℃孵育2 h。滴加DAB顯色1 min。顯色完畢后蘇木素染色1 min，脫水封片（6只）。棕色為MMP7陽性，藍(lán)色為蘇木素。

6.免疫熒光染色

注射Brdu，分別在24、48和72 h后處死小鼠，用Brdu抗體進(jìn)行免疫熒光染色，統(tǒng)計(jì)Brdu陽性的腸上皮細(xì)胞在絨毛上的最大遷移距離和隱窩-絨毛軸上Brdu陽性細(xì)胞的個(gè)數(shù)。

將玻片脫蠟、水化后，用pH 8.0的EDTA抗原修復(fù)液高壓鍋130℃ 3 min，放涼后分別滴加OLFM4 （1∶400）（每組3只小鼠）、 Brdu（1∶100），4℃冰箱放置14 h，PBST洗去一抗。以下步驟均需要避光：分別加入熒光二抗[488抗大鼠（綠色熒光）、594 抗兔（紅色熒光）熒光二抗]，37℃孵育90 min，孵育完畢后放入DAPI溶液（約1∶30 000

稀釋）中浸泡30 min染核，用PBST浸洗數(shù)分鐘后用防淬滅熒光封片劑封片后放入4℃冰箱保存。每張玻片取10個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)約30個(gè)單位的數(shù)據(jù)。紅色為Olfm4陽性，藍(lán)色為DAPI陰性，綠色為Brdu陽性。

7.提取小腸黏膜蛋白和蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)

按照總蛋白提取裂解液操作說明書對小腸黏膜組織總蛋白進(jìn)行提取與定量，取樣本蛋白進(jìn)行電泳;電泳印記轉(zhuǎn)至NC膜上;牛奶封閉2 h;分別加入如下抗體：β-catenin（1∶1 000）、cyclinD1（1∶200）、β-actin （1∶4 000），4℃放置過夜至少12 h。用TBST洗3 min洗去一抗，加入二抗（1∶5 000），常溫孵育100 ?min，TBST洗3 min。滴加發(fā)光液，在Tanon自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀內(nèi)拍照（每組3只小鼠）。

8. 絨毛上的最大遷移距離計(jì)算

Brdu陽性細(xì)胞的位置到絨毛底部的長度取最大值（如果被標(biāo)記的細(xì)胞已到達(dá)絨毛頂端則將遷移距離記為絨毛長度）。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。非正態(tài)分布以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，使用Bonferroni法進(jìn)行兩兩對比，P < 0.05/3（0.017）表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果以箱圖顯示，箱中橫線代表中位數(shù)，箱體代表四分位差，圓點(diǎn)代表離散值。

結(jié) 果

一、小腸上皮的形態(tài)隨衰老的變化

空腸絨毛長度3組對比 H=113.202，P < 0.001，

3個(gè)月小鼠絨毛長度大于12個(gè)月和19個(gè)月的小鼠（P均< 0.017），而12個(gè)月的小鼠和19個(gè)月的小鼠絨毛長度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.232）。回腸絨毛長度3組對比H=35.636，P < 0.001，12個(gè)月小鼠絨毛較3個(gè)月的小鼠長（P< 0.017），而19個(gè)月的小鼠較12個(gè)月的小鼠更短（P < 0.017），19個(gè)月和3個(gè)月小鼠對比差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.017），見圖1。

隱窩長度測量結(jié)果顯示，空腸隱窩長度3組對比H=100.303，P < 0.001，回腸隱窩長度3組對比H=178.778，P < 0.001;12個(gè)月的小鼠空腸和回腸的隱窩長度都較3個(gè)月的小鼠大（P均< 0.017），19個(gè)月的小鼠空腸、回腸隱窩長度均比12個(gè)月的小鼠小，回腸隱窩長度與3個(gè)月的小鼠沒有差別（P = 0.064），見圖1。

二、小腸上皮不同種類細(xì)胞個(gè)數(shù)隨衰老的變化

這3種染色的數(shù)量變化趨勢在空腸和回腸基本一致。從數(shù)值上看，這些細(xì)胞數(shù)量變化非常小。最明顯的變化是12個(gè)月小鼠比3個(gè)月小鼠數(shù)量增加。19個(gè)月小鼠與12個(gè)月小鼠相比，呈現(xiàn)數(shù)量減少和無明顯差異兩種情況。19個(gè)月小鼠與3個(gè)月小鼠對比，呈現(xiàn)數(shù)量上升和無明顯差異兩種情況，見圖2、3。

三、小腸上皮增殖速度隨衰老的變化

此結(jié)果在空腸和回腸中基本一致。綜合對比3個(gè)月的小鼠與12個(gè)月的小鼠被標(biāo)記的腸上皮細(xì)胞最大遷移距離和被標(biāo)記的細(xì)胞個(gè)數(shù)，未能得到一致的結(jié)果，但是19個(gè)月的小鼠在3個(gè)時(shí)間段的最大遷移距離和被標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)目都低于3個(gè)月和12個(gè)月的小鼠。3個(gè)月和12個(gè)月的小鼠，被標(biāo)記的腸上皮細(xì)胞在72 h已能夠達(dá)到絨毛頂端，而19個(gè)月的小鼠則沒有一個(gè)細(xì)胞能到達(dá)頂端。雖然 3個(gè)月的小鼠空腸中，一部分絨毛在72 h未能到達(dá)頂端，但是其絨毛長度比12個(gè)月要長，因此最大遷移距離同樣大于19個(gè)月的小鼠。另外3個(gè)月和12個(gè)月的小鼠雖然在數(shù)值上沒有明顯的差異，但是觀察切片可以發(fā)現(xiàn)，3個(gè)月的小鼠中被標(biāo)記的細(xì)胞整齊聚集，而在12個(gè)月的小鼠則明顯分散，見圖4、5。

四、增殖相關(guān)蛋白的檢測

用蛋白免疫印跡法檢測了2個(gè)與增殖有關(guān)的蛋白：β-catenin和cyclinD1。蛋白條帶結(jié)果顯示，β-catenin和cyclinD1的條帶在19個(gè)月組中明顯淺于其他2組，而3個(gè)月組和12個(gè)月組未見明顯的差異，見圖6。

討 論

衰老是生物無可避免的一種現(xiàn)象。隨著年齡增長，人體器官的功能將逐漸減退。老年人普遍存在消化吸收和免疫功能減退的情況，與小腸黏膜的變化有密切聯(lián)系。

按照J(rèn)acksonlab的說明書，3 ～ 6個(gè)月的小鼠對應(yīng)人類年齡的20 ～ 30歲，10 ～ 14個(gè)月的小鼠對應(yīng)人類年齡的38 ～ 47歲，18 ～ 24個(gè)月的小鼠對應(yīng)人類年齡的56 ～ 69歲。在此之前，已有數(shù)篇文獻(xiàn)對此做過研究，文獻(xiàn)將3個(gè)月左右的小鼠與18個(gè)月以上的小鼠進(jìn)行對比，得到衰老的小鼠隱窩長度增加，杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞和干細(xì)胞數(shù)目增加的結(jié)果，對于絨毛長度的結(jié)論也不盡相同[5-8]。

考慮到直接將青年組和老年組對比，時(shí)間跨度過長，其中的變化并不清晰，為了更好的觀察小鼠小腸黏膜隨年齡的變化，本實(shí)驗(yàn)設(shè)立3個(gè)年齡段，對同一位置的空腸和回腸的絨毛長度、隱窩長度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并對杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞和干細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。絨毛長度測量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空腸和回腸的結(jié)果并不一致?？漳c的差別主要在3個(gè)月和12個(gè)月的小鼠之間，19個(gè)月小鼠與12個(gè)月小鼠沒有差別。而回腸中，12個(gè)月的小鼠絨毛長度最長，3個(gè)月和19個(gè)月小鼠比12個(gè)月小鼠長度要短，但是總體變化很細(xì)微。這說明絨毛長度的對比結(jié)果隨小腸部位不同而異。

隱窩長度的結(jié)果也不完全一致。在空腸，3個(gè)月的小鼠隱窩長度最小，而12個(gè)月和19個(gè)月沒有明顯差別。在回腸，19個(gè)月的小鼠隱窩長度低于12個(gè)月的小鼠，呈現(xiàn)下降趨勢。但是共同點(diǎn)是，12個(gè)月的小鼠比起3個(gè)月的小鼠隱窩長度要大。從空腸的結(jié)果來看，隱窩長度在3個(gè)月之后12個(gè)月之前依舊有所增長，后來在衰老過程中逐漸萎縮。

為了研究不同種類的腸上皮個(gè)數(shù)是否隨衰老有所變化，分別對各標(biāo)記物染色。PAS糖原染色主要識(shí)別杯狀細(xì)胞，MMP7免疫組化染色主要識(shí)別潘氏細(xì)胞。Olfm4是一種小腸干細(xì)胞標(biāo)記物，研究表明，Olfm4在小鼠小腸的Lgr5+細(xì)胞中有非常高的表達(dá)量，因此可用來標(biāo)記Lgr5+的小腸干細(xì)胞[9]。目前許多觀點(diǎn)認(rèn)為，隱窩底部Lgr5陽性的細(xì)胞很有可能性是小腸干細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)對杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞和小腸干細(xì)胞進(jìn)行染色，統(tǒng)計(jì)不同年齡段的數(shù)目，結(jié)果比較一致。這些細(xì)胞數(shù)目在12個(gè)月的小鼠中最大，而19個(gè)月與12個(gè)月對比，空腸的杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞沒有差異，回腸的杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞則下降。而空腸與回腸的Olfm4陽性細(xì)胞數(shù)目都下降，提示Lgr5陽性的小腸干細(xì)胞數(shù)目減少。由此可見，小鼠3個(gè)月時(shí)，這幾類細(xì)胞的數(shù)目并沒有達(dá)到最大值。在3個(gè)月到12個(gè)月之間，數(shù)目依舊有所增長，隨著小鼠衰老，腸道增殖功能減退，細(xì)胞數(shù)目可能會(huì)下降?？偟膩碚f，19個(gè)月的小鼠對比12個(gè)月的小鼠，隱窩長度減少，杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞和干細(xì)胞數(shù)目都有減少的趨勢，但是不會(huì)少于3個(gè)月的水平。

Brdu是一種胸腺嘧啶核苷類似物，對小鼠進(jìn)行腹腔注射，可使其摻入小腸隱窩內(nèi)正在復(fù)制的DNA中，從而標(biāo)記隱窩底部的腸上皮，小腸上皮在增殖、分化和成熟的過程中，一直向絨毛頂端移動(dòng)，直到移動(dòng)到絨毛最頂端發(fā)生凋亡。經(jīng)過一段時(shí)間處死小鼠，即可通過小腸上皮當(dāng)前的位置評估小腸上皮的遷移情況[10]。因此，本實(shí)驗(yàn)使用Brdu標(biāo)記正在復(fù)制DNA的腸上皮細(xì)胞來測定小腸增殖的速度。雖然空腸和回腸的結(jié)果具有差異，但是總體趨勢一致。綜合觀察3個(gè)時(shí)間段，19個(gè)月的小鼠在不同時(shí)間段、不同部位的條件下，最大移動(dòng)距離都低于3個(gè)月和 12個(gè)月的小鼠。之前有文獻(xiàn)對比了2 ～ 4個(gè)月和20 ～ 22個(gè)月小鼠在72 h的移動(dòng)距離，本實(shí)驗(yàn)與該文獻(xiàn)結(jié)果一致[10]。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)統(tǒng)計(jì)了隱窩-絨毛軸上Brdu陽性細(xì)胞的個(gè)數(shù)，發(fā)現(xiàn)19個(gè)月的小鼠標(biāo)記的腸上皮個(gè)數(shù)也同樣低于另外2組。19個(gè)月小鼠增殖速度明顯低于另外2組，說明其增殖功能受損。需要特別說明的是，由于Brdu溶液是一種廣泛使用的增殖標(biāo)記物，如果腹腔注射不成功則不會(huì)在小腸中出現(xiàn)任何陽性信號。目前沒有資料表明Brdu在用于標(biāo)記時(shí)對目標(biāo)器官產(chǎn)生額外影響。在查閱過的參考文獻(xiàn)中，利用該標(biāo)記物計(jì)算腸上皮遷移速率時(shí)，也并不針對這一操作設(shè)置空白對照組[11-13]。因此，本實(shí)驗(yàn)同樣沒有設(shè)置空白對照組。

經(jīng)過蛋白免疫印跡檢測的2個(gè)蛋白，其中β-catenin是經(jīng)典Wnt/β-catenin通路的關(guān)鍵蛋白。cyclinD1是Wnt通路的下游蛋白，這是一種周期調(diào)控蛋白，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用[14]。Wnt通路在小腸的作用是促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞增殖[15-16]。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，19個(gè)月組的β-catenin和cyclinD1表達(dá)量比另外2組減少，提示W(wǎng)nt通路減弱，這或許和19個(gè)月組小鼠增殖速度減慢相關(guān)。

綜合細(xì)胞染色的結(jié)果來看，12個(gè)月的小鼠，隱窩長度增加，杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞和干細(xì)胞數(shù)目都增加，形態(tài)學(xué)上發(fā)生了較大的變化，而Brdu染色卻沒有統(tǒng)一的結(jié)果。其最大遷移距離略高于3個(gè)月的小鼠，但是計(jì)數(shù)標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)卻大多低于3個(gè)月的小鼠。此外，在觀察過程中可以發(fā)現(xiàn)，12個(gè)月的小鼠標(biāo)記細(xì)胞的排列較散亂。12個(gè)月的小鼠β-catenin和cyclinD1含量與3個(gè)月對比并無差異。也許在12個(gè)月時(shí)，小鼠的增殖功能受到了一些損傷，但是仍能維持腸上皮更新的速度。而19個(gè)月的小鼠，黏膜形態(tài)和細(xì)胞數(shù)目與3個(gè)月的小鼠相近，增殖功能卻已經(jīng)大幅減退。由此可見，小鼠衰老過程中，小腸形態(tài)和細(xì)胞數(shù)目的變化與小腸增殖功能的變化并不平行。這或許是因?yàn)樵谒ダ系倪^程中，腸上皮單個(gè)細(xì)胞的質(zhì)量一直在減退，需要更加精密的手段來檢測這種變化。

總而言之，衰老的小鼠Wnt通路減弱，導(dǎo)致增殖功能減退，增殖速度減慢，絨毛長度、隱窩長度減少，各種類細(xì)胞數(shù)目有減少的可能。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2019-01-18）

（本文編輯：楊江瑜）