IVF/ICSI周期中≥3PN胚胎用于囊胚培養(yǎng)方案優(yōu)化的探討

秦祖興 唐永梅 牟聯(lián)俊 徐麗湘 梁明明 羅婷 李楠 李忻琳

【關鍵詞】 囊胚培養(yǎng);微滴培養(yǎng);異常受精胚胎

Optimization of blastocyst culture using ≥ 3PN embryos in IVF/ICSI cycle Qin Zuxing， Tang Yongmei，

Mu Lianjun， Xu Lixiang， Liang Mingming， Luo Ting， Li Nan， Li Xinlin. Reproductive Center， Liuzhou Maternal and Child Health Care Hospital， Liuzhou 545001， China

Corresponding author， Li Xinlin

【Abstract】 Objective To investigate the effect of the number of embryos cultured in a single blastocyst medium droplet and the volume of blastocyst medium droplet on blastocyst formation. ?Methods ? With the informed consents of the patients， the abnormally fertilized embryos （ ? ≥3PN embryos） with pronuclear number ≥ 3 from July 2016 to June 2018 were utilized for blastocyst culture. The inclusion criteria were cell number ≥ 6 and fragment ≤ 30%. The 3PN embryos on the 3rd day of insemination were randomly divided into one， two， three， and four combinations and cultured in a single blastocyst medium droplet in a volume of 30 μl. Subsequently， the 3PN embryos on the 3rd day of insemination were randomly cultured in 10 μl， 20 μl， 30 μl， 40 μl， and 50 μl of blastocyst medium droplet. The formation rate of blastocysts was observed and statistically compared. ?Results The number of embryos did not affect the formation rate of≥stage 3 or early blastocysts （both P > 0.05）. The difference was not statistically significant in the formation rates of ≥stage 3 blastocysts and ≥early blastocysts in groups of different volume of culture droplets （both P > 0.05）. ?Conclusion The number of embryos cultured in a single blastocyst medium droplet and the volume of culture droplets exerts no effect on the blastocyst formation.

【Key words】 Blastocyst culture;Microdroplet culture;Abnormally fertilized embryo

輔助生殖技術中，囊胚移植在第5 ～ 6日進行，較卵裂胚移植晚2 ～ 3 d。相比卵裂胚移植，囊胚移植可以提高臨床妊娠率、種植率、繼續(xù)妊娠率，降低早期流產，還可以提高活產率[1-2]。體外培養(yǎng)條件下囊胚形成率和囊胚質量是囊胚移植的關鍵。在助孕過程中常能見到一定數(shù)量的多原核（≥3PN）異常受精胚胎。臨床工作中，≥3PN胚胎屬于不可用胚胎，通常是廢棄處理。將≥3PN胚胎應用于科研，倫理方面更易被接受。同時，≥3PN胚胎也具有一定潛能，經體外培養(yǎng)可發(fā)育至囊胚階段。本研究嘗試將≥3PN胚胎用于囊胚培養(yǎng)方案的優(yōu)化，探討單個囊胚培養(yǎng)滴中培養(yǎng)的胚胎數(shù)目和囊胚培養(yǎng)滴體積對囊胚形成的影響，為今后的臨床工作提供參考。

材料與方法

一、材 料

2016年7月至2018年6月在我中心使用輔助生殖技術助孕患者的≥3PN胚胎中，選擇細胞數(shù)≥6、碎片≤30%者，在患者了解研究方案并簽署知情同意書后用于研究。本研究方案經醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

二、方 法

1. 胚胎培養(yǎng)數(shù)目對囊胚形成的影響

授精第3日的≥3PN胚胎隨機分為1、2、3、4個的組合分別置于體積為30 μl的單個囊胚培養(yǎng)液滴中培養(yǎng)，觀察囊胚培養(yǎng)情況。按Gardner系統(tǒng)進行囊胚評級。卵裂期培養(yǎng)液為卵裂培養(yǎng)基（COOK， 澳大利亞）或G-1（Vitrolife， 瑞典），囊胚培養(yǎng)液為相對應的Blastocyst Medium （BM，COOK， 澳大利亞）或G-2（Vitrolife， 瑞典）。本研究采用COOK桌面三氣培養(yǎng)箱（型號：K-MINC-1000）培養(yǎng)胚胎。培養(yǎng)條件為37℃、6% CO2、5%O2。

2. 囊胚培養(yǎng)滴體積對囊胚形成的影響

本試驗將授精第3日的≥3PN胚胎隨機置于體積為10、20、30、40、50 μl的囊胚培養(yǎng)滴中培養(yǎng)，觀察囊胚培養(yǎng)情況。按Gardner系統(tǒng)進行囊胚評級。卵裂期培養(yǎng)液、囊胚培養(yǎng)液、培養(yǎng)箱同前一致。

三、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、胚胎培養(yǎng)數(shù)目對囊胚形成的影響

不同胚胎數(shù)目組的胚胎培養(yǎng)方式比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。不同胚胎數(shù)目組間的3期以上囊胚或早期以上囊胚的形成率比較差異均無統(tǒng)計學意義（P均> 0.05），見表1。

二、囊胚培養(yǎng)滴體積對囊胚形成的影響

不同囊胚培養(yǎng)滴體積組的胚胎培養(yǎng)方式相近（P > 0.05）。不同囊胚培養(yǎng)滴體積組間的3期以上囊胚和早期以上囊胚形成率比較差異均無統(tǒng)計學意義（P均> 0.05），見表2。

討 論

囊胚培養(yǎng)常采用微滴法聚集培養(yǎng)，即將發(fā)育水平相近的胚胎置于同一個培養(yǎng)滴中共同培養(yǎng)。其原理是將胚胎聚集在一個較小的區(qū)域（10 ～ 50 μl）以達到充分利用自分泌和旁分泌效應的目的。

囊胚的形成和質量受多種因素影響。鄭煒煒等[3]認為，不同精子來源和授精方式的胚胎發(fā)育成囊胚的潛能是不同的。魯振宇等[4]認為，第3日胚胎的細胞數(shù)、質量與囊胚形成率呈正相關。任新玲等[5]也認為，卵裂遲緩胚胎的囊胚形成率、優(yōu)質囊胚率均低于卵裂速度正常的優(yōu)質胚胎。此外，刁英等[6]報道有早期分裂受精卵移植的臨床妊娠率高于無早期分裂受精卵移植，早期分裂受精卵可作為胚胎移植選擇受精卵的指標之一。因此，有早期分裂的受精卵囊胚形成率是否更高也是今后可以探討的方向。本研究選擇≥3PN胚胎作為研究對象，探討胚胎數(shù)目和培養(yǎng)滴體積對囊胚形成的影響。為避免胚胎發(fā)育速度不同步或胚胎質量低下影響研究結果，本研究設定入組標準為細胞數(shù)≥6、碎片≤30%。

Tao等[7]將人胚胎按相同級別以2 ～ 5個分組進行囊胚培養(yǎng)，與隨機分組相比，囊胚形成率和胚胎利用率得到提高，認為可能是與好胚胎分泌的有益因子或去除來自劣質胚胎分泌的有害因子有關。Sun等[8]將人廢棄胚胎按1 ～ 4個分組在30 μl微滴中聚集培養(yǎng)，結果顯示聚集培養(yǎng)可以在一定程度上提高囊胚率和囊胚質量，他們認為3個胚胎的群組培養(yǎng)是比較好的選擇。本研究顯示，胚胎數(shù)目不影響囊胚形成率，與既往研究不一致的原因可能是胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)有一定差異，或者≥3PN胚胎來源對發(fā)育結果存在一定的影響。

Minasi等[9]將人胚胎置于7 μl 培養(yǎng)滴中培養(yǎng)的囊胚形成率高于35 μl培養(yǎng)液滴，認為胚胎自分泌因子對囊胚發(fā)育具有促進作用。相反，De Munck等[10]將單個人類胚胎置于25 μl 或 7 μl 微滴中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)減少培養(yǎng)滴體積（7 μl）對早期胚胎發(fā)育有負面作用：減少了第3日胚胎細胞數(shù)，降低了囊胚形成率和囊胚質量。本研究顯示，囊胚培養(yǎng)滴體積對囊胚形成無影響。

與微滴法相似的還有微穴法，即在培養(yǎng)皿底部做出數(shù)個小穴，以微滴覆蓋，將胚胎置于小穴中培養(yǎng)。微穴法為單個或小群胚胎提供了較小的培養(yǎng)微環(huán)境，使它們可以共享更大體積的培養(yǎng)液， 并且可以避免微滴易移位或融合等缺點。由于相同的技術原理，微穴法相關研究可以作為微滴法的參考。Dai等[11]用微穴法進行鼠胚培養(yǎng)，結果表明聚集培養(yǎng)的囊胚形成率優(yōu)于單個胚胎培養(yǎng)，但微穴法培養(yǎng)不能改善單個胚胎培養(yǎng)時較差的發(fā)育率。

本研究將≥3PN胚胎作為研究對象，結果顯示胚胎培養(yǎng)數(shù)目不影響囊胚形成，培養(yǎng)滴體積對囊胚形成無明顯影響。

參 考 文 獻

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[4] 魯振宇，張云山，糜若然. 胚胎發(fā)育對囊胚形成的影響.天津醫(yī)藥雜志，2010，38（4）：257-259.

[5] 任新玲，劉群，艾繼輝，章漢旺. 胚胎卵裂速度異常對囊胚形成的影響.中國婦幼保健，2012，27（7）： 1061-1063.

[6] 刁英，楊智敏，譚兵兵. 移植早期分裂受精卵對IVF-ET或ICSI-ET結局的影響——附259個周期分析. 新醫(yī)學， 2009， 40（4）： 241-243.

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[11] Dai SJ， Xu CL， Wang J， Sun YP， Chian RC. Effect of culture medium volume and embryo density on early mouse embryonic development： tracking the development of the individual embryo. J Assist Reprod Genet，2012，29（7）：617-623.

（收稿日期：2018-08-22）

（本文編輯：林燕薇）