通腑泄熱方對膿毒癥大鼠肺功能與外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響

許志恒 李宏貴 巢陽發(fā)

摘要 目的：探究通腑泄熱方對膿毒癥大鼠肺功能與外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響。方法：選取SPF級SD大鼠120只，隨機(jī)分成6組，分別為空白對照組、假手術(shù)組、模型組、中藥低劑量組、中藥高劑量組、中藥中劑量組，每組20只，空白對照組大鼠常規(guī)喂養(yǎng)，假手術(shù)組大鼠行開腹、取出盲腸后放回腹腔并縫合切口的操作，模型組與中藥組大鼠行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)制作膿毒癥模型。各中藥組大鼠分別于造模成功后6 h、18 h、30 h、42 h給予相應(yīng)劑量湯劑灌胃。觀察48 h后各組大鼠一般情況，并取大鼠動脈血檢測外周血T淋巴細(xì)胞亞群并進(jìn)行血?dú)夥治觥＝Y(jié)果：假手術(shù)組大鼠各數(shù)據(jù)指標(biāo)與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），而模型組死亡率明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），采用中高劑量通腑泄熱方灌胃干預(yù)可提高大鼠生存率;模型組大鼠外周血中CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞的表達(dá)水平較空白對照組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;中藥低劑量組大鼠外周血中CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞的表達(dá)水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;中藥中劑量組與高劑量組大鼠CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞的表達(dá)水平高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;模型組PaO2明顯低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），PaCO2則明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;中藥低劑量組大鼠PaO2明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），PaCO2則較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;中藥中劑量組與中藥高劑量組大鼠PaO2明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），PaCO2則明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但2組間數(shù)據(jù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：通腑泄熱方可有效保護(hù)膿毒癥大鼠肺功能，降低膿毒癥相關(guān)性肺損傷，并在一定劑量范圍內(nèi)起到調(diào)節(jié)外周血T淋巴細(xì)胞亞群水平的作用。

關(guān)鍵詞 膿毒癥;T淋巴細(xì)胞亞群;肺功能損傷;通腑泄熱方;大鼠

Abstract Objective：To investigate the effects of Tongfu Xiere Decoction on lung function and peripheral T lymphocyte subpopulations in septic rats.Methods：A total of 120 SPF SD rats were randomly divided into 6 groups：the blank control group，the sham-operation group，the model group，the low-dose Chinese medicine group，the high-dose Chinese medicine group and the medium-dose Chinese medicine group，with 20 rats in each group.The blank control group rats were only fed routinely.Rats in the sham-operation group were only laparotomized，had their caeca removed and placed back into the abdominal cavity，and the incisions sutured.The sepsis models were established by cecal ligation and perforation in the model group and the Chinese medicine groups.The rats in each TCM group received gavage of decoctions at the corresponding dose 6 h，18 h，30 h，42 h respectively after successful model establishment.After 48 hours，the general condition of rats in each group was observed，their arterial blood was sampled for the detection of the peripheral blood T lymphocyte subpopulations，as well as for the blood gas analysis.Results：Compared with the blank control group，there was no statistical significance between the sham-operation group and the blank control group（P>0.05），while the mortality of the model group was significantly higher than that of the blank control group（P<0.05）.The gavage intervention of high-dose Tongfu Xiere Decoction could improve the survival rate of rats; the expression levels of CD3+，CD4+，CD8+ cells in the model group were lower than that in the blank control group（P<0.05）.The expression levels of CD3+，CD4+ and CD8+ cells in peripheral blood of rats in the low-dose group presented no statistical significance compared with those in the model group（P>0.05）.The expression levels of CD3+，CD4+，CD8+ cells in the middle-dose group and the high-dose group were higher than those in the model group（P<0.05）; the PaO2 level in the model group was significantly lower than that in the blank control group（P<0.05），while the PaCO2 level was significantly increased（P>0.05）.The level of PaO2 was significantly higher in the low-dose group than that in the model group（P<0.05），while the level of PaCO2 was significantly lower than that in the model group（P>0.05）.The PaO2 levels of the middle-dose Chinese medicine group and the high-dose Chinese medicine group of were significantly higher than that of the model group（P<0.05）while the PaCO2 levels were significantly lower（P>0.05），but no statistical significance was shown between those 2 groups（P>0.05）.Conclusion：Tongfu Xiere Decoction can effectively protect the lung function of septic rats to reduce sepsis-related lung injury，and it plays a role in regulating the level of T lymphocyte subpopulations in peripheral blood within a certain dose range.

Key Words Sepsis; T lymphocyte subsets; Pulmonary function impairment; Tongfu Xiere Decoction; Rats

中圖分類號：R289.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.05.024

膿毒癥（Sepsis）發(fā)病過程中由于致病微生物及其裂解或分泌的毒素在機(jī)體內(nèi)蓄積，可直接損傷機(jī)體組織細(xì)胞[1]，并引發(fā)全身性炎性反應(yīng)綜合征（System Inflammatory Response Syndrome，SIRS），大量炎性細(xì)胞被激活并釋放大量炎性反應(yīng)遞質(zhì)入血，導(dǎo)致炎性反應(yīng)失控并間接損傷機(jī)體臟器組織[2]，隨著病情發(fā)展可出現(xiàn)多器官衰竭綜合征、膿毒性休克等，臨床膿毒癥相關(guān)性死亡率高達(dá)28%～50%[3]。而在膿毒癥早期，往往先出現(xiàn)膿毒癥相關(guān)性急性肺損傷與急性呼吸窘迫綜合征，是導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一[4]。臨床研究表明，膿毒癥所誘導(dǎo)的全身性炎性反應(yīng)并不僅僅是大量釋放炎性反應(yīng)遞質(zhì)，隨著膿毒癥發(fā)展可出現(xiàn)T淋巴細(xì)胞凋亡，機(jī)體出現(xiàn)免疫抑制后無力清除體內(nèi)感染病菌，也是膿毒癥死亡的主要原因[5-6]。中醫(yī)強(qiáng)調(diào)辨證論治治療膿毒癥療效好，本研究所用通腑泄熱方具有清熱解毒、攻里通下之功效，臨床治療膿毒癥患者效果顯著，但關(guān)于該方劑對機(jī)體免疫功能的報道研究較為少見，故本實(shí)驗(yàn)選用本院常用湯劑通腑泄熱方對膿毒癥大鼠進(jìn)行干預(yù)，并觀察該方劑對膿毒癥大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響，探究其對膿毒癥相關(guān)性肺損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

選取SPF級雄性SD大鼠120只（由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證SCXK（粵）2008-0020）體質(zhì)量150～210 g，干預(yù)前進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)前1天晚上停止喂食，自由飲水。

1.1.2 藥物

按照成人組方用量配制通腑瀉熱方，主要方劑組成：虎杖30 g、地膽草30 g、生大黃10 g、芒硝10 g、山梔子10 g、龍膽草5 g、忍冬藤15 g、萊菔子10 g，除芒硝外，其余中藥分別用水浸泡30 min，其余六味后加熱煎煮30 min，大黃后下，煎煮沸騰后濾取煎液，復(fù)渣再次煎液合并，納入芒硝并加濕充分溶解。紗布過濾，濾液水浴蒸發(fā)濃縮至含生藥1、2、4 g/mL 3種不同的劑量后放置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

選取SPF雄性大鼠120只，隨機(jī)分為6組，每組20只，分別為空白對照組、假手術(shù)組、模型組，空白對照組除常規(guī)喂養(yǎng)外不做任何干預(yù)，假手術(shù)組只行開腹、取出盲腸并放回后關(guān)腹的操作。大鼠術(shù)后均在大鼠背部皮下注射生理鹽水以補(bǔ)充手術(shù)中大鼠體液丟失，并起到抗休克的作用。模型組大鼠制備步驟SD大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛35 mg/kg麻醉后腹部剃毛消毒，鋪無菌洞巾。沿腹正中線作1.5 cm切口，沿著回腸找到盲腸，在盲腸根部進(jìn)行結(jié)扎，結(jié)扎長度約0.8 cm，避免結(jié)扎回腸盲腸以及系膜血管。用18G注射器針頭貫通穿刺盲腸2次，并用5-0縫合線穿過系好，防止針孔閉合。將盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁切口，術(shù)畢。立即動物皮下注射生理鹽水10 mL/kg以補(bǔ)充術(shù)中體液丟失并抗休克。術(shù)后禁食8 h，自由飲水。

1.2.2 給藥方法

中藥組大鼠分別按成人（60 kg體質(zhì)量）劑量轉(zhuǎn)換系數(shù)為0.018，于造模后6 h，18 h，30 h，42 h給予4.5 g/（kg·d）中藥灌胃。其余3組則在相應(yīng)時間點(diǎn)給與生理鹽水灌胃。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

記錄各組大鼠生存情況后，對各組存活大鼠均采用腹腔注射40 mg/kg水合氯醛麻醉后，沿著腹正中線切口進(jìn)入腹腔并用手術(shù)鉗推開腹腔小腸后暴露腹主動脈，采集5 mL腹主動脈血后分離血漿，外周血T淋巴細(xì)胞亞群則將血液樣本處理有采用細(xì)胞流式儀進(jìn)行檢查。并取動脈血行血?dú)夥治鰴z測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，其中計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，計量單位采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠生存情況比較

空白對照組大鼠與假手術(shù)組大鼠未見大鼠死亡，存活率為100%;手術(shù)后48 h，模型組大鼠死亡14只，存活率為30.00%;中藥低劑量組大鼠死亡11只，存活率為45.00%，與模型組存活率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;中藥中劑量組與高劑量組均死亡7只，存活率為65.00%明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 各組大鼠外周血中T淋巴細(xì)胞亞群比較

假手術(shù)組大鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞的表達(dá)與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;模型組大鼠外周血中CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞的表達(dá)較空白對照組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;中藥低劑量組大鼠外周血中CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞的表達(dá)水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;中藥中劑量組與高劑量組大鼠CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞的表達(dá)高于模型組（P<0.05），但2組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.3 各組大鼠血?dú)獗容^

假手術(shù)組大鼠的PaO2、PaCO2與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），模型組PaO2明顯低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），PaCO2則明顯升高（P>0.05）;中藥低劑量組大鼠PaO2明顯高于模型組，PaCO2則較模型組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;中藥中劑量組與中藥高劑量組大鼠PaO2明顯高于模型組，PaCO2則明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

3 討論

現(xiàn)代臨床生理病理研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體免疫系統(tǒng)對膿毒癥的應(yīng)答可而分為2個部分，早期高炎性反應(yīng)期與后期免疫抑制期[7]。時間較短的高炎性反應(yīng)時期，在這個時期機(jī)體固有免疫成員參與并產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答[8]，大量活化的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等向肺部募集，并產(chǎn)生大量的炎性反應(yīng)遞質(zhì)損傷肺部細(xì)胞，并產(chǎn)生組織炎性反應(yīng)[9-10]，但并不是單純的促炎性反應(yīng)，同時還有相應(yīng)抗炎反應(yīng)以減弱炎性反應(yīng)遞質(zhì)的作用，唐榮等[11]通過觀察膿毒癥及膿毒癥急性腎損傷患者外周靜脈血T淋巴細(xì)胞亞群的水平變化，發(fā)現(xiàn)膿毒癥及膿毒癥急性腎損傷患者存在著不同程度的細(xì)胞免疫失衡，表現(xiàn)為循環(huán)CD3+T、CD4+T細(xì)胞百分比和CD4+T/CD8+T比值的下降。故可認(rèn)為肺部T淋巴細(xì)胞亞群的變化是導(dǎo)致肺部發(fā)生繼發(fā)性損傷的主要因素之一。

而中醫(yī)藥復(fù)方主要通過多成分、多途徑、多靶點(diǎn)、多機(jī)制綜合復(fù)雜調(diào)控發(fā)揮治療作用，治療膿毒癥所致的多器官多系統(tǒng)疾病有明顯療效。中醫(yī)古籍醫(yī)書中并未有“膿毒癥”的記載，而現(xiàn)代醫(yī)師多根據(jù)膿毒癥發(fā)病時的臨床特征將其歸類為熱毒內(nèi)蘊(yùn)、正氣內(nèi)虛、腑實(shí)不通、瘀血阻滯等辨證分型[12]。我們通過長時間的觀察，內(nèi)毒外邪入侵是導(dǎo)致膿毒癥發(fā)病的主要原因，故選取腑泄熱方作為研究方劑，該方主要功效有清熱解毒、通里攻下[13]。研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠各數(shù)據(jù)指標(biāo)與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明手術(shù)操作并不影響大鼠肺功能與體內(nèi)T淋巴細(xì)胞亞群水平。模型組大鼠外周血中CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞的表達(dá)水平較空白對照組低，根據(jù)造模條件，膿毒癥相關(guān)性炎性反應(yīng)高峰應(yīng)在造模后12 h時，由于選取的時間點(diǎn)為造模后48 h，相當(dāng)于膿毒癥后期，也就是免疫抑制期，該時期模型組PaO2明顯低于空白對照組，PaCO2則明顯升高，說明肺功能受到明顯的損傷。戴凌燕等[14]認(rèn)為CD4+T淋巴細(xì)胞具有抑制中性粒細(xì)胞聚集的作用，環(huán)節(jié)肺部炎性反應(yīng)，程婷婷等[15]對膿毒性誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠支氣管肺泡灌洗液及肺部組織中的促炎性反應(yīng)遞質(zhì)、趨化因子水平及肺組織髓過氧化物酶活性進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)B和T淋巴細(xì)胞衰減因子可通過激活肺部炎性細(xì)胞增加小鼠肺通透性，肺部中性粒細(xì)胞募集促使肺細(xì)胞凋亡。說明T淋巴細(xì)胞在肺部聚集有利于肺的保護(hù)作用[16]。但隨著機(jī)體大量消耗能量物質(zhì)，代謝負(fù)荷加重，大量固有免疫細(xì)胞凋亡，這種高強(qiáng)度炎性反應(yīng)慢慢下降[17]，若此時機(jī)體免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)失衡，髓性抑制細(xì)胞增加、Treg細(xì)胞增殖、免疫細(xì)胞耗竭可導(dǎo)致機(jī)體進(jìn)入膿毒癥后期免疫抑制期，在這個時期T淋巴細(xì)胞受到抑制或程序性死亡，導(dǎo)致機(jī)體無力清除體內(nèi)病原菌，加重臟器損傷[18-19]，死亡率大大增加。陳浩等[20]采用祛瘀解毒益氣方治療膿毒癥患者胃腸功能障礙，發(fā)現(xiàn)方中大黃具有瀉熱通腸、逐瘀通經(jīng)，保護(hù)腸胃功能的重要作用，降低腸壁血管壁的通透性以防止腸道細(xì)菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素進(jìn)入血液循環(huán)中，達(dá)到治療的效果。采用藥物干預(yù)后雖然中藥低劑量組大鼠外周血中CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞表達(dá)與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但中藥中劑量組與高劑量組大鼠CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞表達(dá)高于模型組，且中藥給藥各組大鼠肺血?dú)庵笜?biāo)均較模型組有所改善，說明通腑泄熱方可起到明顯的肺保護(hù)作用，并在一定劑量范圍內(nèi)起到調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞免疫作用。方劑組成中的生大黃、萊菔子、地膽草、虎杖等諸味中藥均有確切的抗菌、抗炎反應(yīng)[21]，劉大全等[22]采用主要組成為大黃、黃芩、白頭翁、敗醬草的清熱解毒方通過抑制致病菌的繁殖而對膿毒癥起到治療作用。且生大黃、芒硝、山梔子具有調(diào)節(jié)免疫、增加腸蠕動，抑制腸內(nèi)水分吸收，促進(jìn)排便的作用，治療膿毒癥相關(guān)炎性反應(yīng)的同時調(diào)節(jié)腸胃運(yùn)化功能[22]，忍冬藤與龍膽草均有清熱解毒，燥濕瀉肝的功效，諸藥齊下可起到清熱解毒、祛濕清邪的功效[23]。

但通腑泄熱方中各味藥物在體內(nèi)調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的主要作用機(jī)制仍不明確，有待進(jìn)一步深入探究。

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（2018-06-28收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）