天山雪蓮組織培養(yǎng)體系的優(yōu)化

丁黛靈 陳蕓 魏炯河 張振霞 鄭玉忠

摘要：通過研究天山雪蓮種子消毒萌發(fā)條件、愈傷組織培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)條件，優(yōu)化出了一套能獲得總黃酮成分含量較高的天山雪蓮愈傷組織的組織培養(yǎng)體系。結(jié)果表明：將種子用70%乙醇處理30 s、0.1%升汞溶液處理10 min，并種植于MS培養(yǎng)基，可獲得生長狀態(tài)良好的雪蓮苗。比較了7種培養(yǎng)基對天山雪蓮無菌苗葉片愈傷組織的誘導(dǎo)情況，愈傷誘導(dǎo)率均能達(dá)到100%，其中4種培養(yǎng)基獲得愈傷組織適合繼代培養(yǎng)。在繼代培養(yǎng)中，①號培養(yǎng)基的愈傷組織易分化出根，②號培養(yǎng)基、③號培養(yǎng)基的愈傷組織易分化出芽;④號培養(yǎng)基可得到較多黃綠色致密愈傷組織。對①號、②號、③號、④號培養(yǎng)基獲得愈傷組織的總黃酮含量檢測，發(fā)現(xiàn)其總黃酮含量為1.14%～7.37%，遠(yuǎn)高于《中華人民共和國藥典（2015版）》不少于0.15%的規(guī)定，以②號培養(yǎng)基的愈傷組織總黃酮含量最高。

關(guān)鍵詞：天山雪蓮;組織培養(yǎng);總黃酮

中圖分類號：S567? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ?文章編號：1001-1463（2019）06-0025-04

Abstract：By studying the germination conditions， callus culture conditions and secondary culture conditions of Saussurea involucrata， we optimized the tissue culture system to obtain the callus with high content of total flavonoids. The results showed that the seeds were treated with 70% ethanol for 30 seconds and 0.1% mercury solution for 10 minutes， and planted on MS medium， the seedlings of Saussurea involucrata in good growth condition could be obtained. The induction of callus from leaves of Saussurea involucrata Sterile seedlings on 7 media was compared. The induction rate of callus could reach 100%. Among them， 4 the obtained callus were suitable for subculture. In subculture， callus of No. 1 medium was easy to differentiate into roots， callus of No. 2 and No. 3 were easy to differentiate into buds， and callus of No. 4 medium could obtain more yellow-green dense callus. The content of total flavonoids in callus obtained from medium No. 1， No. 2， No. 3 and No. 4 was determined. It was found that the content of total flavonoids was 1.14%～7.37%， which was much higher than that stipulated in Chinese Pharmacopoeia （2015 edition）.? The content of total flavonoids in callus obtained from callus of No. 1 medium was the highest.

Key words：Saussurea involucrata;Tissue culture;Total flavonoids

天山雪蓮[Saussurea involucrate （Kar.et Kir.）Sch.-Bip.]為菊科鳳毛菊屬多年生高山草本植物，其地上部分是中國維吾爾族習(xí)用藥材。性溫、微苦，具有溫腎助陽、祛風(fēng)勝濕、通經(jīng)活血等功效，主要用于風(fēng)寒濕痹痛、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及小腹冷痛、月經(jīng)不? 調(diào)[1 ]。天山雪蓮生境特異，自然繁殖率低，生長慢，人工栽培困難，長期掠奪性采挖使其野生資源瀕臨滅絕。1996年中國已將天山雪蓮列為國家二級保護(hù)植物。2000年國務(wù)院13號文件已明令禁止采挖野生雪蓮。

天山雪蓮含有多種黃酮類物質(zhì)[2 ]，組織培養(yǎng)技術(shù)可為天山雪蓮次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)提供切實可行的手段[3 ]，是解決天山雪蓮資源短缺的有效途徑。20世紀(jì)90年代開始，就有雪蓮組織培養(yǎng)的相關(guān)文獻(xiàn)報道。近年來對雪蓮的組織培養(yǎng)、藥用成分測定的報道較多，取得了一定進(jìn)展。我們利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對天山雪蓮幼苗進(jìn)行誘導(dǎo)增殖，同時對天山雪蓮培養(yǎng)物成分進(jìn)行分析比較研究，得出合適的組織培養(yǎng)條件和測定方法，有利于天山雪蓮的資源化和保護(hù)化研究。

1? ?材料與方法

1.1? ?供試材料

野生天山雪蓮種子由香港科技大學(xué)中藥研發(fā)中心提供。選取健壯飽滿、無病蟲害的種子（千粒重3.544 g）。

以MS為基本培養(yǎng)基，附加蔗糖30 g/L，瓊脂7 g/L，不同濃度2，4-D、NAA、6-BA等激素，pH 5.8。所有培養(yǎng)基均在121℃條件下高壓滅菌15 min。

培養(yǎng)室溫度（20±2） ℃，空氣濕度50%～ 60%，光照時間12 h/d，光照強(qiáng)度1 000～? ?1 500 lx。

1.2? ?方法

1.2.1? ? 天山雪蓮種子萌發(fā)條件優(yōu)化? ? 自然條件萌發(fā)：種子用蒸餾水浸泡過夜，置于濕濾紙上，發(fā)芽后移至裝有土壤的花盆繼續(xù)生長。消毒后萌發(fā)：種子在70%乙醇浸泡30 s，用無菌水沖洗2～3次后在0.05%升汞溶液或0.1%升汞溶液中消毒10 min，然后用無菌水清洗4次后并浸泡過夜，置于含有濕濾紙的滅菌培養(yǎng)皿中，發(fā)芽后移至MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，5 d時統(tǒng)計不同處理的種子萌發(fā)率，30 d時統(tǒng)計不同處理的幼苗存活率。

1.2.2? ? 不同植物激素配比對天山雪蓮無菌苗葉片外植體誘導(dǎo)的影響? ? 在MS培養(yǎng)基中加入不同劑量植物激素，配制7種不同的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，具體配比及劑量詳見? ? ?表1[4 - 7 ]。將在無菌環(huán)境培養(yǎng)的雪蓮無菌苗葉片剪成約0.5 cm×0.5cm大小的外植體，分別接種到①號、②號、③號、④號、⑤號、⑥號、⑦號誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，于20 ℃，12 h/d光照條件下培養(yǎng)觀察。同時將所有愈傷組織收集，以備后續(xù)檢測。

1.2.3? ? 天山雪蓮愈傷組織培養(yǎng)物總黃酮成分測定? ? 精密稱取蘆丁對照品5 mg，置于25 mL容量瓶中，用60%甲醇溶解定容，作為0.2 mg/mL蘆丁對照品溶液。分別精密量取對照品溶液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置于25 mL容量瓶，加蒸餾水至6.0 mL;加5%亞硝酸鈉1 mL，混勻后靜置6 min;再加10%硝酸鋁1 mL，混勻后靜置6 min;然后加4%氫氧化鈉10 mL，再加蒸餾水定容。用分光光度計在510 nm波長處測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[8 ]。

精密稱取干燥的天山雪蓮固體培養(yǎng)物細(xì)粉10 mg，置于15 mL離心管中，加60%甲醇10 mL，稱重記錄，超聲提取15 min，用60%甲醇補(bǔ)足失重，離心，取上清液為供試品溶液。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?天山雪蓮種子的萌發(fā)

由表2結(jié)果顯示，天山雪蓮種子在自然條件與0.1%升汞溶液消毒下的萌發(fā)率相近，遠(yuǎn)高于0.05%升汞溶液消毒的萌發(fā)率。由于廣東潮州地區(qū)氣溫高，自然條件下的雪蓮苗基本無法存活，采用消毒和培養(yǎng)基培養(yǎng)的方法獲得的萌發(fā)苗存活較理想。比較3種方法，采用70%乙醇處理30 s，0.1%升汞溶液處理10 min、無菌水清洗4次的方案效果較好，存活率高且污染率低。

2.2? ?不同培養(yǎng)基對天山雪蓮無菌苗葉片外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

從7種培養(yǎng)基對天山雪蓮無菌苗葉片愈傷組織誘導(dǎo)的情況（表3）可以看出，7種不同的培養(yǎng)基對天山雪蓮無菌苗葉片的愈傷組織誘導(dǎo)效果都理想，均為100%，但⑤號、⑥號、⑦號培養(yǎng)基培養(yǎng)愈傷組織偏黃褐色，比較干，不太適合后期的培養(yǎng)生長。

2.3? ?不同固體培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)天山雪蓮的情況

取上述①號、②號、③號、④號培養(yǎng)基的愈傷組織，用相應(yīng)的培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)。表4和圖1結(jié)果顯示，①號培養(yǎng)基的愈傷組織易分化出根，文獻(xiàn)未有報道此現(xiàn)? ? ?象[4 ];②號培養(yǎng)基和③號培養(yǎng)基的天山雪蓮愈傷組織均可分化出芽，而③號培養(yǎng)基的愈傷組織分化出的芽多且成活率較高，文獻(xiàn)中未有報道此現(xiàn)象[5 - 6 ];在④號培養(yǎng)基可得到較多綠色致密性愈傷組織?？梢?，若要得到更多的再生植株，可使用①號培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織，再分化生根，然后轉(zhuǎn)移至③號培養(yǎng)基使其分化生芽;若要得到較多的綠色致密性愈傷組織，可選用④號培養(yǎng)基，④號培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)時愈傷組織生長速度快，顏色由綠色轉(zhuǎn)變成黃綠色。

2.4? ?不同培養(yǎng)基上的天山雪蓮愈傷組織中的總黃酮成分測定

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（X）為橫坐標(biāo)，OD值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=12.05X-0.005，R2=0.999 8。當(dāng)蘆丁濃度在0～0.05 mg/mL內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系。

精密稱取干燥的天山雪蓮固體培養(yǎng)物，測定其總黃酮含量，結(jié)果顯示，①號、②號、③號、④號培養(yǎng)基中總黃酮含量分別為2.59%、7.37%、5.76%、1.14%（表5），遠(yuǎn)高于《中華人民共和國藥典（2015版）》中總黃酮含量不少于0.15%的規(guī)定。說明應(yīng)用組織培養(yǎng)獲得的天山雪蓮愈傷組織是具備藥用價值的。

3? ?結(jié)論與討論

資源問題依然是限制新疆雪蓮開發(fā)利用的瓶頸，植物的組織細(xì)胞培養(yǎng)已經(jīng)成為解決此問題的有效途徑[5 ]。雪蓮的人工栽培已取得初步成效，組織培養(yǎng)研究已有較多成? ? ?果[9 ]，尋找一種較優(yōu)的天山雪蓮組織培養(yǎng)體系非常必要。從對天山雪蓮種子采用70%乙醇30 s，0.1%升汞10 min，無菌水沖洗4次和接種無菌濕濾紙的處理方法不僅可以獲得與自然條件下相近的萌發(fā)率，且污染率較低，萌發(fā)苗存活率較好。無菌萌發(fā)苗最好是在環(huán)境溫度（19±2 ℃）和濕度（57%以上）較為適宜且穩(wěn)定的條件下在培養(yǎng)基中進(jìn)行無菌培養(yǎng)（光照12 h/d）。

從對天山雪蓮葉片的愈傷組織的誘導(dǎo)率來看，幾種培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果都很好，其中①號培養(yǎng)基誘導(dǎo)和培養(yǎng)的天山雪蓮愈傷組織易分化出根;③號培養(yǎng)基可較好誘導(dǎo)和培養(yǎng)天山雪蓮愈傷組織分化出芽，且在黑暗條件下更容易分化出芽;在④號培養(yǎng)基上誘導(dǎo)和培養(yǎng)可得到較多黃綠色致密性愈傷組織。由此可見，不同培養(yǎng)基可用于天山雪蓮分化苗不同階段的生產(chǎn)培育。②號培養(yǎng)基和③號培養(yǎng)基的生長素/細(xì)胞分裂素的比值是有差異的，②號培養(yǎng)基為2∶1，③號培養(yǎng)基為4∶1，但也都出現(xiàn)分化芽，可能與天山雪蓮內(nèi)源激素有關(guān)，需做進(jìn)一步研究[5 ]。

各個條件下天山雪蓮組織培養(yǎng)物總黃酮測定結(jié)果均符合《中華人民共和國藥典（2015版）》規(guī)定的含量，不同培養(yǎng)基的天山雪蓮培養(yǎng)物總黃酮的含量均有差異，可為天山雪蓮總黃酮的生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

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（本文責(zé)編：鄭立龍）