辣椒藥材的HPLC指紋圖譜建立及聚類(lèi)分析和主成分分析

馮華 王祥培 王世俊 鄭凰雅 張強(qiáng)

摘 要 目的：建立辣椒藥材的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并進(jìn)行聚類(lèi)分析和主成分分析。方法：采用HPLC法。色譜柱為Agilent C18，流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸水溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為15 μL。以辣椒素峰為參照，繪制15批藥材樣品的HPLC指紋圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版）進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，確定共有峰，并采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析和主成分分析。結(jié)果：15批藥材樣品的HPLC圖譜相似度均在0.95以上；有12個(gè)共有峰，并指認(rèn)了辣椒素峰；聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，15批藥材樣品可聚為3類(lèi)，S1、S3～S5、S7、S9～S13聚為一類(lèi)，S2、S14、S15聚為一類(lèi)，S6、S8聚為一類(lèi)。經(jīng)主成分分析，4個(gè)主成分因子的累積方差貢獻(xiàn)率為94.093%，以S5藥材樣品的主成分因子綜合得分最高、整體質(zhì)量最好。結(jié)論：所建HPLC指紋圖譜及聚類(lèi)分析和主成分分析結(jié)果可為辣椒藥材的質(zhì)量控制提供參考。

關(guān)鍵詞 辣椒；高效液相色譜法；指紋圖譜；聚類(lèi)分析；主成分分析

Establishment of HPLC Fingerprint， Cluster Analysis and Principal Component Analysis of Capsicum annuum

FENG Hua1，WANG Xiangpei2，WANG Shijun1，ZHENG Huangya1，ZHANG Qiang1（1. TCM Section， Zunyi Institute for Food & Drug Control， Guizhou Zunyi 563002， China； 2. School of Pharmacy， Guiyang College of TCM， Guiyang 550002， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish HPLC fingerprint of Capsicum annuum，and to conduct cluster analysis and principal component analysis. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Agilent C18 column with mobile phase consisted of methanol-0.2% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 235 nm， and column temperature was 30 ℃. The sample size was 15 μL. Using capsaicin peak as reference， HPLC fingerprints of 15 batches of C. annuum from different production areas were determined. The similarity evaluation of common peaks was evaluated by using the TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System （2004 A edition） to confirm common peaks. Cluster analysis and principal component analysis were performed by using SPSS 19.0 software. RESULTS： The similarities were more than 0.95 in HPLC chromatograms of 15 batches of C. annuum. There were 12 common peaks. Its HPLC fingerprint was in good agreement with that of control fingerprint. 15 batches can be divided into three sub-categories as S1， S3-S5， S7， S9-S13 sub-categorie， S2， S14， S15 sub-categorie and S6， S8 sub-categorie. Through the principal component analysis， the cumulative contribution rate of 4 main component factors was 94.093， and comprehensive score of S5 was the highest with the best quality. CONCLUSIONS： Established HPLC fingerprints， cluster analysis and principal component analysis results can provide reference for the quality control of C. annuum.

KEYWORDS Capsicum annuum； HPLC； Fingerprint； Cluster analysis； Principal component analysis

辣椒為茄科植物辣椒（Capsicum annuum L.）的干燥成熟果實(shí)，被2015年版《中國(guó)藥典》（一部）和2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》收載為藥材品種[1-2]。辣椒具有溫中散寒、開(kāi)胃消食的功效，可用于治療寒滯腹痛、嘔吐、瀉痢、凍瘡[1-2]。辣椒素是辣椒中的一種辛辣成分，可通過(guò)結(jié)合辣椒素受體， 使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高， 引起神經(jīng)元及其纖維釋放多種內(nèi)啡肽， 具有抗炎、鎮(zhèn)痛、擴(kuò)張心血管、抗腫瘤、保護(hù)胃黏膜、促進(jìn)潰瘍愈合、抑制幽門(mén)螺桿菌等作用[3-4]。目前辣椒的質(zhì)量控制項(xiàng)目只有性狀、顯微及薄層鑒別、辣椒素和二氫辣椒素含量測(cè)定。其中2015年版《中國(guó)藥典》（一部）僅對(duì)上述兩個(gè)主成分的含量進(jìn)行控制，這就難以全面評(píng)價(jià)其質(zhì)量。

指紋圖譜技術(shù)是整體表征中藥所含成分的一種有效方法，是中藥及其制劑質(zhì)量控制的有效手段之一[3]。辣椒含有辣椒素、二氫辣椒素、降二氫辣椒堿、高辣椒堿、高二氫辣椒堿、辣椒紅色素、辣椒玉紅素等成分[4]。通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前還未有體現(xiàn)辣椒整體化學(xué)信息的研究報(bào)道。為此，筆者采用高效液相色譜法（HPLC）建立了15批辣椒藥材樣品的指紋圖譜，并結(jié)合聚類(lèi)分析法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以期為其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-1260型HPLC儀，包括四元泵、二極管陣列檢測(cè)器、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、Agilent1260型工作站（美國(guó)Agilent 公司）；AB204-S型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；YF-111型中藥粉碎機(jī)（浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）。

1.2 藥品與試劑

辣椒素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：1110839-201403，純度：100%）；甲醇（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

15批藥材樣品均于2017年9月采集于貴州省遵義市，經(jīng)遵義市食品藥品檢驗(yàn)所鄧順超副主任藥師鑒定為茄科植物辣椒（Capsicum annuum L.）的干燥成熟果實(shí)。樣品來(lái)源見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，10%A→20%A；10～20 min，20%A→40%A；20～35 min，40%A→70%A；35～50 min，70%A；50～55 min，70%A→10%A；55～60 min，10%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：235 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：15 μL[5-8]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取辣椒素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含辣椒素0.05 mg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取樣品粉末（過(guò)2號(hào)篩）約2.0 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，加甲醇20 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲（功率：250 w，頻率：40 kHz）提取50 min，放至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S3）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以辣椒素峰為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，12個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S3）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、16、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以辣椒素峰為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，12個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品粉末（編號(hào)：S3）6份，每份約2.0 g，精密稱(chēng)定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以辣椒素峰為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，12個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜生成與相似度、共有峰相關(guān)分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取15批藥材樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版）對(duì)15批藥材樣品的HPLC指紋圖譜進(jìn)行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見(jiàn)圖1、圖2。

2.4.2 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004A版）對(duì)樣品進(jìn)行整體相似度分析。結(jié)果顯示，15批藥材樣品的相似度均大于0.95，且與對(duì)照指紋圖譜具有較好的一致性，表明樣品間成分差異較小、質(zhì)量穩(wěn)定性良好，詳見(jiàn)表2。

2.4.3 共有峰的指認(rèn)及相關(guān)分析 15批藥材樣品共有12個(gè)共有峰，通過(guò)與對(duì)照品HPLC圖（見(jiàn)圖3）對(duì)比，指認(rèn)出10號(hào)峰為辣椒素峰。由于該峰峰面積大，且為所有樣品共有，故以其保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算其他峰相對(duì)于該成分峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，詳見(jiàn)表3、表4。

2.5 聚類(lèi)分析

以各共有峰的峰面積原始數(shù)據(jù)為變量，采用SPSS 19.0軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以歐氏距離為測(cè)度進(jìn)行聚類(lèi)分析，詳見(jiàn)圖4。由圖4可知，15批藥材樣品可聚為3類(lèi)：S1、S3～S5、S7、S9～S13聚為一類(lèi)，S2、S14、S15聚為一類(lèi)，S6、S8聚為一類(lèi)。

2.6 主成分分析

2.6.1 主成分因子特征值、方差貢獻(xiàn)率分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行主成分因子分析，其特征值和方差貢獻(xiàn)率詳見(jiàn)表5。由表5可知，以特征值>1為標(biāo)準(zhǔn)，得到前4個(gè)主成分因子的特征值分別為 56.299、16.826、13.591、7.377，方差貢獻(xiàn)率分別為 56.299%、16.826%、13.591%、7.377%，累積方差貢獻(xiàn)率為94.093%，表明前4個(gè)主成分即可以代表樣品94%以上的信息，提示該組數(shù)據(jù)有突出的成分可作為依據(jù)，適用于主成分分析。

采用前4個(gè)主成分因子為指標(biāo)對(duì)15批藥材樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)，詳見(jiàn)表6。由表6可知，主成分因子1可反映成分2、3、4、5、6、7、8、10、11、12的信息，主成分因子2可反映成分1、9、12的信息，主成分因子3可反映成分1、6、7的信息，主成分因子4可反映成分1、2、3的信息。

2.6.2 綜合質(zhì)量評(píng)分 以上述4個(gè)主成分因子對(duì)15批藥材樣品質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)分（綜合得分=相應(yīng)的因子得分×[相應(yīng)主成分因子的特征值] [√]，綜合得分越高表示藥材樣品整體質(zhì)量越好[9]），結(jié)果見(jiàn)表7。由表 7可知，S5藥材樣品主成分因子綜合得分最高，該批樣品中成分2、3、4、5、6、7、8、10、11、12的含量相對(duì)較高，整體質(zhì)量相對(duì)較好。

3 討論

3.1 指紋圖譜相關(guān)參數(shù)考察

筆者通過(guò)采用二極管陣列檢測(cè)器在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)在225、235、280 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，其中在235 nm波長(zhǎng)處色譜圖基線噪音較低，各峰的保留時(shí)間適中，分離度較好，基線穩(wěn)定，有利于指紋圖譜分析，考慮兼顧各成分的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度和檢測(cè)靈敏度，故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm。筆者通過(guò)考察不同濃度甲醇、乙醇為提取溶劑發(fā)現(xiàn)，以甲醇提取時(shí)的出峰個(gè)數(shù)較多、峰形好，且基線平整，故選擇甲醇為提取溶劑。又通過(guò)比較超聲、浸漬、回流提取3種不同提取方法對(duì)色譜圖的影響，結(jié)果3種提取方法下所得色譜圖沒(méi)有差異，考慮到超聲操作省時(shí)、方便，故選擇提取方法為超聲提??；進(jìn)一步對(duì)30、40、50、60 min等不同提取時(shí)間進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取50 min后提取效果基本接近，故選擇提取時(shí)間為50 min。此外通過(guò)對(duì)甲醇-磷酸、甲醇-水、乙腈-水3個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)（等度洗脫）進(jìn)行考察，結(jié)果各峰分離度均達(dá)不到分離要求；進(jìn)一步選擇梯度洗脫后發(fā)現(xiàn)，以甲醇-0.2%磷酸水溶液洗脫效果最好，出峰數(shù)最多，基線平穩(wěn)，各峰分離度均達(dá)到分離要求[10-11]。

3.2 參照峰的選擇

辣椒主要成分為辣椒素和二氫辣椒素[12]，筆者以辣椒素和二氫辣椒素為參照時(shí)發(fā)現(xiàn)，辣椒素峰靠中、峰面積大，而二氫辣椒素峰靠后、峰面積相對(duì)較小，故通過(guò)色譜定位，指認(rèn)10號(hào)峰為辣椒素。

3.3 不同產(chǎn)地辣椒藥材成分比較

筆者通過(guò)建立辣椒HPLC指紋圖譜，并對(duì)15批藥材樣品進(jìn)行比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，辣椒對(duì)照指紋圖譜共有峰保留時(shí)間、相對(duì)峰面積與各產(chǎn)地辣椒樣品非常吻合，15批藥材樣品相似度均在0.95以上；從15批藥材樣品指紋圖譜12個(gè)共有峰可以看出，峰面積大小差異較大，說(shuō)明不同產(chǎn)地辣椒共有成分雖一致，但含量存在差異，這可能與其生長(zhǎng)環(huán)境因素有關(guān)[13-14]。

3.4 辣椒藥用情況

以往辣椒主要在食品方面研發(fā)較多，在藥用方面研究較少。其實(shí)早在《全國(guó)中草藥匯編》中已將辣椒納入藥用，而自從辣椒被2010年版《中國(guó)藥典》（一部）收載為藥材品種后，其藥用開(kāi)發(fā)開(kāi)始受到重視。目前有辣椒風(fēng)濕膏、復(fù)方辣椒堿乳膏、辣椒堿乳膏等藥字號(hào)品種上市。辣椒是遵義市的一項(xiàng)傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)，有近兩百多年的種植歷史。遵義辣椒1960年被評(píng)為全國(guó)七大名椒之一，2001年榮獲中國(guó)農(nóng)業(yè)博覽會(huì)“名牌產(chǎn)品”[15]。遵義產(chǎn)辣椒品種較多，筆者只針對(duì)茄科植物辣椒（C. annuum L.）這個(gè)藥典品種進(jìn)行研究，后續(xù)擬擴(kuò)大品種研究范圍，以期為遵義辣椒深度開(kāi)發(fā)與應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究所建HPLC指紋圖譜、聚類(lèi)分析、主成分分析結(jié)果可為辣椒藥材的質(zhì)量控制提供參考。

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（收稿日期：2018-04-23 修回日期：2019-03-19）

（編輯：余慶華）