白鮮皮多糖硫酸酯化修飾及抗銀屑病作用研究

張凱 張宇 王麗紅 張義秀 王宇亮 趙統(tǒng)超 趙宏 王瑞瑞

摘 要 目的：對(duì)白鮮皮精制多糖（DDP-Ⅲ）進(jìn)行硫酸酯化修飾，并比較其酯化修飾前后的結(jié)構(gòu)特征及抗銀屑病作用。方法：采用DEAE-52陰離子交換纖維素柱、Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱等對(duì)白鮮皮多糖（DDP）進(jìn)行分離純化，得DDP-Ⅲ；用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化后，采用高效液相色譜法測(cè)定其單糖組成。用酯化試劑（無水吡啶+氯磺酸）對(duì)DDP-Ⅲ進(jìn)行硫酸酯化修飾，得SDDP-Ⅲ；采用氯化鋇-明膠濁度法測(cè)定其硫酸根取代度，并通過紅外光譜、拉曼光譜、掃描電鏡比較修飾前后的結(jié)構(gòu)特征。將雄性ICR小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性組（雷公藤多苷，20 mg/kg）和DDP-Ⅲ/SDDP-Ⅲ低、中、高劑量組（均分別為56、112、224 mg/kg）。除正常組小鼠外敷凡士林外，其余各組小鼠均外敷咪喹莫特乳膏復(fù)制銀屑病模型。各給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥物溶液0.4 mL，正常組與模型組小鼠灌胃等體積水，每天1次，連續(xù)14 d。末次給藥2 h后，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)各組小鼠血清白細(xì)胞介素17（IL-17）、IL-23含量，采用蘇木精-伊紅染色法觀察其近尾部皮膚鱗片，并記錄有顆粒層鱗片數(shù)。結(jié)果：DDP-Ⅲ由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖組成。SDDP-Ⅲ的硫酸根取代度為0.65。紅外光譜、拉曼光譜分析結(jié)果顯示，除與DDP-Ⅲ有相同的特征吸收峰外，SDDP-Ⅲ分別在1 255、823 cm-1和1 240、815 cm-1處有硫酸根基團(tuán)的特征吸收峰。掃描電鏡分析結(jié)果顯示，DDP-Ⅲ呈片狀，表面光滑、平整，排列緊密；SDDP-Ⅲ呈塊狀或顆粒狀，有孔洞結(jié)構(gòu)，排列疏松。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠皮損表皮明顯增厚，顆粒層明顯減少，其血清IL-17、IL-23含量均顯著升高，有顆粒層鱗片數(shù)顯著減少（P<0.05或P<0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠上述癥狀均有不同程度的改善，陽性組、DDP-Ⅲ高劑量組以及SDDP-Ⅲ中、高劑量組小鼠血清IL-17、IL-23含量均顯著下降，有顆粒層鱗片數(shù)均顯著升高，且SDDP-Ⅲ中、高劑量組上述指標(biāo)均顯著優(yōu)于DDP-Ⅲ同劑量組（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：DDP-Ⅲ含有甘露糖等5種單糖成分。DDP-Ⅲ、SDDP-Ⅲ均具有一定的抗銀屑病作用，且經(jīng)硫酸酯化修飾的SDDP-Ⅲ的作用更強(qiáng)；這種作用可能與抑制IL-23/IL-17信號(hào)通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞 白鮮皮；多糖；硫酸酯化修飾；銀屑??；炎癥因子；信號(hào)通路

Study on Sulfated Modification and Anti-psoriasis Activity of Polysaccharide from Dictamnus dasycarpus

ZHANG Kai1，ZHANG Yu1，WANG Lihong1，ZHANG Yixiu1，WANG Yuliang1，ZHAO Tongchao1，ZHAO Hong1，2，WANG Ruirui3（1. College of Pharmacy， Jiamusi University， Heilongjiang Jiamusi 154007， China； 2. Key Lab for Chinese Materia Medica， Heilongjiang University of TCM， Ministry of Education， Harbin 150040， China； 3. Dept. of Endocrinology， Jiamusi Central Hospital， Heilongjiang Jiamusi 154002， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To conduct sulfated modification of polysaccharide from Dictamnus dasycarpus （DDP-Ⅲ）， and to compare structure characteristics and anti-psoriasis activity of DDP-Ⅲ before and after sulfated modification. METHODS： DDP-Ⅲ was separated and purified with DEAE-52 anion exchange cellulose column and Sephadex G-100 column. After derived with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone， HPLC was used to determine the composition of its monosaccharide. SDDP-Ⅲ was synthesized using esterification reagent （anhydrous pyridine+chlorosulfonic acid） to modify DDP-Ⅲ. The degree of sulfate substitution was determined by barium chloride-gelatin turbidimetric method. The structures were compared by IR， Raman spectrum and SEM before and after modification. The male ICR mice were randomly divided into normal group， model group， positive group （tripterygium glycosides， 20 mg/kg） and DDP-Ⅲ/SDDP-Ⅲ low-dose， medium-dose and high-dose groups （56， 112， 224 mg/kg）. Except that normal group was given vaseline for external use， and other groups were given Imiquimod cream for external use to induce psoriasis model. At the same time， administration groups were given relevant medicine intragastrically 0.4 mL， and both normal group and model group were given constant volume of water intragastrically， once a day， for consecutive 14 d. Two hours after last medication， the serum contents of IL-17 and IL-23 were determined by ELISA. The skin scales near the tail were observed by HE staining， and the number of scales with granular layer was recorded. RESULTS： DDP-Ⅲ was composed of mannose， rhamnose， glucuronic acid， galacturonic acid and glucose. The degree of sulfate substitution was 0.65 for SDDP-Ⅲ. IR and Raman spectrum showed that the characteristic absorption peaks of sulfate radical group appeared near 1 255 cm-1 and 823 cm-1， 1 240 cm-1 and 815 cm-1 for SDDP-Ⅲ， except for same characteristic absorption peak as DDP-Ⅲ. SEM analysis showed that DDP-Ⅲ was flaky， smooth and tightly arranged； SDDP-Ⅲ was massive or granular with porous structure and loose arrangement. Animal experiment showed that compared with normal group， the epidermis of skin lesion was significantly thickened and the granular layer was significantly reduced； serum contents of IL-17 and IL-23 were increased significantly， while the number of scales with granular layer was decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， above symptoms of administration groups were improved to different extent， and serum contents of IL-17 and IL-23 in positive group， DDP-Ⅲ high-dose groups， SDDP-Ⅲ medium-dose and high-dose groups were decreased significantly； the number of scales with granular layer was increased significantly， and above indexes of SDDP-Ⅲ medium-dose and high-dose groups were significantly better than corresponding DDP-Ⅲ group （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： DDP-Ⅲ contains five monosaccharide components such as mannose， etc. Both DDP-Ⅲ and SDDP-Ⅲ possess anti- psoriasis effects， and SDDP-Ⅲ exhibits stronger anti-psoriasis effect than DDP-Ⅲ. Its mechanism may be associated with inhibiting IL-23/IL-17 signaling pathway.

KEYWORDS Dictamnus dasycarpus； Polysaccharides； Sulfated modification； Psoriasis； Inflammatory factor； Signaling pathway

銀屑病是一種以T淋巴細(xì)胞異?；罨徒?rùn)為主要特征的慢性炎癥性皮膚病，目前臨床主要采用局部藥物治療、物理療法、系統(tǒng)藥物治療等方法進(jìn)行治療，上述療法雖可使大部分銀屑病患者的病情得以緩解，但仍無法根治，且存在易復(fù)發(fā)、長(zhǎng)期使用不良反應(yīng)大等缺點(diǎn)，嚴(yán)重影響患者預(yù)后[1]。

天然藥物活性成分及其衍生物具有高效、低毒、不良反應(yīng)少的特點(diǎn)，為治療銀屑病創(chuàng)新藥物的研發(fā)提供了新的契機(jī)[2]。白鮮皮為蕓香科植物白鮮（Dictamnus dasycarpus Turcz.）的干燥根皮，含多糖、生物堿、黃酮、甾體類化合物等成分，具有清熱燥濕、祛風(fēng)解毒、濕熱瘡毒之功效，可用于治療足癬、皮膚瘙癢、蕁麻疹、濕疹等皮膚病，具有較強(qiáng)的抗過敏及止癢作用[3-4]。中藥多糖具有促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等多種生物活性，且活性高低與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，可通過化學(xué)修飾來獲取活性更高、功能更強(qiáng)的多糖衍生物[5]。其中，硫酸酯化結(jié)構(gòu)修飾可顯著提高多糖促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化的活性，是目前用以提高多糖生物活性的重要手段之一[5-6]。由于白鮮皮多糖（DDP）結(jié)構(gòu)中不含硫酸基團(tuán)，故其溶解度欠佳、生物利用度低[3]。為此，本研究以白鮮皮精制多糖（DDP-Ⅲ）為對(duì)象，采用氯磺酸-吡啶法對(duì)其進(jìn)行硫酸酯化，并對(duì)DDP-Ⅲ及其衍生物的抗銀屑病作用進(jìn)行初步探討，以期為中藥多糖類抗銀屑病的研發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

FA-2004型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；DF-101S型恒溫磁力攪拌器（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；FDU-1200型冷凍干燥機(jī)、WFO-420W型定溫干燥箱（日本Eyela公司）；DL-5-B型高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；765型紫外-可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器廠）；LC-5510型高效液相色譜（HPLC）儀（北京東西分析儀器有限公司）；FTIR-8400S型紅外光譜儀（日本Shimadzu公司）；LabRAM00型拉曼光譜儀（法國Dilor公司）；Prox型掃描電鏡（荷蘭Phenom公司）；Leica DM4000B型智能生物顯微鏡（北京中顯恒業(yè)儀器儀表有限公司）；FC型酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

白鮮皮藥材（批號(hào)：170608）購于佳木斯百草堂藥店，外表面灰白色，具細(xì)縱皺紋；內(nèi)表面白色，質(zhì)脆；有羊膻氣，味微苦；性狀及外觀符合2015年版《中國藥典》（一部）[7]規(guī)定，經(jīng)佳木斯大學(xué)藥學(xué)院張宇教授鑒定為蕓香科植物白鮮（Dictamnus dasycarpus Turcz.）的干燥根皮。標(biāo)本保存于佳木斯大學(xué)藥學(xué)院（編號(hào)：171406）。

咪喹莫特乳膏（四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：101112，規(guī)格：250 mg ∶ 12.5 mg）；雷公藤多苷片（陽性對(duì)照，浙江得恩德制藥有限公司，批號(hào)：130619，規(guī)格：10 mg）；凡士林（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：140721，規(guī)格：500 g）；白細(xì)胞介素17（IL-17）、IL-23酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20180620、20180413）；DEAE-52陰離子交換纖維素（50 μm，北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司，批號(hào)：R08A9D57975）；Sephadex G-100葡聚糖凝膠（40～120 μm，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：Q13J5S8672）；MW3500透析袋（截留分子量：3 500 Da，上海源葉生物科技有限公司）；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：C1822095，純度：99.5%）；甘露糖（批號(hào)：140651-201504，純度：99.5%）、鼠李糖（批號(hào)：111683-201502，純度：99.5%）、葡萄糖醛酸（批號(hào)：140648-201804，純度：99.5%）、半乳糖醛酸（批號(hào)：111646- 201702，純度：99.5%）、葡萄糖（批號(hào)：110833-201707，純度：99.5%）、木糖（批號(hào)：111508- 201605，純度：99.5%）、半乳糖（批號(hào)：100226-201506，純度：99.5%）、阿拉伯糖（批號(hào)：111506-200202，純度：99.5%）對(duì)照品均購自中國食品藥品檢定研究院；氯磺酸（批號(hào)：201506015）、吡啶（批號(hào)：100109-201102）、無水N，N-二甲基甲酰胺（批號(hào)：20150608）均購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；硫酸鈉（批號(hào)：20141103）、三氯乙酸（批號(hào)：20170726）、氯化鋇（批號(hào)：20160911）、明膠（批號(hào)：20160119）均購自天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；蘇木精、伊紅染料（北京潤(rùn)澤康生物科技有限公司，批號(hào)分別為160706、150215）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性ICR小鼠90只，6～8周齡，體質(zhì)量18～20 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)為SYXK（黑）2013-004，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物審查批準(zhǔn)編號(hào)為DWLL20171011006]。所有小鼠均常規(guī)飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物室。

2 方法與結(jié)果

2.1 DDP的提取與精制純化

2.1.1 DDP的提取 取干燥白鮮皮藥材1.0 kg，用4倍量（kg/L）的95%乙醇回流提取，用紗布濾過，除去部分小分子化合物和脂肪油；藥渣陰干后用8倍量（kg/L）的水回流提取3次，用絹布濾過；合并濾液，減壓濃縮，加入乙醇使其終體積分?jǐn)?shù)為80%，于4 ℃靜置24 h后，以 3 500 r/min離心20 min，收集沉淀；采用Sevage法[8]除去蛋白后，冷凍干燥，即得DDP，得率為14.3%（即DDP與白鮮皮藥材的質(zhì)量百分比）。

2.1.2 DDP-Ⅲ的分離與純化 取“2.1.1”項(xiàng)下DDP 10 g，經(jīng)DEAE-52陰離子交換纖維素柱，依次用水及0.1、0.3、0.5、0.7 mol/L氯化鈉溶液以1 mL/min的流速進(jìn)行梯度洗脫，每梯度收集30管，每管10 mL。采用硫酸苯酚法[9]以紫外-可見分光光度計(jì)于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每管吸光度（A490 nm）。以各管編號(hào)為橫坐標(biāo)、A490 nm值為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線（見圖1A）。合并同梯度洗脫液，經(jīng)減壓濃縮、透析脫鹽、冷凍干燥后，得兩個(gè)組分即DDP-Ⅰ（水洗脫部分）和DDP-Ⅱ（0.3 mol/L氯化鈉溶液洗脫部分），得率分別為43.6%和12.2%（即DDP-Ⅰ、DDP-Ⅱ與DDP的質(zhì)量百分比）。

取收率較高的DDP-Ⅰ適量，經(jīng)Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱，用水以0.5 mL/min的流速洗脫，自動(dòng)收集洗脫液，每管10 mL。按上述硫酸苯酚法[9]檢測(cè)每管的A490 nm值，并同法繪制洗脫曲線（見圖1B）。合并A490 nm值較高的洗脫液，經(jīng)減壓濃縮、透析、冷凍干燥后，得DDP-Ⅲ，得率為56.4%（即DDP-Ⅲ與DDP-Ⅰ的質(zhì)量百分比）。

2.2 柱前衍生化HPLC法測(cè)定DDP-Ⅲ單糖組分的含量

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.7）-乙腈（83 ∶ 17，V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 混合單糖對(duì)照品及其衍生化樣品溶液的制備 精密稱取甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖對(duì)照品各適量，置于同一量瓶中，加水稀釋，制成濃度均約為1 mmol/L的混合單糖對(duì)照品溶液。精密吸取上述混合單糖對(duì)照品溶液400 μL，置于10 mL試管中，依次加入0.5 mol/L PMP-甲醇溶液600 μL、0.3 mol/L氫氧化鈉溶液300 μL，渦旋混合2 min，于70 ℃水浴中反應(yīng)60 min，冷卻至室溫。隨后加入0.3 mol/L鹽酸溶液300 μL中和，用等體積氯仿重復(fù)萃取3次，合并上層水相，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過后，取續(xù)濾液適量，即得混合單糖衍生化樣品溶液，備用[10]。

2.2.3 DDP-Ⅲ衍生化樣品溶液的制備 精密稱取“2.1.2”項(xiàng)下DDP-Ⅲ 10 mg，置于安瓿中，加入2 mol/L三氟乙酸溶液2 mL，充入氮?dú)夂蠓夤?，?20 ℃水解6 h；減壓蒸餾除去剩余三氟乙酸，加水2 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化反應(yīng)，即得DDP-Ⅲ衍生化樣品溶液，備用。

2.2.4 空白對(duì)照溶液的制備 以400 μL水代替混合單糖對(duì)照品溶液按“2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化，即得空白對(duì)照溶液，備用。

2.2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取“2.2.2”“2.2.3”“2.2.4”項(xiàng)下各樣品溶液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見圖2。由圖2可知，DDP-Ⅲ由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖等5種單糖組成，其理論板數(shù)均大于6 000，保留時(shí)間分別約為13、16、19、23、28 min，分離度均良好。

2.2.6 線性關(guān)系考察 取“2.2.2”項(xiàng)下經(jīng)處理的混合單糖衍生化樣品溶液適量，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣10、15、20、25、30、50 μL，記錄峰面積。以各待測(cè)物的濃度為橫坐標(biāo)（x，mmol/L）、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，詳見表1。

2.2.7 定量限與檢測(cè)限考察 取“2.2.2”項(xiàng)下經(jīng)處理的混合單糖衍生化樣品溶液適量，用水為溶劑倍比稀釋，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以信噪比分別為10 ∶ 1、3 ∶ 1計(jì)算定量限、檢測(cè)限。結(jié)果，甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖的定量限分別為0.016 8、0.025 1、0.026 6、0.018 9、0.031 6、0.028 7、0.019 3、0.030 2 mmol/L，檢測(cè)限分別為0.005 8、0.006 3、0.007 6、0.007 6、0.006 6、0.008 7、0.007 3、0.009 6 mmol/L。

2.2.8 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下經(jīng)處理的混合單糖衍生化樣品溶液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面積的RSD分別為0.15%、0.21%、0.26%、0.18%、0.31%、0.19%、0.28%、0.42%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下DDP-Ⅲ衍生化樣品溶液適量，分別于室溫下放置0、4、8、12、16、24 h時(shí)按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖峰面積的RSD分別為1.89%、2.01%、1.56%、2.19%、1.31%（n=6），表明其在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.10 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取DDP-Ⅲ，共6份，每份約10 mg，按“2.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化處理后，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖峰面積的RSD分別為0.79%、1.08%、0.56%、1.09%、0.81%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.11 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取DDP-Ⅲ，共 6份，每份約10 mg，加入已知質(zhì)量濃度的混合單糖對(duì)照品溶液各適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化處理后，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖的平均加樣回收率分別為99.39%、98.56%、99.13%、99.71%、98.76%、98.94%、99.27%、99.82%，RSD分別為1.79%、1.38%、1.56%、1.49%、0.83%、1.75%、1.55%、0.87%（n=6），表明本方法準(zhǔn)確度較高。

2.3 硫酸酯化白鮮皮多糖（SDDP-Ⅲ）的制備

在干燥三頸瓶中加入無水吡啶10 mL，置于冰浴中，在磁力攪拌條件下緩慢加入氯磺酸2.5 mL，制得淡黃色固體酯化試劑（共12.5 mL），于-20 ℃冷凍保存，備用。精密稱取“2.1.2”項(xiàng)下DDP-Ⅲ 200 mg，于無水N，N-二甲基甲酰胺30 mL中溶解后加至上述酯化試劑中，在磁力攪拌條件下于60 ℃反應(yīng)3 h；反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，用4 mol/L氫氧化鈉調(diào)至中性，用4倍體積無水乙醇醇沉24 h；以4 000 r/min離心15 min，收集沉淀，加水適量，于透析袋中透析72 h后，冷凍干燥，即得SDDP-Ⅲ，得率為103.6%（即SDDP-Ⅲ與DDP-Ⅲ的質(zhì)量百分比）[11]。

2.4 氯化鋇-明膠濁度法測(cè)定SDDP-Ⅲ的含量

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密移取1.0 mg/mL硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（以水配制）0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL于試管中，分別用1 mol/L鹽酸溶液補(bǔ)至5 mL，加入0.8%三氯乙酸溶液3.5 mL及氯化鋇-明膠溶液（含氯化鋇1.0%、明膠5.0%，以水配制）1.5 mL，搖勻，靜置15 min。以1 mmol/L鹽酸5 mL作為空白，用紫外-可見分光光度計(jì)于360 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A360 nm值，以硫酸根質(zhì)量濃度（x，mg/mL）為橫坐標(biāo)、A360 nm值為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸[12]。精密稱取“2.3”項(xiàng)下SDDP-Ⅲ 10 mg，置于10 mL量瓶中，加入1 mol/L鹽酸溶液至刻度后水解；取該水解液5 mL，按上述方法處理后，測(cè)定A360 nm值，代入硫酸根回歸方程，計(jì)算SDDP-Ⅲ中硫酸根的含量，并換算其取代度（DS）[DS=1.62S%/（32-1.02S%）；式中，S%為樣本中硫酸根的質(zhì)量分?jǐn)?shù)]。結(jié)果，硫酸根回歸方程為y=3.792 8x+0.018 9（R2=0.997 5），硫酸根檢測(cè)濃度的線性范圍為0.05～0.4 mg/mL；SDDP-Ⅲ中硫酸根的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.11%，DS為0.65。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取“2.4.1”項(xiàng)下硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0 mg/mL）6份，每份2.0 mL，按“2.4.1”項(xiàng)下方法處理后于360 nm波長(zhǎng)處連續(xù)測(cè)定6次，記錄A360 nm值。結(jié)果，上述樣品A360 nm值的RSD為0.23%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.4.1”項(xiàng)下SDDP-Ⅲ水解液分別于室溫放置0、4、8、12、16、24 h時(shí)量取2.5 mL，同法處理后于360 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A360 nm值。結(jié)果，上述樣品A360 nm值的RSD為0.23%（n=6），表明上述水解液于24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.4.1”項(xiàng)下SDDP-Ⅲ水解液6份，每份2.5 mL，同法處理后于360 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A360 nm值。結(jié)果，上述樣品A360 nm值的RSD為0.34%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取“2.3”項(xiàng)下SDDP-Ⅲ 9份，每份約10 mg，置于10 mL量瓶中，分別加入1 mol/L鹽酸溶液至刻度后水解。取水解液2.5 mL，分別加入硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、2.0、3.0 mL（各3份），同法處理后于360 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A360 nm值，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，上述樣品的平均加樣回收率分別為97.6%、96.8%、98.3%，RSD分別為1.58%、1.93%、1.36%（n=3），表明本方法準(zhǔn)確度較高。

2.5 DDP-Ⅲ與SDDP-Ⅲ的結(jié)構(gòu)表征

2.5.1 紅外光譜分析 精密稱取DDP-Ⅲ和SDDP-Ⅲ各5.0 mg，與干燥溴化鉀粉末200 mg混勻、研磨、壓片后，使用紅外光譜儀進(jìn)行紅外光譜掃描，掃描范圍為500～4 000 cm-1。結(jié)果，DDP-Ⅲ在3 406 cm-1處有O-H伸縮振動(dòng)吸收峰，在2 929 cm-1處有C-H伸縮振動(dòng)吸收峰，在1 635 cm-1處有C=O伸縮振動(dòng)吸收峰，在1 425、1 321 cm-1處有C-H變角振動(dòng)吸收峰，在1 093 cm-1處有吡喃糖環(huán)C-O-H伸縮振動(dòng)吸收峰，詳見圖3A。上述特征吸收峰均表明DDP-Ⅲ為多糖化合物。而SDDP-Ⅲ除在3 439、2 952、1 637、1 020 cm-1處有DDP-Ⅲ母體特征吸收峰外，還在1 255 cm-1處出現(xiàn)硫酸根的S=O伸縮振動(dòng)吸收峰，在823 cm-1處出現(xiàn)了C-O-S拉伸振動(dòng)吸收峰，詳見圖3B。這表明硫酸基以酯鍵的形式連接在DDP-Ⅲ分子上，提示DDP-Ⅲ酯化成功。

2.5.2 拉曼光譜分析 精密稱取DDP-Ⅲ和SDDP-Ⅲ各5.0 mg，使用拉曼光譜儀進(jìn)行拉曼光譜分析。激發(fā)光源為氦氖（He-Ne）激光，激發(fā)波長(zhǎng)為1 064 nm，每10 s積分1次；拉曼數(shù)據(jù)采集范圍為500～3 500 cm-1。結(jié)果，DDP-Ⅲ在2 920 cm-1處有C-H伸縮振動(dòng)吸收峰，在1 620 cm-1處有C=O伸縮振動(dòng)吸收峰，在1 075 cm-1有C-O伸縮振動(dòng)吸收峰，詳見圖4A。上述特征吸收峰均表明DDP-Ⅲ為多糖化合物。而SDDP-Ⅲ在2 915 cm-1處有C-H伸縮振動(dòng)吸收峰，在1 617 cm-1處有C=O伸縮振動(dòng)吸收峰，在1 240 cm-1處有S=O伸縮振動(dòng)吸收峰，在815 cm-1處有C-O-SO3H基團(tuán)的特征吸收峰，且硫酸基在糖的C2或C3位上取代，詳見圖4B。上述特征吸收峰均表明SDDP-Ⅲ為含有硫酸基團(tuán)的多糖硫酸酯類化合物。

2.5.3 掃描電鏡分析 稱取DDP-Ⅲ與SDDP-Ⅲ適量，使用掃描電鏡分析兩者形態(tài)結(jié)構(gòu)，加速電壓為15 kV。結(jié)果，DDP-Ⅲ與SDDP-Ⅲ表面立體形態(tài)存在顯著差異：DDP-Ⅲ呈片狀，表面光滑、平整，排列緊密；SDDP-Ⅲ呈塊狀或顆粒狀，具有孔洞結(jié)構(gòu)，且排列較疏松，提示其空間結(jié)構(gòu)已發(fā)生明顯改變，詳見圖5。

2.6 DDP-Ⅲ與SDDP-Ⅲ抗銀屑病作用考察

2.6.1 分組、造模與給藥 所有小鼠背部脫毛后隨機(jī)分為9組，即正常組、模型組（咪喹莫特）、陽性組（雷公藤多苷20 mg/kg，以水為溶劑；參考本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果并按體表面積法換算而得，與70 kg成人等效劑量相同[13]）以及DDP-Ⅲ和SDDP-Ⅲ低、中、高劑量組（均分別為56、112、224 mg/kg，按DDP-Ⅲ、SDDP-Ⅲ質(zhì)量計(jì)，以水為溶劑；根據(jù)70 kg成人等效劑量的0.5、1、2倍換算而得[14]），每組10只。除正常組小鼠涂抹凡士林外，其余各組小鼠均按50 mg/cm2劑量涂抹咪喹莫特乳膏，每日1次，連續(xù)14 d，復(fù)制銀屑病模型。與此同時(shí)，各給藥組小鼠均灌胃相應(yīng)藥物溶液0.4 mL，正常組和模型組小鼠均灌胃等體積水，每日1次，連續(xù)14 d。

2.6.2 小鼠血清IL-17、IL-23含量測(cè)定 小鼠末次給藥2 h后，于眼部取血適量，以4 000 r/min離心15 min，取上層血清，采用ELISA法以酶標(biāo)儀檢測(cè)各組小鼠血清中IL-17和IL-23含量，嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書操作。使用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠血清IL-17、IL-23含量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，陽性組、DDP-Ⅲ高劑量組以及SDDP-Ⅲ中、高劑量組小鼠血清IL-17、IL-23含量均顯著降低，且SDDP-Ⅲ中、高劑量組均顯著低于DDP-Ⅲ同劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見表2。

結(jié)果顯示，正常組小鼠皮膚表皮較薄、未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，顆粒層密集。與正常組比較，模型組小鼠皮損表皮明顯增厚，表皮內(nèi)炎癥細(xì)胞數(shù)量明顯增多，顆粒層明顯減少；其有顆粒層鱗片數(shù)顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組小鼠皮損表皮均有不同程度的改善，顆粒層有所增加；陽性組、DDP-Ⅲ高劑量組以及SDDP-Ⅲ中、高劑量組小鼠有顆粒層鱗片數(shù)均顯著增加，且SDDP-Ⅲ中、高劑量組均顯著多于DDP-Ⅲ同劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見圖6（圖中箭頭處即為“顆粒層”）、表2。

3 討論

DDP具有良好的抗氧化及免疫調(diào)節(jié)作用，但其水溶性欠佳阻礙了其生物活性的發(fā)揮，因此對(duì)DDP進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，對(duì)提高其水溶性和生物利用度具有重要意義。硫酸酯化是較為常見的多糖結(jié)構(gòu)修飾方式之一，多糖經(jīng)硫酸酯化后，其糖鏈連接方式發(fā)生了改變，糖鏈排列會(huì)更加有序，其結(jié)構(gòu)的優(yōu)化可顯著提高多糖的水溶性，并提高其與細(xì)胞膜受體蛋白的親和性，最終提高其生物利用度[15]?；诖?，本研究對(duì)DDP進(jìn)行精制，并對(duì)精制品DDP-Ⅲ進(jìn)行硫酸酯化修飾后制得SDDP-Ⅲ。在考察其結(jié)構(gòu)變化的基礎(chǔ)上，觀察并比較了DDP-Ⅲ和SDDP-Ⅲ抗銀屑病的作用，以期為后續(xù)研究提供參考。

本研究采用水提醇沉法分離DDP后，通過DEAE-52陰離子交換纖維素柱分離純化得到DDP-Ⅰ和DDP-Ⅱ（得率分別為43.6%、12.2%）；其中DDP-Ⅰ經(jīng)Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱分離純化得DDP-Ⅲ（得率為56.4%）。隨后，本研究采用柱前衍生化HPLC法對(duì)DDP-Ⅲ的組成進(jìn)行了初步分析。由于多糖缺少共軛結(jié)構(gòu)，在紫外下無特征吸收，因此需要對(duì)其進(jìn)行PMP衍生化，以提高其紫外吸收。結(jié)果顯示，DDP-Ⅲ主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖等5種單糖組成。

為提高DDP的生物利用度，本研究對(duì)DDP-Ⅲ進(jìn)行硫酸酯化結(jié)構(gòu)修飾，制得SDDP-Ⅲ（得率為103.6%），DS為0.65。硫酸酯化反應(yīng)中的關(guān)鍵因素為酯化制劑的比例和反應(yīng)時(shí)間：酯化試劑過多或反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)均可導(dǎo)致多糖水解程度過高，使得原有結(jié)構(gòu)受到破壞；反之則會(huì)導(dǎo)致硫酸酯化反應(yīng)不完全[16]。本研究結(jié)合前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將酯化試劑的加入量確定為12.5 mL（無水吡啶10 mL+氯磺酸2.5 mL），反應(yīng)時(shí)間確定為3 h。然后采用紅外、拉曼光譜及掃描電鏡對(duì)DDP-Ⅲ、SDDP-Ⅲ的結(jié)構(gòu)表征進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，除與DDP-Ⅲ有相似的特征吸收峰外，SDDP-Ⅲ分別在1 255、823 cm-1（紅外光譜）處出現(xiàn)了S=O伸縮振動(dòng)吸收峰和C-O-S拉伸振動(dòng)吸收峰，在1 240、815 cm-1（拉曼光譜）處出現(xiàn)了S=O伸縮振動(dòng)吸收峰和C-O-SO3H基團(tuán)的特征吸收峰。此外，掃描電鏡顯示，經(jīng)硫酸酯化后，DDP-Ⅲ結(jié)構(gòu)由光滑的片狀結(jié)構(gòu)變?yōu)榫哂锌锥吹膲K狀顆粒結(jié)構(gòu)。這提示，DDP-Ⅲ經(jīng)硫酸酯化修飾后，分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變。筆者分析可能是-O-SO3H基團(tuán)可與糖環(huán)中的—OH形成分子間或分子內(nèi)氫鍵，改變糖分子的鏈接方式；同時(shí)在酸性條件下，糖分子中糖苷鍵更易斷裂，且硫酸基的引入會(huì)導(dǎo)致正負(fù)電荷相互吸引并聚集成團(tuán)，因此形成具有孔洞的塊狀顆粒結(jié)構(gòu)[17]。

銀屑病的臨床癥狀為大小不一的紅色斑塊，且表面覆蓋多層銀白色鱗屑并伴有不同程度的瘙癢，患者在發(fā)病過程中會(huì)出現(xiàn)表皮顆粒層減少、過度增殖、角質(zhì)化不全以及真皮淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等病理現(xiàn)象。目前銀屑病的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但普遍認(rèn)為與IL-23/IL-17信號(hào)通路有關(guān)[18]。初始T細(xì)胞在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）和IL-6的共同作用下促使CD4+效應(yīng)T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，并促進(jìn)IL-23受體的表達(dá)，IL-23與其受體結(jié)合后激活下游非受體酪氨酸蛋白激酶（JAKs），并使受體胞內(nèi)區(qū)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）結(jié)合位點(diǎn)磷酸化，磷酸化的STAT3二聚體入核，誘導(dǎo)下游靶基因（IL-17A、IL-17F、IL-22）mRNA的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)；IL-17A、IL-17F、IL-22可募集及活化中性粒細(xì)胞，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞角質(zhì)層異常增殖，最終導(dǎo)致銀屑病的發(fā)生[19-20]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，陽性組、DDP-Ⅲ高劑量組以及SDDP-Ⅲ中、高劑量組小鼠血清IL-17、IL-23含量均顯著降低，皮膚有顆粒層鱗片數(shù)均顯著上升，且SDDP-Ⅲ中、高劑量組上述指標(biāo)均顯著優(yōu)于DDP-Ⅲ同劑量組。這提示DDP-Ⅲ和SDDP-Ⅲ均具有不同程度的抗銀屑病作用，且SDDP-Ⅲ的作用更強(qiáng)。筆者分析兩者抗銀屑病作用的發(fā)揮可能與抑制IL-23/IL-17信號(hào)通路有關(guān)。此外，由于SDDP-Ⅲ中的-O-SO3H的親水性比DDP-Ⅲ中的-OH更強(qiáng)，且具有孔洞結(jié)構(gòu)，使得SDDP-Ⅲ的親水性得以提高，與相關(guān)信號(hào)因子的接觸面積得以增大，從而使其更易通過細(xì)胞膜的磷脂雙分子層以發(fā)揮抗銀屑病作用[21]。

綜上所述，DDP-Ⅲ和SDDP-Ⅲ均具有一定的抗銀屑病作用，且經(jīng)硫酸酯化修飾后的SDDP-Ⅲ的作用更強(qiáng)，其機(jī)制可能與抑制IL-23/IL-17信號(hào)通路有關(guān)。但其具體構(gòu)效關(guān)系以及對(duì)IL-23/IL-17信號(hào)通路的上游信號(hào)和下游炎癥因子表達(dá)的影響仍有待后續(xù)深入研究。

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（收稿日期：2018-07-29 修回日期：2018-12-14）

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