超聲對亞麻籽蛋白穩(wěn)定的水包油乳液理化性質(zhì)的影響

徐珍霞 鄧乾春 董緒燕 楊陳 魏芳 陳洪 黃鳳洪 呂昕

摘?要：亞麻籽蛋白（flaxseed protein isolate，F(xiàn)PI）作為植物來源的優(yōu)質(zhì)蛋白，具有良好的乳化能力。本研究采用堿溶酸沉法提取得到蛋白質(zhì)含量為90.8%的亞麻籽蛋白，分析不同超聲乳化條件（40%功率，超聲有效時間2、6、12、18、24、30 min）對含有大豆油的兩種不同濃度（0.5%、1.0%，w/w）的亞麻籽蛋白穩(wěn)定乳液的理化性質(zhì)及流變性能的影響，發(fā)現(xiàn)在超聲乳化30 min后乳液具有較小液滴尺寸，乳液的絕對Zeta（ζ）-電位值最高，顯示出最佳的粘彈性。同時，相比低濃度蛋白乳液，高濃度蛋白穩(wěn)定乳液顯示出良好的液滴尺寸分布特征和更好的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，超聲乳化處理30 min可明顯提高乳液的穩(wěn)定性及凝膠性。

關(guān)鍵詞：超聲;亞麻籽蛋白;乳液;理化性質(zhì)

乳液是兩種不相混溶的液相的非均相混合物，包括水包油（O / W）、油包水（W / O）或多重乳液（O / W / O或W / O / W）三種類型[1]，廣泛應(yīng)用于制藥[2]、化妝品工業(yè)[3]、農(nóng)業(yè)[4]和食品行業(yè)[5]中。作為一種熱力學(xué)穩(wěn)定體系，O / W乳液可以改善油溶性物質(zhì)的水溶性，促進(jìn)油脂的消化吸收，保護(hù)功能性物質(zhì)的生物活性，并保證物質(zhì)的儲藏穩(wěn)定性等[6]。目前，制備O / W乳液的研究方法之一是超聲乳化技術(shù)，其主要是通過聲空化現(xiàn)象，增強生物聚合物的功能特性，產(chǎn)生穩(wěn)定的乳液[7-8]。Taha等[9]通過高強度超聲處理制備出大豆分離蛋白穩(wěn)定的乳液，證實超聲是一種有用的乳化技術(shù)。同樣，Yao等[10]發(fā)現(xiàn)，超聲處理可有效提高肌原纖維蛋白-黃原膠乳液的穩(wěn)定性，但未改變該復(fù)合物的官能團(tuán)。蛋白質(zhì)因其兩親性而適用作乳化劑，有利于乳液的形成[11]。其中，F(xiàn)PI不僅具有與大豆蛋白相當(dāng)?shù)陌被嶙V和營養(yǎng)價值，而且具有良好的乳化活性、熱穩(wěn)定性及高持油性等功能特性，其濃縮物具有高表面電荷，更利于形成穩(wěn)定乳液體系[12-13]。Pham等[14]發(fā)現(xiàn)，與亞麻籽蛋白-酚類絡(luò)合物穩(wěn)定的乳液相比，具有高表面電荷密度的FPI穩(wěn)定的乳液顯示出更高的物理穩(wěn)定性，說明FPI具有作為天然乳化劑的潛力。本研究以大豆油作為油相，通過超聲乳化技術(shù)制備FPI穩(wěn)定的O / W乳液，研究不同超聲處理時間及兩種FPI濃度對乳液理化性質(zhì)的影響，并對乳液流變性能進(jìn)行分析，為亞麻籽蛋白穩(wěn)定乳液應(yīng)用于食品及其他工業(yè)提供技術(shù)支持。

1?材料與方法

1.1?材料與儀器

1.1.1?材料?亞麻仁，大同市福瑞康鑫科技有限責(zé)任公司;大豆油，購自當(dāng)?shù)爻?尼羅紅染料，上海源葉生物科技有限公司;正己烷、乙醇、鹽酸、氫氧化鈉等均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2?儀器?GAMMA 1-16 LSC冷凍干燥機，德國Martin Christ公司;Kjeltec TM 2300全自動凱氏定氮儀，德國福斯公司;T25高速剪切機，德國IKA公司;Nano DeBEE實驗型超高壓均質(zhì)機，美國DeBEE國際有限公司;JY92-ⅡDN超聲波細(xì)胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司;Mastersizer 2000粒度分析儀，英國馬爾文儀器有限公司;Zetasizer Nano ZS納米粒度及Zeta電位分析儀，英國馬爾文儀器有限公司;Nikon A1共聚焦激光掃描顯微鏡，日本尼康公司;DHR-2流變儀;美國TA儀器有限公司。

1.2?方法

1.2.1?亞麻籽蛋白的提取與組分分析?以脫殼并經(jīng)粉碎的亞麻籽仁為原料，將其與蒸餾水以1∶25的質(zhì)量比混合溶解，用1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為9.5，在60℃下水浴攪拌60 min后，以4 000 r/min離心30 min，得到的上清液用1mol/L HCl調(diào)節(jié)其pH為4.4，然后以4 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心1 h，棄去上清液，對得到的沉淀進(jìn)行冷凍干燥并經(jīng)研磨粉碎，即可得到FPI，儲存于4℃?zhèn)溆?。之后，采用凱氏定氮法測定所得FPI的蛋白含量（%N×6.25）。

1.2.2?乳液的制備?將蛋白質(zhì)含量為90.8%的FPI粉末分散在Tris緩沖液（0.1mol/L pH 8.4）中，在室溫下以500 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌16 h，并在40℃攪拌1 h以溶解蛋白質(zhì)，制得FPI儲備溶液（0.5%或1%，w/w）。將一定質(zhì)量的大豆油加入到FPI溶液中（w/w=1∶10），乳液分兩步制備。首先，使用磁力攪拌器在環(huán)境溫度（25℃）下制備預(yù)粗乳液（2 500 r/min，30 min）。其次，將預(yù)粗乳液用高速剪切機在10 000 r/min下預(yù)均化2 min。再使用超聲細(xì)胞破碎儀制備乳液，將40 mL粗乳液于超聲幅度40%，脈沖持續(xù)時間為導(dǎo)通時間2 s和關(guān)斷時間2 s的條件下，將樣品超聲處理2、6、12、18、24、30 min（其為有效處理時間，省略脈沖時間）制備乳液。同時，通過高壓均質(zhì)機將其在10 000 Psi的壓力水平下均質(zhì)以制備對照樣品。

1.2.3?粒徑分析?在制備乳液后立即使用Mastersizer 2000納米粒度儀設(shè)備測定乳液的粒徑。泵速和遮蔽率分別設(shè)定為2 000 r/min和10%～15%。其中，分散介質(zhì)的折射率為1.330，大豆油的折射率為1.472。乳液的粒度用粒度分布（PSD）、體積平均粒徑（d-4，3）和表面平均粒徑（d-3，2）表示。

1.2.4?Zeta（ζ）電位測量?使用Milli-Q水將乳液稀釋100倍，然后使用DTS-7010電位槽，在25℃通過Malvern Zetasizer Nano ZS（ZEN 3600）分析儀測量乳液的ζ-電位值。

1.2.5?乳液穩(wěn)定性?將玻璃管中的新鮮乳液（20 mL）放置在室溫黑暗環(huán)境中，在1、7、14d后觀察乳液是否有分層或絮凝現(xiàn)象產(chǎn)生。

1.2.6?共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）?使用尼康A(chǔ)1激光共聚焦顯微鏡觀察新鮮乳液的形態(tài)以獲得CLSM圖像。使用尼羅紅（以0.1% w/v的濃度溶解于乙醇中）用于油相染色，將40 μL上述染料加入到2 mL乳液中混合均勻后進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)觀察。激發(fā)波長為 488～530 nm，發(fā)射波長在575～580 nm之間。

1.2.7?流變測量

（1）應(yīng)力掃描：使用具有鋁平行板（直徑40 mm、間隙1 mm）的DHR-2流變儀進(jìn)行流變學(xué)測量。通過在1 HZ下進(jìn)行的應(yīng)變掃描測試，確定每個樣品的線性粘彈性區(qū)域。在線性粘彈性區(qū)域內(nèi)測量樣品的粘彈性（儲能模量G、損耗模量G″）。（2）頻率掃描：頻率掃描測試在25℃下，0.1～100 rad/s的角頻率范圍內(nèi)進(jìn)行。選擇頻率掃描測試的應(yīng)變幅度為0.05%。（3）剪切速率掃描：穩(wěn)定剪切試驗在25℃下，1～100/s的剪切速率范圍內(nèi)進(jìn)行，以測量乳液的表觀粘度。

1.3?數(shù)據(jù)處理

試驗處理重復(fù)3次，采用Excel 2007及OriginPro 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和圖表繪制。試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2?結(jié)果與分析

2.1?乳液粒徑測量

圖1顯示，對于兩種濃度蛋白質(zhì)（0.5%、1%，w/w）穩(wěn)定的大豆油乳液，超聲處理能顯著降低液滴尺寸，隨超聲作用時間的延長，乳液的粒徑隨之減小。例如，從附表可以看出，對于蛋白質(zhì)濃度為0.5%的乳液，相比均質(zhì)處理，有效超聲破碎30 min后，大豆油乳液的粒徑從50.12±2.30 μm（H樣品）降低至4.66±0.02 μm（S30樣品），這些結(jié)果可能是由于聲空化氣泡的產(chǎn)生加劇了油滴的破壞過程[15]。另外，蛋白質(zhì)濃度對乳液粒徑有很大影響，對比兩種蛋白濃度的乳液可發(fā)現(xiàn)，相比高濃度蛋白形成的乳液，低FPI濃度的乳液具有更大的液滴尺寸，原因可能是高濃度FPI作為乳化劑能更好地形成水包油乳液體系，該結(jié)果與Felix等[16]發(fā)現(xiàn)高濃度鷹嘴豆蛋白穩(wěn)定的乳液具有較小液滴尺寸一致。

2.2?Zeta（ζ）電位分析

Zeta電位的絕對值越大說明分散體系越穩(wěn)定，可根據(jù)它們的值來評估乳液的穩(wěn)定性。如圖2所示，觀察到所有樣品都具有負(fù)ζ電位值，這可能是由于FPI分子在pH值高于其等電點時帶負(fù)電荷。對于蛋白質(zhì)濃度為1%的乳液，超聲處理后ζ-電位的絕對值顯著增加，表明超聲處理可將更多的負(fù)氨基酸暴露于FPI分子表面，乳液表面攜帶更多的負(fù)電荷，液滴之間的排斥力增加，乳液液滴的粒徑相對更小，與粒徑分析結(jié)果一致。而對于FPI濃度為0.5%的乳液，超聲處理后乳液的ζ-電位絕值相差不大。而且，在同樣處理條件下，蛋白質(zhì)濃度為1%的乳液的ζ-電位值高于FPI濃度為0.5%的乳液，說明高濃度蛋白制備的乳液穩(wěn)定性更好。

2.3?乳液穩(wěn)定性

放置不同時間后乳液的表觀圖像表明，乳液主要是發(fā)生了乳化作用從而產(chǎn)生分層現(xiàn)象，而乳化是由于重力分離。可以觀察到超聲處理的樣品較均質(zhì)化樣品穩(wěn)定性更好，表明超聲產(chǎn)生更穩(wěn)定的乳液。隨著超聲時間的增加，F(xiàn)PI乳液的穩(wěn)定性增加。原因可能有兩點：一是較長的超聲作用可以顯著降低油滴的大小，提高蛋白質(zhì)的溶解度，從而促進(jìn)FPI分子向油/水界面的運動;二是超聲可使蛋白質(zhì)展開并將疏水基團(tuán)暴露在表面，從而促進(jìn)油膜上FPI水界面的形成，形成穩(wěn)定的水包油體系[17]。

2.4?共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）

不同濃度蛋白質(zhì)穩(wěn)定的乳液經(jīng)均質(zhì)和有效超聲處理2、12、30 min后的共聚焦激光顯微照片表明，大豆油用尼羅紅染色后于激發(fā)/發(fā)射波長=488～530/575～580 nm處進(jìn)行形態(tài)觀察。以蛋白質(zhì)濃度為1%的乳液為例，與均質(zhì)相比，超聲處理乳液顯示出更小的粒徑和更均勻的液滴，說明超聲處理能降低乳液粒徑并提高其分散性。在兩種蛋白質(zhì)濃度下，低濃度蛋白質(zhì)穩(wěn)定乳液顯示出更大的液滴尺寸并顯示出小規(guī)模的絮凝，說明高濃度蛋白有利于單分散乳液的形成。

2.5?流變

2.5.1?應(yīng)力掃描?以FPI濃度為1%的大豆油乳液為代表，進(jìn)行流變測量。圖3顯示了經(jīng)均質(zhì)處理和超聲30 min處理乳液在固定頻率（1Hz）下的儲能模量（G）和損耗模量（G″）的應(yīng)變依賴性。對于經(jīng)均質(zhì)處理的樣品，G在低應(yīng)變率（0.01%～5%，稱為線性粘彈性區(qū)域）下大于G″，表明樣品的彈性（固體狀）行為。然而，當(dāng)應(yīng)變速率增加到足夠高的水平（> 5%）時，G″變得大于G，從而揭示其中的粘性（液體狀）行為[18]。而對于經(jīng)超聲30 min的樣品，G和G″在低應(yīng)變率下幾乎一致，當(dāng)應(yīng)變增加到足夠高（> 5%）時，G″變得大于G，表現(xiàn)流體特征，為粘彈性液體。

2.5.2?頻率掃描?頻率掃描測試在25℃下0.1～100 rad/s的角頻率范圍內(nèi)進(jìn)行，選擇頻率掃描測試的應(yīng)變幅度為0.05%。圖4表明，對于經(jīng)均質(zhì)處理的樣品，隨著頻率的增加，模量呈現(xiàn)出增加的趨勢，G″在低頻率范圍內(nèi)大于G，揭示其粘性行為;當(dāng)頻率> 11 rad/s時，G變得大于G″，從而揭示其彈性行為。而對于經(jīng)超聲處理的樣品，隨著頻率的增加，模量呈現(xiàn)出平緩增加的趨勢，而后當(dāng)頻率達(dá)到5 rad/s時G=G″，之后G和G″均快速增加，且觀察到在掃描頻率范圍內(nèi)G大于G″，

表明在該頻率范圍內(nèi)彈性行為是顯著地，乳液體現(xiàn)出了典型的弱凝膠特性，顯示出了樣品的頻率依賴性，而乳液的粘彈性響應(yīng)通?？膳c凝膠狀結(jié)構(gòu)相關(guān)[19]，說明該乳液能夠形成相當(dāng)強的小液滴彈性凝膠網(wǎng)絡(luò)。

2.5.3?剪切速率?剪切速率測試在1～100/s的剪切速率范圍內(nèi)進(jìn)行，以測量乳液的表觀粘度。從圖5可以看出，經(jīng)均質(zhì)處理的乳液樣品，在剪切速率1～10/s的范圍內(nèi)，其粘度保持不變，隨后粘度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢;經(jīng)超聲處理的所有樣品的表觀粘度值隨著剪切速率的增加而降低，表明這些乳液樣品本質(zhì)上是剪切稀化的，為剪切變稀流體（假塑性流體）[20]。表觀粘度與剪切速率曲線表明，每種剪切速率下表觀粘度的大小隨著超聲時間的增加而增加，表明超聲時間越長乳液的凝膠性越強。但超聲處理30 min時乳液的整體粘度有所降低，原因可能是超聲強度太大破壞了乳液的結(jié)構(gòu)。

3?結(jié)論

采用超聲乳化技術(shù)制備FPI穩(wěn)定的O/W乳液，發(fā)現(xiàn)超聲30 min后，1%FPI穩(wěn)定乳液液滴分散更均一，粒徑尺寸低至6.14 μm，乳液穩(wěn)定性最好，顯示出最高的粘彈性和凝膠特性。通過比較蛋白濃度為0.5%和1.0%的乳液理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)高蛋白濃度有利于形成均一穩(wěn)定的乳液體系。

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（責(zé)任編輯?唐建敏）