超高壓處理對藍(lán)莓酚類物質(zhì)生物可獲得率及抗氧化性的影響

王鷗 周潔心 蔡圣寶 黃建

摘?要：目的：探討不同條件超高壓處理對藍(lán)莓酚類物質(zhì)的生物可獲得率以及抗氧化性的影響。方法：在不同壓力下對藍(lán)莓果實進(jìn)行不同時間的超高壓處理。分析測定不同處理條件下藍(lán)莓中酚類物質(zhì)的含量。通過測定1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和2，2-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）自由基清除能力評價超高壓處理后藍(lán)莓的抗氧化能力變化。利用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)四級桿質(zhì)譜分析鑒定藍(lán)莓中主要酚類物質(zhì)及其含量變化情況。結(jié)果：不同壓力與處理時間下，超高壓處理均能提高藍(lán)莓總酚、總黃酮和總花色苷的生物可獲得率，其中在500MPa下處理5min效果最佳。DPPH和ABTS自由基清除能力實驗結(jié)果表明，超高壓處理可以顯著提高藍(lán)莓抗氧化性，在500 MPa處理5 min的藍(lán)莓抗氧化能力最強(qiáng)。超高壓前后共鑒定出9種酚類物質(zhì)，其中7種為花色苷及其衍生物、2種類黃酮物質(zhì)，這些物質(zhì)中除了矮牽牛素外，其余物質(zhì)在超高壓處理后生物可獲得率均顯著增加。結(jié)論：超高壓處理可以顯著提高藍(lán)莓中總酚、總黃酮及花色苷等酚類物質(zhì)的生物可獲得率，增強(qiáng)其清除自由基的能力，提高抗氧化性。

關(guān)鍵詞：藍(lán)莓;超高壓;酚類物質(zhì);生物可獲得率;抗氧化性

機(jī)體需要額外的抗氧化劑的協(xié)助以及時地清除體內(nèi)過多的自由基[1-3]。自然界植物體內(nèi)含有多種具有抗氧化能力的次級代謝產(chǎn)物[4]，其中植物多酚由于其良好的抗氧化性被廣泛研究。植物廣泛分布于植物體內(nèi)，按照其結(jié)構(gòu)的差異，植物多酚可以分為酚酸類、類黃酮類、花青素類以及芪類等[5]。大量研究表明，植物多酚不論在體內(nèi)還是體外均表現(xiàn)出非常優(yōu)異的抗氧化能力[6]。另外，植物多酚可以預(yù)防和改善多種人體疾病，特別是一些退行性疾病，并認(rèn)為植物多酚的這些生物活性與其良好的抗氧化性有關(guān)[7]。然而在植物體內(nèi)，許多植物多酚與多種大分子結(jié)合或者被細(xì)胞壁等大分子阻擋，從而導(dǎo)致其生物可獲得率往往較低，而植物多酚的生物可獲得率是其發(fā)揮生物活性的基礎(chǔ)，因此，研究者一直在探討如何提高植物體內(nèi)多酚的生物可獲得率。目前常用的方法是發(fā)酵、酶預(yù)處理以及氣爆等，這些方法均能一定程度提高植物體內(nèi)多酚的生物可獲得率[8]。此外，超高壓是一種食品加工新技術(shù)，主要用于食品保鮮等非熱加工方面。但也有研究發(fā)現(xiàn)，食品原料經(jīng)超高壓加工后，其生物活性成分的生物可獲得率得到了顯著提高[9]。因此，現(xiàn)有研究開始探討超高壓在提高食品功能活性成分的生物可獲得率方面的進(jìn)一步應(yīng)用。

藍(lán)莓中的植物多酚賦予了藍(lán)莓多種功能活性，如抗氧化、預(yù)防非酒精性脂肪以及預(yù)防心血管疾病等[10]，然而，目前關(guān)于超高壓處理對藍(lán)莓多酚生物可獲得率及抗氧化性的影響研究卻少見報道。因此，本研究利用超高壓技術(shù)對新鮮藍(lán)莓進(jìn)行處理，探討不同壓力和處理時間對藍(lán)莓中多酚的生物可獲得率及其抗氧化性的影響。

1?材料與方法

1.1?材料與設(shè)備

藍(lán)莓鮮果，云南省昆明市嵩明縣高山藍(lán)莓莊園，果實均勻飽滿，無爛果和雜果;沒食子酸、蘆丁等對照品，成都曼斯特生物科技有限公司，純度均在99%以上;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）和2，2-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司;色譜級甲醇、乙腈，德國Merck試劑公司;分析純甲醇、甲酸、乙醇等試劑，國藥集團(tuán)。HPP600MPa/3-5L超高壓處理設(shè)備，包頭科發(fā)高壓科技有限公司;SpectraMax M5型酶標(biāo)儀，美國Molecular公司;Alpha1-2LD plus型真空凍干機(jī)，德國Christ公司;Ultimate 3000-Q-Exactive Orbitrap mass液質(zhì)聯(lián)用設(shè)備，德國Thermo Fisher公司。

1.2?方法

1.2.1?超高壓處理?藍(lán)莓鮮果洗凈后密封包裝，置于超高壓設(shè)備樣品室中，在不同壓力下處理不同時間。超高壓處理后的藍(lán)莓破碎后，用含1%甲酸的80%甲醇超聲提取0.5h，離心，復(fù)提1次，合并上清液待用。

1.2.2?總酚含量測定?采用福林酚法測定樣品中總酚含量[11]。取等體積樣品溶液和福林酚試劑，靜置1min后加入1.5 mL 濃度為20%的碳酸鈉溶液，定容至10.0 mL。70℃水浴10 min，冷卻至室溫后與765 nm下讀取吸光值。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，相同步驟處理，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3?黃酮含量測定?在前期報道的黃酮含量測定方法基礎(chǔ)上稍作改進(jìn)[11]。樣品用甲醇溶解并稀釋，取1mL溶液用70%乙醇定容至2.5 mL，加入0.15 mL濃度為 5% NaNO-2溶液，搖勻靜止5min。加入0.15 mL 濃度為10%的Al（NO-3）-3溶液，搖勻靜置6min，最后加入1.0 mL 濃度為1mol/L 的NaOH。用70%乙醇定容至5.0 mL，靜置30min，500 nm處測定吸光值。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，相同步驟處理，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4?花色苷含量測定?采用pH示差法測定花色苷含量[11]。1.0 mL樣品處理液分別加入至9.0 mL pH為1的KCl緩沖溶液與pH為4.5的乙酸鈉緩沖溶液中。以蒸餾水加緩沖溶液調(diào)零，分別在520、700 nm處測定吸光值，計算花色苷含量。

1.2.5?抗氧化測定方法

（1）DPPH自由基清除能力測定[12]：配制濃度為1 mmol/L的DPPH-甲醇儲備液，使用時甲醇稀釋10倍作為反應(yīng)液。取1.0 mL 樣品甲醇稀釋液加入2.0 mL DPPH反應(yīng)液，避光振蕩30 min，于517 nm處測定吸光值。以等體積蒸餾水替代樣品做為空白對照。計算測試樣品與空白對照的吸光值差值，通過其與對照管吸光值比值計算DPPH自由基清除率。

（2）ABTS自由基清除能力測定[12]：7 mmol/L ABTS和4.9 mmol/L過硫酸鉀溶液等體積混合，室溫避光靜置12h形成ABTS儲備液。使用時儲備液用乙醇稀釋至734 nm下吸光值為0.70 ±0.02，得到ABTS反應(yīng)液。測試時，0.5 mL樣品加入2 mL ABTS反應(yīng)液，30℃水浴6min，于734nm處測定吸光值?？瞻讓φ沼玫润w積的蒸餾水代替樣品。計算空白樣品與測試樣品的吸光值差值，通過其與空白樣品吸光值的比值計算ABTS自由基清除率。

1.2.6?液相-質(zhì)譜聯(lián)用分析條件

（1）液相分離條件：Agilent ZORBAX RRHDSB-C18柱色譜（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）。柱溫35℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣量2 μL。洗脫條件：流動相A為0.5%的甲酸水，流動相B為0.5%的甲酸乙腈。分離洗脫梯度：0～2 min，10%～13% B;2～5min，13%～15% B;5～15 min，15%～20% B;15～20 min，20%～30% B;20～25 min，30%～40% B;25～28 min，40%～60% B;28～30 min，60%～10% B;30～35 min，10% B。

（2）質(zhì)譜工作條件：ESI離子源，正離子模式，ESI工作壓力為3.9 kV;毛細(xì)管溫度：300 ℃;霧化器壓力：0.207 kV;干燥器壓力：2.068 kV;干燥氣流速：12 L/min;離子掃描范圍100～1 500 m/z。

1.3?統(tǒng)計分析

利用SPSS17.0軟件進(jìn)行組間數(shù)據(jù)單因素方差分析及Tukey檢驗。以P<0.05記為差異顯著。試驗進(jìn)行3次平行，結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。

2?結(jié)果與分析

2.1?超高壓處理對藍(lán)莓酚類物質(zhì)含量的影響

如表1所示，相較于未處理組，經(jīng)過500 MPa處理10 min組的總酚含量以及300 MPa處理5 min組的總花色苷含量與未處理組相比未有顯著變化，其余處理壓力與處理時間下，均可以顯著提高藍(lán)莓中酚類物質(zhì)的生物可獲得率（P<0.05）。從總酚變化角度分析，400 MPa和500 MPa超高壓處理5 min后藍(lán)莓多酚的生物可獲得率最高 （P<0.05），分別達(dá)到26.61±1.63、27.15±1.81mg/100g，與未處理組相比分別提升了32.78%、35.48%。經(jīng)過500 MPa處理5min的藍(lán)莓，其總黃酮的生物可獲得率最高，提升為未處理組的126.61%（P<0.05）。此外，與未處理組相比，藍(lán)莓經(jīng)過500 MPa處理5 min后，其總花色苷的生物可獲得率也增加最為明顯，上升了46.10%。因此，綜合分析超高壓處理后總酚、總黃酮和總花色苷結(jié)果可知，500 MPa壓力下處理5 min對藍(lán)莓酚類物質(zhì)的生物可獲得率提高的效果最好。

2.2?超高壓處理對藍(lán)莓多酚抗氧化能力的影響

2.2.1?DPPH自由基清除能力?如表2所示，超高壓處理前后的藍(lán)莓均表現(xiàn)出DPPH自由基清除能力，并呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。同一測試濃度下，500 MPa處理后的藍(lán)莓對DPPH自由基清除力達(dá)到最高。當(dāng)500 MPa下處理5 min后，在1.39 mg/mL濃度條件下，有超過83%的DPPH自由基可以被藍(lán)莓清除掉。如表4所示，除300 MPa處理10 min外，其他所有超高壓處理組對DPPH自由基清除能力的IC-50值均顯著低于未處理組 （P<0.05），表明超高壓處理顯著提高了藍(lán)莓對DPPH自由基的清除能力。其中，500 MPa處理5 min的藍(lán)莓對DPPH自由基清除能力的IC-50值最低 （P<0.05），說明該條件處理下的藍(lán)莓對DPPH自由基清除能力最強(qiáng)。

2.2.2?ABTS自由基清除能力?如表3所示，超高壓處理前后的藍(lán)莓均表現(xiàn)出ABTS自由基清除能力，同時呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。在0.43～0.87 mg/mL測試濃度范圍內(nèi)，多數(shù)壓力處理下，處理5 min后的藍(lán)莓ABTS自由基清除能力顯著高于同一壓力下處理10 min （P<0.05）。其中，500 MPa處理5 min后，當(dāng)在0.87 mg/mL濃度條件下，藍(lán)莓對ABTS自由基的清除率近70%。如表4所示，除300 MPa下處理10 min外，其余處理條件下藍(lán)莓對ABTS自由基清除能力的IC-50值均顯著小于未處理組 （P<0.05）。與DPPH自由基清除能力結(jié)果相似，500 MPa處理5min的藍(lán)莓對ABTS自由基清除能力的IC-50值最低 （P<0.05），說明該條件處理下藍(lán)莓對ABTS自由基清除能力最強(qiáng)。

2.3?超高壓后藍(lán)莓多酚成分分析

基于上述結(jié)果分析，500 MPa處理5 min對藍(lán)莓酚類物質(zhì)的生物可獲得率提高最為顯著，因此，利用UHPLC-ESI-MS/MS對該超高壓條件處理前后藍(lán)莓的酚類物質(zhì)組成及含量變化進(jìn)行分析?？傠x子流如附圖所示，酚類物質(zhì)定性分析結(jié)果（酚類物質(zhì)名稱、保留時間、[M]+m/z以及MS/MS碎片等）如表5所示，共有9種酚類物質(zhì)被鑒定出來，其中7種花色苷及其衍生物，分別為飛燕草素-3-二葡萄糖苷（[M]+ m/z=465.102 6）、矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷（[M]+m/z =479.107 4）、矢車菊素-3-O葡萄糖苷（[M]+m/z = 449.107 4）、錦葵色素-3-O-半乳糖苷（[M]+m/z=493.133 3）、芍藥素-3-O-葡萄糖苷（[M]+m/z =463.122 7）、錦葵色素（[M]+m/z=331.080 3）以及矮牽牛素（[M]+m/z=317.065 3），其余2種分別為槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷（[M+H]+m/z=435.091 9）和槲皮素（[M+H]+m/z=303.049 6）。

如表5所示，經(jīng)過500 MPa超高壓處理5 min后，這9種酚類物質(zhì)中有8種的生物可獲得率均得到顯著提升，尤其是錦葵色素-3-O-半乳糖苷，其平均含量提升為未處理組的3倍以上，其次是芍藥素-3-O-葡萄糖苷，較未處理組提升了2.5倍。矮牽牛素在超高壓處理后的生物可獲得率并沒有顯著變化。

3?討論

超高壓作為一種新的食品加工技術(shù)除用于殺菌保鮮目的外，還可以顯著提升食品中營養(yǎng)物質(zhì)含量，特別是一些功能成分的生物可獲得率。有研究發(fā)現(xiàn)，與微波提取、熱浸提等方法相比，超高壓處理可以顯著提高藍(lán)莓多酚的提取率，同時這一方法得到的花色苷在儲存期間更為穩(wěn)定[13]。本研究通過比較不同超高壓條件處理后，藍(lán)莓總酚、總黃酮和總花色苷的變化情況可知，在相同處理壓力下，處理5 min的效果優(yōu)于處理10 min，推測其原因可能是因為超高壓處理導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)酶活發(fā)生變化，因而過長時間的處理會導(dǎo)致已釋放的酚類物質(zhì)發(fā)生一定損失[14]。另外，總體來說，在處理相同時間下，500 MPa處理的結(jié)果優(yōu)于400 MPa和300 MPa，這可能是由于較高的壓力有利于破壞藍(lán)莓細(xì)胞壁，從而有利于植物細(xì)胞中的酚類物質(zhì)更多地被釋放，特別是包含在液泡中的花色苷類物質(zhì)，從而增加了其生物可獲得率。綜上，在本研究探討范圍內(nèi)，500 MPa壓力下處理5 min是獲得藍(lán)莓酚類物質(zhì)的較好條件，這一條件與前人研究中發(fā)現(xiàn)的藍(lán)莓汁中花色苷的最佳保留條件一致[15]。

大量研究表明，植物多酚具有預(yù)防多種慢性疾病的作用，而這一作用被認(rèn)為與其所表現(xiàn)的突出的抗氧化性密不可分[16-17]。前期研究結(jié)果顯示，超高壓處理糙米、茶葉等不同的植物均被證實具有增強(qiáng)其抗氧化能力的作用[18-19]。本研究中，利用DPPH和ABTS自由基清除實驗探討了藍(lán)莓經(jīng)過不同條件超高壓處理后抗氧化能力的變化。從實驗結(jié)果來看，不同超高壓條件處理后均可以顯著提升藍(lán)莓的抗氧化性，尤其是ABTS自由基的清除能力，經(jīng)過500 MPa處理5 min的藍(lán)莓對ABTS自由基清除的IC-50值只有未處理組的一半，說明藍(lán)莓經(jīng)此條件超高壓處理后對ABTS自由基的清除能力提高了1倍。這可能是由于在此超高壓條件下，藍(lán)莓的多酚生物可獲得率得到極大的提高所引起的。前人對超高壓處理藍(lán)靛果的研究也同樣表明，超高處理可以有效提高藍(lán)靛果的抗氧化能力[20]。

綜上，超高壓處理可以顯著提高藍(lán)莓中總酚、總黃酮及花色苷等酚類物質(zhì)的生物可獲得率，增強(qiáng)其清除自由基的能力，提高抗氧化性。未來食品加工過程中可考慮利用該技術(shù)提高藍(lán)莓相關(guān)食品的營養(yǎng)價值。

參考文獻(xiàn)

[1]Cai Shengbao，et al.Comparative study of the effects of solid-state fermentation with three filamentous fungi on the total phenolics content （TPC），flavonoids，and antioxidant activities of subfractions from oats （Avena sativa L.）[J].Journal of Agriculture and Food Chemistry，2012，60（1）：507-513.

[2]Blokhina Olga，Eija Virolainen，Kurt V Fagerstedt.Antioxidants，oxidative damage and oxygen deprivation stress：a review [J].Annnal of Botany，2003，91（2）：179-194.

[3]Poprac Jomova，et al.Targeting free radicals in oxidative stress-related human diseases [J].Trends in Pharmacological Sciences，2017，38（7）：592-607.

[4]Xu Dong-Ping，et al.Natural antioxidants in foods and medicinal plants：extraction，assessment and resources [J].International Journal of Molecular Sciences，2017，18（1）：96.

[5]Rangel-Huerta，et al.A systematic review of the efficacy of bioactive compounds in cardiovascular disease：phenolic compounds [J].Nutrients，2015，7（7）：5177-5216.

[6]Chen Guan Lin，et al.Antioxidant activities and contents of free，esterified and insoluble-bound phenolics in 14 subtropical fruit leaves collected from the south of China [J].Journal of Functional Foods，2017（30）：290-302.

[7]Skrovankova Sona，et al.Bioactive compounds and antioxidant activity in different types of berries [J].International Journal of Molecular Sciences，2015，16（10）：24673-24706.

[8]Liu Lei，et al.Fermentation and complex enzyme hydrolysis enhance total phenolics and antioxidant activity of aqueous solution from rice bran pretreated by steaming with α-amylase [J].Food Chemistry，2017（221）：636-643.

[9]Santos，Mickael C.，et al.Use of high hydrostatic pressure to increase the content of xanthohumol in beer wort [J].Food and Bioprocess Technology，2013，6（9）：2478-2485.

[10]Maha，Ayoub，De Camargo Adriano Costa，Shahidi Fereidoon.Antioxidants and bioactivities of free，esterified and insoluble-bound phenolics from berry seed meals [J].Food Chemistry，2016（197）：221-232.

[11]Sun Dan，et al.Digestion property and synergistic effect on biological activity of purple rice （Oryza sativa L.）anthocyanins subjected to a simulated gastrointestinal digestion in vitro [J].Food Research International，2015（78）：114-123.

[12]Zhang Chengting，et al.Phenolic composition，antioxidant and pancreatic lipase inhibitory activities of Chinese sumac （Rhus chinensis Mill.）fruits extracted by different solvents and interaction between myricetin-rhamnoside and quercetin-rhamnoside [J].International Journal of Food Science & Technology，2017，53（4）：1045-1053.

[13]張海寧.超高壓輔助提取藍(lán)莓果渣花色苷及其對花色苷降解動力學(xué)的研究[D].南京：江蘇大學(xué)，2016.

[14]Zhang，ZQ，Pang，XQ，Duan，XW，et al.Role of peroxidase in anthocyanin degradation in litchi fruit pericarp [J].Food Chemistry，2005，90（1）：47-52.

[15]李星賀.超高壓處理對藍(lán)莓汁總抗氧化能力、酶活性及主要成分影響的研究[D].沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

[16]Huang Shiqi，et al.Bioaccessibility and antioxidant activity of phenolics in native and fermented Prinsepia utilis Royle seed during a simulated gastrointestinal digestion in vitro [J].Journal of Functional Foods，2017（37）：354-362.

[17]Zhang Chengting，et al.The free，esterified，and insoluble-bound phenolic profiles of Rhus chinensis Mill.fruits and their pancreatic lipase inhibitory activities with molecular docking analysis [J].Journal of Functional Foods，2018（40）：729-735.

[18]譚俊峰，等.超高壓處理對茶多酚提取率和抗DPPH自由基活性的影響[J].食品科學(xué)，2009，30（18）：92-95.

[19]于勇，等.超高壓處理對糙米多酚、黃酮類含量及其抗氧化性的影響[J].農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報，2017，48（11）：368-374.

[20]李新原，等.超高壓處理對藍(lán)靛果抗氧化物提取量及活性的影響[J].食品科學(xué)，2017，38 （3）：119-124.

（責(zé)任編輯?唐建敏）