夏枯草PvDXS基因的克隆和表達分析

李璐　董誠明　張夢佳　朱畇昊

摘要：? 該研究在夏枯草轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上設(shè)計特異引物，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)獲得該基因的全長核苷酸序列，并進行生物信息學分析，采用qRT-PCR法分析PvDXS在夏枯草不同組織及不同外源性物質(zhì)誘導下的表達量。結(jié)果表明：克隆得到的PvDXS基因開放閱讀框2 181 bp，編碼726個氨基酸，理論分子量為78 040.47 D，等電點為6.75，PvDXS蛋白具有Transketolase_C結(jié)構(gòu)域和Transket_pyr結(jié)構(gòu)域，系統(tǒng)進化樹結(jié)果表明，PvDXS蛋白與丹參、長春花的DXS（SmDXS2、CrDXS2）親緣關(guān)系較近，推測PvDXS屬于第Ⅱ類DXS蛋白。qRT-PCR分析表明，PvDXS基因在葉中表達量高于果穗及莖。對果穗施加7種外源性物質(zhì)處理24 h后，GA3處理組該基因表達量升高，其他6種外源性物質(zhì)處理后表達量均降低，其中CaCl2、SNP、SA處理后該基因的表達量顯著降低。PvDXS基因在不同組織中表達量差異較大，且受外源物質(zhì)誘導表達。這為進一步研究PvDXS基因?qū)ο目莶葺祁惓煞趾铣赏緩街械墓δ芗氨磉_調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 夏枯草， PvDXS基因， 基因克隆， 表達分析

中圖分類號：? Q943.2文獻標識碼：? A文章編號：? 1000-3142（2019）12-1619-09

作者簡介： 李璐（1993-），女，碩士研究生，研究方向為中藥資源的開發(fā)利用，（E-mail）15039087195@163. com。

Abstract：? Specific primers were designed on the basis of transcriptome sequencing of Prunella vulgaris. The full-length nucleotide sequence of PvDXS was obtained by reverse transcription PCR and the bioinformatics analysis of the gene was conducted. The expression levels of PvDXS in different tissues and exogenous substances were detected by real-time quantitative PCR. The results showed the? cDNA sequence of PvDXS contained the open reading frame which had 2 181 bp and encoded a predicted protein of 726 amino acids with a theoretical molecular weight of 78 040.47 D and a isoelectric point of 6.75. The protein had Transketolase_C domain and Transket_pyr domain. Phylogenetic tree results showed that PvDXS protein was closely related to DXS （SmDXS2， CrDXS2） from Salvia miltiorrhiza and Catharanthus roseus， and it was inferred that PvDXS belonged to the Class Ⅱ DXS protein type. Tissue expression pattern analysis revealed that PvDXS gene in leaves was higher than that in ears and stems. After treated with seven exogenous substances for 24 h， the expression of the gene increased in GA3 treatment group and decreased after treatment with the others. The expression level of the gene decreased significantly after CaCl2， SNP and SA treatments. The expressions of PvDXS were variant in different tissues and varied greatly after treatment of exogenous substances， which laid a foundation for further study on the function and expression regulation of PvDXS in the synthesis pathway of terpenoid components of Prunella vulgaris.

Key words： Prunella vulgaris， 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase gene， gene clone， expression analysis

DXS是一種轉(zhuǎn)酮酶可催化非甲羥戊酸途徑（DXP途徑），在硫胺素焦磷酸（thiamin pyrophosphate， TPP）作用下，該酶使丙酮酸脫羧后，與磷酸甘油醛縮合形成DXP（王凌健等，2013）。Rodriguez-Concepcion & Boronat（2015）的研究結(jié)果表明，DXS 定位于植物質(zhì)體的類囊體。該酶具有3個功能結(jié)構(gòu)域：TPP 結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)酮醇酶結(jié)構(gòu)域和嘧啶結(jié)合結(jié)構(gòu)域，且在其N端有一段質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽（Jadaun et al.， 2017）。Querol et al.（2001）報道了在酸性介質(zhì)中采用高效液相色譜法測定DXS酶活性。作為萜類化合物合成的重要限速酶，克隆得到DXS基因，對于研究萜類化合物生物合成途徑具有重要意義。目前，其他植物中DXS 基因表達、調(diào)控和遺傳轉(zhuǎn)化等方面已有部分研究（張浩宇等，2018;陳迪等，2018），而關(guān)于夏枯草DXS基因的研究報道比較少。

夏枯草（Prunella vulgaris）為唇形科草本植物，以其干燥果穗入藥，具有清肝明目、消腫散結(jié)等功效，其中萜類化合物是其重要的活性成分。Sun et al.（2014）發(fā)現(xiàn)熊膽草中DXS的組織表達模式與二萜物質(zhì)苦蒿素的組織積累模式呈正相關(guān)，暗示過表達DXS基因可能會增加熊膽草中二萜物質(zhì)苦蒿素的合成。Gong et al.（2006）研究發(fā)現(xiàn)銀杏DXS基因受到MeJA和ASA等外源物質(zhì)調(diào)控。因此基于前期獲得的夏枯草轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)庫基礎(chǔ)上，本研究采用RT-PCR技術(shù)從夏枯草中克隆得到DXS基因，并對其進行生物信息學、組織表達模式及誘導表達分析，以期為進一步揭示該基因在夏枯草萜類代謝機制中的作用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 材料和試劑

材料：夏枯草樣品采自河南省確山縣夏枯草GAP種植基地，河南中醫(yī)藥大學董誠明教授鑒定為夏枯草（Prunella vulgaris， PVL）。試劑：總RNA提取試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo公司），熒光定量試劑盒（QIAGEN），DNAMarker（TaKaRa公司），PCR產(chǎn)物回收試劑盒（上海生工），PCR儀（美國 Bio-Rad 公司C1000 Touch Thermal Cycler），熒光定量PCR儀（美國 Applied Biosystems公司 Step One Plus）。

1.2 總RNA 提取與cDNA第一條鏈的合成

利用康為世紀植物RNA 提取試劑盒提取夏枯草不同組織的總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳確定RNA完整性。cDNA 的合成步驟按照Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit進行操作，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 cDNA 全長克隆

從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中得到的夏枯草DXS基因序列兩端非編碼區(qū)設(shè)計一對特異性引物（DXR-F，DXR-R）（表1），以夏枯草葉片cDNA 為模板，進行擴增：cDNA 2.0 μL，2 × Es Taq mix 10.0 μL，10.0 μmol·L-1正反向引物各1.0 μL，加dd H2O 6.0 μL至體積為20.0 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性1 min;95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，35個循環(huán);72 ℃延伸5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，將擴增的目的條帶切膠回收純化，并連接到pMD19-T載體上，藍白斑篩選，菌落經(jīng)PCR檢測后的陽性克隆送往三博遠志生物技術(shù)有限公司測序進行測序。組成型表達的actin基因（KJ010818）作為內(nèi)參。

1.4 生物信息學分析

運用在線工具對PvDXS 基因及編碼蛋白進行生物信息學分析。利用ORF finder （http：//www.

bioinformatics.org/sms2/orf_find.html） 在線軟件分析開放閱讀框;運用DNAMAN軟件翻譯目的基因氨基酸序列，比對同源蛋白的序列;利用ExPASy Proteomics Server Protparam （http：//www.expasy. ch/ tools/ protparam.html） 分析目的蛋白的理化性質(zhì);利用SinalP4.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/） 預(yù)測信號肽;利用SMART （http：//smart.emb-heidelberg.de/） 分析目的蛋白功能域;利用NPSA server （http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sop ma.pl） 預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu);利用Swiss-Model （http：//swissmodel.expasy.org/interactive） 預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu);利用BaCeIlo （http：//gpcr.biocomp.unibo.it/bacello/） 和ChloroP （http：//www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/） 預(yù)測細胞定位和葉綠體轉(zhuǎn)運肽切割位點;運用MEGA5.1軟件對目的基因及同源基因的氨基酸序列構(gòu)建進化樹分析。

1.5 夏枯草DXS基因的特異性表達分析

夏枯草生長旺盛期，對生長狀態(tài)一致的夏枯草果穗進行處理，分別噴灑50 μmol·L-1 茉莉酸甲酯（MeJA）、17.14 μmol·L-1吲哚乙酸（IAA）、100 μmol·L-1乙烯利（ETH）、100 μmol·L-1硝普鈉（SNP）、1 mmol·L-1無水氯化鈣（CaCl2）、10 μmol·L-1水楊酸（SA）、2.88 μmol·L-1赤霉素（GA3）。以噴灑前（0 h）的果穗為對照，24 h后采集處理組樣品。

對夏枯草果穗、莖、葉及噴施7種外源物質(zhì)的果穗中PvDXS基因相對表達量進行實時熒光定量PCR （quantitative real-time PCR，qPCR） 檢測，qPCR 檢測的反應(yīng)體系：2× SYBR Green PCR Master Mix 10.0 μL，QN Rox Reference Dye 0.1 μL，正反向引物均為0.4 μL，模板cDNA 2.0 μL，加RNase-Free Water 7.1 μL至終體積為20.0 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性20 s后，進行40個循環(huán)（95 ℃，1 s;56 ℃，20 s;95 ℃，1 s），60 ℃，20 s，95 ℃，1 s。actin基因（KJ010818）作為內(nèi)參，設(shè)計序列引物（表1）。擴增完成后進行溶解曲線測定，2-ΔΔCt法分析PvDXS相對表達量。

2結(jié)果與分析

2.1 PvDXS基因克隆

據(jù)夏枯草轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)設(shè)計引物，夏枯草RNA 逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板，PCR擴增得到1條2 000 bp 左右的片段。ORF Finder軟件分析克隆測序拼接所得序列的開放閱讀框，結(jié)果所得序列含有1個大小為2 181 bp的完整開放閱讀框，命名為PvDXS（圖1）。

2.2? PvDXS基因編碼蛋白的生物信息學分析

2.2.1理化性質(zhì)ExPASy Proteomics ServerProtparam在線軟件分析編碼蛋白的理化性質(zhì)。推測該蛋白編碼726個氨基酸，理論分子量為78 040.47 D，等電點（pI）為6.75。總原子數(shù)為11 002，原子組成：C3457H5521N959O1035S30?？傌撾姾蓺埢鶖?shù)（Asp + Glu）有77個，總正電荷殘基數(shù)（Arg + Lys）有73個，推測為酸性蛋白質(zhì)。該蛋白中丙氨酸（Ala）含量最多（占氨基酸總數(shù)9.5%），其次是甘氨酸（Gly）（占氨基酸總數(shù)9.2%），半胱氨酸（Cys）的含量最少，為1.2%。通過對PvDXS蛋白進行疏水性預(yù)測，結(jié)果顯示：PvDXS蛋白疏水性表明多肽鏈第183位具有最低分值-2.522，第710位具有最高分值2.332，疏水氨基酸的數(shù)量小于親水氨基酸的數(shù)量，推測其為親水性蛋白（圖2）。

2.2.2 亞細胞定位和功能域通過亞細胞定位預(yù)測軟件分析發(fā)現(xiàn)PvDXS定位在葉綠體中。SMART在線軟件對PvDXS蛋白進行功能域預(yù)測，圖3結(jié)果顯示PvDXS蛋白具有 Transketolase_C結(jié)構(gòu)域和Transket_pyr結(jié)構(gòu)域，分別位于第583位到第706位、第404位到第569位，該蛋白功能域預(yù)測其含有與IPP結(jié)合的保守結(jié)構(gòu)域（DXP_synthase_N），這一結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)酮酶及丙酮酸脫氫酶的E1亞基（E1_dh家族）結(jié)構(gòu)相似（Newman & Chappell，1999），分別位于第82位到第367位、第109位到第261位。

2.2.3 PvDXS蛋白的二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測利用NPSA server在線軟件對PvDXS編碼的蛋白進行二級結(jié)構(gòu)分析，圖4結(jié)果表明，該蛋白預(yù)測由36.91%的α-螺旋、19.7%的延伸鏈、10.33%的β-轉(zhuǎn)角和33.06%的不規(guī)則卷曲組成混合型蛋白。Swiss-Model在線軟件預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)（圖5）結(jié)果顯示，PvDXS與大腸桿菌DXS蛋白（2o1s.1.A）相似度達到49.11%。

2.2.4 系統(tǒng)進化樹構(gòu)建和多序列比對通過BLAST序列比對，從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載擬南芥（Arabidopsis thaliala，AtDXS）、丹參（Salvia miltiorrhiza，SmDXS）、長春花（Catharanthus roseus，CrDXS）、橡膠樹（Hevea brasiliensis，HbDXS）、苜蓿（Medicago truncatula，MtDXS）、玉米（Zea mays，ZmDXS）、土沉香（Aquilaria sinensis ，AsDXS）、葡萄（Vitis vinifera，VvDXS）、高粱（Sorghum bicolo，SbDXS）、高良姜（Alpinia officinarum，AoDXS）、銀杏（Ginkgo biloba，GbDXS）、小立碗蘚（Physcomitrella patens，PpDXS）、野生條斑紫菜（Pyropia yezoensis，PvDXS）、油棕（Elaeis guineensis，EgDXS）、赤松（Pinus densiflora，PdDXS）、火炬松（Pinus taeda，PtDXS）、思茅松（Pinus kesiya var. langbianensis，PkDXS）、雙歧桿菌（Bifidobacterium longum subsp. longum BBMN68，BlDXS）和大腸桿菌（Escherichia coli，圖 3PvDXS功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測coliDXS）的DXS蛋白序列，與PvDXS蛋白的氨基酸序列通過MEGA5.1軟件采用鄰近法（N-J法）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，并選取部分植物的氨基酸序列利用DNAMAN軟件進行多序列比對分析。

多序列比對顯示PvDXS蛋白與HbDXS蛋白具有較高的相似性，序列一致性達73.76%，PvDXS蛋白包含1個硫胺素焦磷酸結(jié)合位點：GDG （X）8E（X） 4A（X）11NDN和1個轉(zhuǎn)酮醇酶結(jié)構(gòu)域：DRAGX28PXD;該蛋白存在于葉綠體中，N端存在1段由56個氨基酸殘基構(gòu)成的質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽（圖6）。系統(tǒng)進化樹結(jié)果（圖7）表明，PvDXS蛋白與丹參、長春花DXS（SmDXS2、CrDXS2）親緣關(guān)系較近，推測屬于第II類DXS蛋白類型，此類型的DXS蛋白參與次級代謝產(chǎn)物萜類物質(zhì)的生物合成（Miziorko，2011）。PvDXS與SmDXS相似性非常高，說明同一科植物基因在進化關(guān)系上具有高度保守性。

2.3 組織特異性及外源性物質(zhì)誘導后表達

利用qRT-PCR方法檢測PvDXS基因在夏枯草果穗、葉和莖中的表達量，以果穗為對照樣品。圖8結(jié)果顯示PvDXS基因在3個樣本中的表達量范圍為0.671～753.296。PvDXS基因在葉中高表達，其次是果穗，莖中的表達量最低。PvDXS基因在葉中的相對表達量是在果穗中的753.2倍，與課題組前期夏枯草轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。

7種外源性物質(zhì)處理后分析夏枯草果穗中PvDXS基因的表達趨勢。圖9結(jié)果表明，GA3處理后PvDXS的表達量顯著增高，為對照組的32.8倍。其他6種外源性物質(zhì)處理后PvDXS表達量范圍為0.005～0.260，其中CaCl2、SNP及SA處理后對該基注： 實線框為二磷酸硫胺結(jié)合位點，虛線框為轉(zhuǎn)酮醇酶結(jié)構(gòu)域;箭頭為質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽切割位點。

3討論

萜類化合物是一種廣泛存在于植物中的次生代謝產(chǎn)物，包括甾體類、醌類、胡蘿卜素類和植物激素等，其參與多種植物生理代謝活動如光合和呼吸作用（Xiang et al.， 2007）。DXS 在萜類化合物合成2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷（2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate，MEP） 途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用，催化丙酮酸和3-磷酸-甘油醛發(fā)生縮合反應(yīng)形成途徑中的重要中間體DXP （Krushkal et al.， 2003）。Zhou et al. （2016）發(fā)現(xiàn)丹參毛狀根中過表達丹參Sm DXS1 和 Sm DXS2，丹參酮的含量顯著提高;穿心蓮細胞5 μmol·L-1 MeJA的懸浮體系培養(yǎng)24 h后產(chǎn)生的穿心蓮內(nèi)酯含量增加5.25倍，與DXS基因的表達水平成正相關(guān)（Sharma et al.， 2015）。擬南芥過量表達馬鈴薯St DXS1基因后植株葉片中葉綠素和胡蘿卜素明顯增加（Henriquez et al.， 2016）。這表明DXS是萜類化合物代謝途徑的重要調(diào)節(jié)酶且利用其表達可改變萜類化合物的含量。

DXS基因的表達具有組織特異性，通常DXS基因在葉、莖的綠色細胞中表達較強，其他的組織器官表達較弱（Sawitri & Wallie， 2005）。本研究利用qPCR技術(shù)對夏枯草葉、莖、果穗組織器官中PvDXS的表達特征進行分析，結(jié)果表明PvDXS基因在不同組織中均有表達， 但表達量差異較大。PvDXS基因在葉中的表達水平最高，為果穗中表達量的753.2倍。

根據(jù)序列進化關(guān)系可將DXS基因分為DXS I、DXS Ⅱ和DXSⅢ三類（張浩宇等，2018），系統(tǒng)進化樹分析顯示PvDXS蛋白與丹參、長春花中的的第Ⅱ類DXS蛋白（SmDXS2、CrDXS2）親緣關(guān)系較近，據(jù)此推測PvDXS屬于第Ⅱ類DXS蛋白。DXSⅡ蛋白可編碼植物特定的次生代謝產(chǎn)物，說明PvDXS與夏枯草活性成分（如萜類化合物）含量有關(guān)。DXS基因的表達量與其次生代謝產(chǎn)物含量成正相關(guān)，如Munoz-Bertomeu et al.（2016）報道在薰衣草中過量表達擬南芥DXS基因顯著增加轉(zhuǎn)基因植株葉片和花中精油的含量。GA3處理后PvDXS的表達量顯著增高，為對照組的32.8倍。其他6種外源性物質(zhì)處理后PvDXS對該基因的表達具明顯的抑制作用。Gong et al.（2006）發(fā)現(xiàn)施加MeJA和ASA 等外源物質(zhì)后，銀杏內(nèi)酯的合成與GbDXS表達呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)對葡萄噴施GA3后其糖分及萜類化合物顯著增加（Murcia et al.， 2016;程大偉等，2018），推測GA3可提高夏枯草中的次生代謝產(chǎn)物，如萜類化合物。此外，孫君等（2014）發(fā)現(xiàn)雙瓣茉莉JsDXS的表達量受生物鐘的調(diào)控，具有晝夜節(jié)律性。其他6種外源物質(zhì)對PvDXS表現(xiàn)出一定抑制作用可能與此有關(guān)。本研究豐富了MEP途徑中DXS基因的種類，為后期的基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。

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