黔產(chǎn)苗藥對(duì)坐葉藥材HPLC指紋圖譜研究

馮華 劉亮 王祥培 劉順美

中圖分類號(hào) R284 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）02-0232-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.02.18

摘 要 目的：建立黔產(chǎn)苗藥對(duì)坐葉藥材的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜。方法：采用HPLC法。色譜柱為Agilent Eclipse XDB C18，流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為15 μL。以蘆丁為參照，測(cè)定10批貴州不同地區(qū)對(duì)坐葉藥材的HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004A版）進(jìn)行共有峰指認(rèn)和相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果：10批對(duì)坐葉藥材的HPLC指紋圖譜有12個(gè)共有峰，相似度均大于0.90。經(jīng)驗(yàn)證，10批樣品HPLC圖譜與對(duì)照指紋圖譜具有較好的一致性。結(jié)論：本研究所建HPLC指紋圖譜可為對(duì)坐葉藥材的鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

關(guān)鍵詞 黔產(chǎn)苗藥；對(duì)坐葉；高效液相色譜法；指紋圖譜

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish HPLC fingerprint of Miao medicine Hedyotis uncinella from Guizhou. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Agilent Eclipse XDB C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2% phosphoric acid （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 235 nm， and column temperature was 25 ℃. The sample size was 15 μL. Using rutin as reference， HPLC chromatograms of 10 batches of H. uncinella from different areas of Guizhou province were determined. Similarity Evaluation System for TCM Chromatographic Fingerprints （2004A edition） was used to identify common peaks and evaluate similarity. RESULTS： There were 12 common peaks in HPLC fingerprints of 10 batches of H. uncinella， and the similarity was higher than 0.90. After validation， HPLC chromatograms of 10 batches of sample were in agreement with control fingerprints. CONCLUSIONS： Established HPLC fingerprints can provide reference for the identification and quality evaluation of H. uncinella.

KEYWORDS Miao medicine from Guizhou； Hedyotis uncinella； HPLC； Fingerprint

苗藥對(duì)坐葉為茜草科植物對(duì)坐葉（Hedyotis uncinella Hook. et Arn.）的干燥全草，為貴州苗藥。對(duì)坐葉味辛、微苦，性平，具有清熱解毒、調(diào)中止瀉的功效，可用于治療腹瀉、腹脹、腹痛、里急后重以及痢疾、急性胃炎。苗藥解毒止瀉膠囊，由苗藥對(duì)坐葉為主藥組成中藥復(fù)方制劑。目前該產(chǎn)品主要在遵義家誠(chéng)藥業(yè)生產(chǎn)，苗藥解毒止瀉膠囊用于胃腸濕熱所致的腹瀉、腹脹、腹痛、急性腸炎等癥狀，作為地方藥材標(biāo)準(zhǔn)被收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003年版）[1]?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅通過(guò)性狀、顯微、薄層對(duì)對(duì)坐葉藥材進(jìn)行質(zhì)量控制。本文對(duì)對(duì)坐葉藥材進(jìn)行高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜研究，并對(duì)10批不同產(chǎn)地來(lái)源對(duì)坐葉藥材進(jìn)行了相似度評(píng)價(jià)比較，建立HPLC指紋圖共有模式，以期為對(duì)坐葉藥材的質(zhì)量控制和有效識(shí)別提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-1260型HPLC儀，包括四元泵、二極管陣列檢測(cè)器、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、Agilent 1260工作站（美國(guó)Agilent 公司）；AB204-S型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗機(jī)（功率：500 W，頻率：60 kHz，昆山市超聲儀器有限公司）；111型中藥粉碎機(jī)（上海海久中藥機(jī)械制造有限公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

對(duì)坐葉藥材采集于貴州各地區(qū)，經(jīng)遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校劉亮副教授鑒定為茜草科植物對(duì)坐葉（Hedyotis uncinella Hook.et Arn.）的干燥全草。藥材來(lái)源及信息見(jiàn)表1。蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-200707，純度：100%，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，5%A→10%A；5～15 min，10%A→15%A；15～25 min，15%A→20%A；25～35 min，20%A→30%A；35～40 min，30%A→5%A；40～45 min，5%A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：235 nm；進(jìn)樣量為15 μL；運(yùn)行時(shí)間：45 min[2-6]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取蘆丁對(duì)照品適量，加甲醇溶解制成每1 mL含0.1 mg的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取對(duì)坐葉藥材粉末（過(guò)3號(hào)篩）約1.0 g，置于錐形瓶中，加甲醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理60 min，取出，放置至室溫，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液（編號(hào)：S4）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以14號(hào)峰蘆丁為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)保留峰面積的RSD分別為1.5%和2.1%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液（編號(hào)：S4）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以14號(hào)峰蘆丁為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)保留峰面積的RSD分別為1.4%和2.0%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（編號(hào)：S4）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以14號(hào)峰蘆丁為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)保留峰面積的RSD分別為1.7%和2.3%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成與相似度、共有峰相關(guān)數(shù)據(jù)分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜生成 取10批對(duì)坐葉藥材各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004A版）對(duì)10批藥材樣品的HPLC圖譜進(jìn)行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見(jiàn)圖1～圖3。

2.4.2 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004A版）進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，10批對(duì)坐葉藥材樣品的相似度均大于0.90，且與對(duì)照指紋圖譜具有較好的一致性，表明藥材樣品間差異較小，質(zhì)量穩(wěn)定性良好，詳見(jiàn)表2～表4。

2.4.3 HPLC指紋圖譜相關(guān)分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004A版），對(duì)10批藥材樣品的HPLC指紋圖譜進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示，10批藥材樣品有12個(gè)共有峰，其中14號(hào)峰（蘆丁）峰面積大，且為所有藥材樣品共有，確定其為參照峰。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采用HPLC儀的二極管陣列檢測(cè)器在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，以確定樣品的吸收波長(zhǎng)。結(jié)果，在225、235 、254 nm波長(zhǎng)處吸收較強(qiáng)。采用多波長(zhǎng)進(jìn)樣分析，結(jié)果在235 nm波長(zhǎng)下所得基線較穩(wěn)定、色譜峰較多、信息豐富，故選擇235 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 提取方法的選擇

以甲醇為提取溶劑，分別考察超聲提取、回流提取、浸漬提取這3種提取方法。分別進(jìn)樣后，從色譜圖信息分析，3種提取法制備的供試品溶液圖譜信息未見(jiàn)明顯差異。綜合考慮，選定操作更簡(jiǎn)便的超聲提取方法來(lái)制備供試品溶液。

3.3 流動(dòng)相的選擇

在對(duì)供試品溶液進(jìn)行HPLC分析時(shí)，本課題組分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸溶液、乙腈-磷酸溶液等流動(dòng)相體系對(duì)色譜分離過(guò)程的影響[3-6]。結(jié)果顯示，乙腈-0.20%磷酸溶液的分離度高，峰形對(duì)稱，基線穩(wěn)定。

3.4 梯度洗脫的時(shí)間確定

以乙腈-0.20%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，分別考察了樣品在40、50、60、70 min洗脫時(shí)間的色譜圖[7]。結(jié)果顯示，45 min后圖譜基線穩(wěn)定，無(wú)其他峰出現(xiàn)，故選擇梯度洗脫時(shí)間為45 min為宜。

3.5 產(chǎn)地的選擇

通過(guò)查詢?nèi)珖?guó)中草藥資源普查信息和課題組成員到貴州各地區(qū)藥材采集信息情況，發(fā)現(xiàn)對(duì)坐葉藥材主要分布在貴州安順、黔東南州、黔南州、銅仁地區(qū)。由于藥材生長(zhǎng)受環(huán)境、氣候、地理?xiàng)l件等影響，以及指紋圖譜研究要求樣本應(yīng)在10批次以上，所以本試驗(yàn)研究采集樣品10批，其中有2批是在同一個(gè)縣不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)采集。

3.6 參照峰的選擇

對(duì)坐葉藥材主要成分為黃酮類[8-10]，而黃酮類主要包括槲皮素、熊果酸、木犀草素、蘆丁。通過(guò)色譜定位，14號(hào)峰為蘆丁，其峰面積大，且為所有藥材樣品共有，故確定其為參照峰。

3.7 指紋圖譜分析

通過(guò)建立該指紋圖譜，對(duì)10批對(duì)坐葉藥材HPLC圖譜進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藥材HPLC圖譜的共有峰保留時(shí)間、相對(duì)峰面積非常吻合，與共有模式R比較，相似度均大于0.90。從各峰面積大小來(lái)看，峰面積有很大的差異，可能與藥材生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)。從共有峰可以確定10批對(duì)坐葉藥材有效成分具有一致性。

綜上，本研究所建HPLC指紋圖譜可為對(duì)坐葉藥材的鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 貴州省食品藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：2003年版[S].貴陽(yáng)：貴州科技出版社，2003：149.

[ 2 ] 周建良，齊煉文，李萍.色譜指紋圖譜在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用[J].色譜，2008，26（2）：153-159.

[ 3 ] 馮華，鄧麗娟，吳林菁，等.酢漿草高效液相色譜指紋圖譜的鑒別研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2014，25（10）：2414-2416.

[ 4 ] 馮華，聶明華，羅秀瓊，等.土知母藥材及其混淆品HPLC指紋圖譜研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（6）：67-69.

[ 5 ] 馮華，石尚友，羅秀瓊，等.黔產(chǎn)見(jiàn)血清藥材薄層色譜與HPLC指紋圖譜識(shí)別[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2017，28（10）：2423-2425.

[ 6 ] 馮華，石尚友，羅秀瓊，等.黔產(chǎn)大菟絲子藥材高效液相色譜指紋圖譜的鑒別研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2017，28（3）：634-635.

[ 7 ] 馮華，楊燁，王祥培，等.艾納香及其偽品假東風(fēng)草的HPLC指紋圖譜研究[J].中國(guó)藥房，2017，28（9）：1257-1261.

[ 8 ] 劉亞華，徐君，李齊激，等.對(duì)坐葉化學(xué)成分研究[J].中成藥，2013，35（3）：556-559.

[ 9 ] 徐君，吳連花，徐文芬，等.HPLC法測(cè)定對(duì)坐葉中齊墩果酸和熊果酸[J].中成藥，2012，34（4）：765-767.

[10] 陳華國(guó)，靳鳳云，趙超，等.HPLC法測(cè)定對(duì)坐葉中木犀草素的含量[J].中國(guó)藥房，2009，20（36）：2838-2839.

（收稿日期：2018-02-24 修回日期：2018-11-08）

（編輯：余慶華）