青胡桃總黃酮含量測(cè)定及抗氧化活性分析

趙國(guó)超 周欣 李容 等

摘要：【目的】對(duì)不同產(chǎn)地青胡桃中總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)青胡桃抗氧化活性進(jìn)行研究，為其作為天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^(guò)紫外—可見(jiàn)分光光度法對(duì)貴州省10個(gè)縣（區(qū)）的青胡桃中總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定比較;并以赫章縣青胡桃為試驗(yàn)材料，采用DPPH法和ABTS法對(duì)青胡桃不同溶劑萃取物的抗氧化活性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)?！窘Y(jié)果】在青胡桃總黃酮含量測(cè)定方法中，蘆丁質(zhì)量濃度在0.5～4.0 mg/mL內(nèi)線性良好，平均回收率為97.47%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.26%（n=9）;不同地區(qū)青胡桃中總黃酮平均含量差異不明顯，貴州省胡桃最主要產(chǎn)地赫章縣的青胡桃總黃酮平均含量為9.51%。青胡桃的80%乙醇提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和水萃取物中總黃酮含量分別為286.59、89.04、108.48和173.67 mg/g，4種萃取物均有清除DPPH自由基和ABTS自由基的作用，且隨萃取物質(zhì)量濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，抗氧化能力排序?yàn)?0%乙醇提取物>水萃取物>乙酸乙酯萃取物>石油醚萃取物。【結(jié)論】建立的青胡桃總黃酮含量測(cè)定方法簡(jiǎn)單、快速、便捷，其線性、穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性和回收率良好。青胡桃具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑進(jìn)行開(kāi)發(fā)，具有較好的功能性食品和藥品開(kāi)發(fā)前景。

關(guān)鍵詞： 青胡桃;總黃酮;ABTS;DPPH;抗氧化活性

中圖分類(lèi)號(hào)： S664.1? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）02-0357-07

Abstract：【Objective】Determination of total flavonoids in Juglans regia L. from different producing areas in Guizhou Province was conducted，and the antioxidant activities of J. regia were also studied. It would provide theory and basis for the further development and utilization of J. regia as a natural antioxidant. 【Method】Taking J. regia in ten different counties（district） of Guizhou Province as the research object，the contents of total flavonoids were determined and compared with ultraviolet-visible spectrophotometry. Then with J. regia from Hezhang County as samples，the antioxidant activities of different solvent extracts of J. regia by DPPH method and ABTS method were evaluated. 【Result】 In the method for determining the total flavonoids content of J. regia，rutin had sound linearity within the concentration range in 0.5-4.0 mg/mL， the average recovery was 97.47%， relative standard deviation（RSD） was 1.26%（n=9）.? The average content of total flavonoids in J. regia from different regions did not vary largely. The main producing area of walnut in Guizhou Province is Hezhang County. The average content of total flavonoids in J. regia in Hezhang County was 9.51%. The content of total flavonoids in 80% ethanol extract，petroleum ether extract，ethyl acetate extract and water extract of J. regia were 286.59，89.04，108.48 and 173.67 mg/g， respectively. The four extracts had the functions of scavenging DPPH free radicals and ABTS free radicals. The order of antioxidant capacity was 80% ethanol extract>water extraction>ethyl acetate extraction>petroleum ether extraction. 【Conclusion】The established method to determine the content of the total flavonoids in J. regia has the advantages suck as quick and simple，feasible，and sound linearity，precision， repeatability and recovery. J. regia has strong antioxidant activity. It can be used as a natural antioxidant and has a good prospect in functional food and drug development.

Key words： Juglans regia L.; total flavonoids; ABTS; DPPH; antioxidant activity

0 引言

【研究意義】活性氧（ROS）是一種機(jī)體正常代謝和外源性暴露的產(chǎn)物。細(xì)胞系統(tǒng)受ROS持續(xù)影響后產(chǎn)生氧化應(yīng)激，從而誘發(fā)各種退行性病變和機(jī)體衰老（Morrissey and O’Brien，1998;Circu and Aw，2010）。因此，具有清除自由基能力的抗氧化劑受到人們高度重視，而天然抗氧化劑因其安全無(wú)公害的特點(diǎn)成為藥品和食品科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。胡桃中主要含有黃酮類(lèi)、醌類(lèi)、二芳基庚烷類(lèi)、萜類(lèi)、酚類(lèi)、揮發(fā)油及其他化合物（Zhang et al.，2012;吳威等，2013;Salimi et al.，2014），其中黃酮類(lèi)化合物具有抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫、抗衰老、降血脂、抗腫瘤、抗心肌缺血、抗腦缺血等多種藥理作用（馬銳和吳勝本，2013;謝進(jìn)等，2017）。青胡桃為胡桃科植物胡桃（Juglans regia L.）的新鮮或干燥幼果，在貴州傳統(tǒng)用藥歷史悠久，收載于2003版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》，其性味苦、澀、平，主要功效有清熱解毒、消腫止痛等（貴州省藥品監(jiān)督管理局，2013）。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)青胡桃的藥理作用進(jìn)行研究，證明其具有鎮(zhèn)痛（杜旭等，2000）、心血管保護(hù)（Cortés et al.，2006;Ryan et al.，2006）、抗衰老（陳紅紅等，2008）、抗炎（Hosseinzadeh et al.，2011）、抗腫瘤（Alshatwi et al.，2012）、抑菌（Zmantar et al.，2016;杜慧平等，2017）、殺蟲(chóng)（Shang et al.，2018）等藥理作用，但對(duì)于其抗氧化作用的研究較少。本課題組在前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)青胡桃具有較好的抗氧化活性，且胡桃作為貴州省的一種地標(biāo)性作物，在貴州種植面積廣，因此，測(cè)定青胡桃中抗氧化活性物質(zhì)總黃酮的含量，對(duì)于胡桃的綜合利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者已對(duì)胡桃抗氧化進(jìn)行了部分研究。呂海寧等（2011）研究核桃青皮的體外清除自由基活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同萃取部位均具有較強(qiáng)的清除自由基能力，排序?yàn)橐宜嵋阴ゲ课?amp;gt;正丁醇部位>氯仿部位>石油醚部位>水部位。徐紅艷等（2012）對(duì)胡桃楸種仁殼黃酮的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，胡桃楸種仁殼黃酮具有明顯的清除ABTS、DPPH和OH自由基能力，對(duì)鐵離子具有一定的鰲合作用，且抗氧化活性與黃酮含量呈劑量效應(yīng)關(guān)系。Zhao等（2014）對(duì)胡桃葉中的黃酮類(lèi)化合物抗氧化活性進(jìn)行研究，結(jié)果表明胡桃葉中的黃酮類(lèi)化合物具有抗氧化特性，且這些特性與調(diào)節(jié)免疫功能和增強(qiáng)抗癌活性有關(guān)。田平平等（2016）研究表明，核桃青皮具有較好的抗氧化活性，其中主要活性成分為7種多酚類(lèi)活性成分，并發(fā)現(xiàn)環(huán)境因子對(duì)核桃青皮活性成分的抗氧化穩(wěn)定性有一定影響。Figueroa等（2016）對(duì)10個(gè)不同品種胡桃的總酚含量及其生物利用度和抗氧化活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同品種胡桃的抗氧化能力不同，取決于其中總酚含量。Moghaddam等（2017）研究胡桃外果皮和內(nèi)果皮各種提取物的體外抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)內(nèi)果皮的甲醇提取物富含酚類(lèi)和黃酮類(lèi)化合物，且具有顯著的自由基清除活性，其抗氧化能力與合成抗氧化劑化合物（BHT）相當(dāng)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然已有不少關(guān)于胡桃抗氧化活性的研究，但主要集中在胡桃葉、胡桃殼提取物、胡桃外表皮的相關(guān)活性等方面（徐紅艷等，2012;Zhao et al.，2014;Moghaddam et al.，2017;Schwindl et al.，2017），對(duì)于青胡桃抗氧化活性與總黃酮含量間的關(guān)系研究較少，對(duì)不同產(chǎn)地青胡桃的總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定比較研究也鮮見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)紫外—可見(jiàn)分光光度法測(cè)定青胡桃中總黃酮含量，對(duì)該方法進(jìn)行方法學(xué)考察，并利用該方法對(duì)青胡桃不同溶劑萃取物中的總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)應(yīng)用DPPH自由基和ABTS自由基清除能力法分析青胡桃不同溶劑萃取物的抗氧化活性，為發(fā)掘青胡桃作為天然抗氧化劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

青胡桃分別采自貴州省赫章縣、云巖區(qū)、六枝特區(qū)、納雍縣、花溪區(qū)、白云區(qū)、威寧縣、大方縣、斗蓬山和天柱縣，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院孫慶文教授鑒定為胡桃科胡桃屬植物胡桃（Juglans regia L.）的幼果。DPPH（純度≥98%，批號(hào)217-591-8）購(gòu)自日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社;ABTS（純度≥98%，批號(hào)30931-67-0）購(gòu)自北京百靈威科技有限公司;蘆?。ㄅ?hào)R2DJ-35XP）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;6-羥基-2，5，7，8-四甲基色胺-2-羧基（Trolox）購(gòu)自貴州迪大生物科技有限公司;過(guò)硫酸鉀購(gòu)自天津博迪化工股份有限公司;無(wú)水乙醇（分析純）購(gòu)自天津市富宇精細(xì)化工有限公司;甲醇（優(yōu)級(jí)純）、石油醚（優(yōu)級(jí)純）和乙酸乙酯（優(yōu)級(jí)純）均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

主要儀器設(shè)備：Spectra Max Plus 384酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Device公司）;XS105十萬(wàn)分之一分析天平、AL204萬(wàn)分之一分析天平[梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司];DFY-200高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）;R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司）;電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）;KQ-300DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1. 2 青胡桃不同溶劑萃取物制備

赫章縣青胡桃鮮品用清水洗凈后切片并陰干，粉碎過(guò)80目篩，制成青胡桃干粉。精密稱(chēng)取青胡桃粉末20.0 g置于5000 mL錐形瓶中，加入80%乙醇1000 mL，超聲波提取80 min（300 W、40 kHz），提取2次，過(guò)濾，將濾液濃縮并冷凍干燥，得到青胡桃乙醇粗提物。將其用適量蒸餾水懸浮后倒入分液漏斗中，按體積比1∶1加入石油醚，振蕩，靜置2 h，分液，上層液體倒入燒杯中，得到石油醚萃取液，下層液體仍按體積比1∶1加入新的石油醚，石油醚萃取操作重復(fù)3次，合并石油醚萃取液，旋蒸濃縮，所得浸膏進(jìn)行冷凍干燥得到石油醚萃取物;將石油醚萃取所得下層液體倒入分液漏斗中，采用石油醚萃取的相同技術(shù)路線制備乙酸乙酯萃取物;乙酸乙酯萃取剩余物作為水萃取物。將各部分冷凍干燥，每部分平均分成3份后備用。

1. 3 含量測(cè)定供試品溶液制備

精密稱(chēng)取青核桃粉末0.2 g置于25 mL錐形瓶中，加入80%乙醇10.0 mL，稱(chēng)定重量，超聲波提取80 min（300 W、40 kHz），再稱(chēng)定重量，加入80%乙醇補(bǔ)足減失重量，過(guò)濾，取濾液，重復(fù)2次。合并提取液，得到青胡桃供試品溶液。

1. 4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

參考傅文軍等（2005）的方法，稍加修改。精密稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品8.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加入適量80%乙醇，置于超聲波清洗器中使其溶解后冷卻，加80%乙醇定容并搖勻，即得到質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別取0.5、1.0、2.0、2.5、3.0和4.0 mL對(duì)照品溶液置于10 mL具塞試管中，分別加入80%乙醇4.0 mL和5% NaNO2溶液0.7 mL，混勻后放置10 min，然后加入14% Al（NO3）3溶液0.5 mL，搖勻后放置10 min，再加入4% NaOH試液3.0 mL，用80%乙醇定容至10.0 mL（李淑珍等，2015），搖勻后放置8 min，以相應(yīng)試劑作空白對(duì)照，依照紫外—可見(jiàn)分光光度法于200～700 nm波長(zhǎng)處掃描，對(duì)照品溶液在510 nm有較大吸收。以蘆丁質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（x）、吸光值為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到蘆丁在0.5～4.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)的回歸方程：y=0.1979x+0.0271（R2=0.999）。

1. 5 青胡桃不同溶劑萃取物中總黃酮含量測(cè)定

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取赫章縣青胡桃不同溶劑萃取物0.01 g，置于10 mL容量瓶中，用80%乙醇定容，制得1 mg/mL溶液，代入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線中，測(cè)得各萃取物中總黃酮含量，重復(fù)3次。

1. 6 方法學(xué)考察

因貴州省胡桃主產(chǎn)地為赫章縣，故以赫章縣青胡桃為方法學(xué)考察的試驗(yàn)對(duì)象。

1. 6. 1 穩(wěn)定性考察 將赫章縣青胡桃樣品按1.3方法制備樣品溶液，取1.0 mL樣品溶液，置于10 mL具塞試管中，加入5% NaNO2溶液0.7 mL，混勻后放置10 min，然后加入14% Al（NO3）3溶液0.5 mL，搖勻后放置10 min，再加入4% NaOH試液3.0 mL，用80%乙醇定容至10.0 mL，搖勻后放置8 min，以相應(yīng)試劑作空白對(duì)照，于510 nm處測(cè)定吸光值。每隔1 h測(cè)定1次，共測(cè)6次。

1. 6. 2 精密度考察 方法同1.6.1，分別測(cè)定5次。

1. 6. 3 重復(fù)性考察 取赫章縣青胡桃樣品6份，按1.3方法制備樣品溶液，分別精密吸取樣品溶液1.0 mL，置于10 mL具塞試管中，加入5% NaNO2溶液0.7 mL，混勻后放置10 min，然后加入14% Al（NO3）3溶液0.5 mL，搖勻后放置10 min，再加入4% NaOH試液3.0 mL，用80%乙醇定容至10.0 mL，搖勻后放置8 min，以相應(yīng)試劑作空白對(duì)照，于510 nm處測(cè)定吸光值。

1. 6. 4 回收率考察 精密稱(chēng)取赫章縣青胡桃樣品粉末0.1 g 9份，每3份1組，向3組中分別精密加入樣品含量的50%、100%和150%的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.3方法制備樣品溶液，分別精密吸取樣品溶液1.0 mL，置于10 mL具塞試管中，加入5% NaNO2溶液0.7 mL，混勻后放置10 min，然后加入14% Al（NO3）3溶液0.5 mL，搖勻后放置10.0 min，再加入4% NaOH試液3.0 mL，用80%乙醇定容至10.0 mL，搖勻后放置8 min，以相應(yīng)試劑作空白對(duì)照，于510 nm處測(cè)定吸光值，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1. 7 不同產(chǎn)地青胡桃中總黃酮含量測(cè)定

分別取不同產(chǎn)地青核桃粉末0.2 g，按1.3方法制備得到不同產(chǎn)地青胡桃供試品溶液。分別取不同產(chǎn)地青胡桃供試品溶液1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加入80%乙醇4.0 mL和5% NaNO2溶液0.7 mL，混勻后放置10 min，然后加入14% Al（NO3）3溶液0.5 mL，搖勻后放置10 min，再加入4% NaOH試液3.0 mL，用80%乙醇定容至10.0 mL，搖勻后放置8 min，以相應(yīng)試劑作空白對(duì)照，于510 nm處測(cè)定吸光值。進(jìn)行3次重復(fù)，計(jì)算不同產(chǎn)地青胡桃中總黃酮的平均含量。

1. 8 抗氧化活性能力測(cè)定

1. 8. 1 DPPH自由基清除能力測(cè)定 參考Sharma和Bhat（2009）的方法，略加改動(dòng)。精密稱(chēng)取9.86 mg DPPH，用無(wú)水甲醇定容至100.0 mL，超聲波溶解，得到紫色DPPH溶液。將不同質(zhì)量濃度（10～160 μg/mL）的樣品和Trolox溶液分別加入配置好的DPPH溶液（體積比1∶1），室溫下暗處反應(yīng)0.5 h，以無(wú)水甲醇溶液作空白對(duì)照，測(cè)其在517 nm波長(zhǎng)處的吸光值（Ai），每個(gè)濃度平行試驗(yàn)3次。無(wú)水甲醇溶液與所配置的DPPH溶液1∶1混合后，測(cè)其在517 nm處的吸光值（A0）;將無(wú)水甲醇溶液與樣品溶液1∶1混合，測(cè)其在517 nm波長(zhǎng)處的吸光值（Aj）。將測(cè)得數(shù)據(jù)代入下式計(jì)算DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100

1. 8. 2 ABTS自由基清除能力測(cè)定 參考Re等（1999）的方法，略加改動(dòng)。精密稱(chēng)取0.0384 g ABTS和0.0134 g過(guò)硫酸鉀，用超純水分別定容至10.0 mL，混勻后于4 ℃條件下避光放置16 h，得到7 mmol/L ABTS自由基儲(chǔ)備液;使用前用95%乙醇對(duì)其進(jìn)行稀釋?zhuān)蛊湓?34 nm處的吸光值達(dá)0.7±0.02。將不同質(zhì)量濃度（10～160 μg/mL）的樣品和Trolox溶液分別加入配置好的ABTS自由基溶液（體積比1∶1），室溫下暗反應(yīng)0.25 h，測(cè)其在734 nm波長(zhǎng)處的吸光值（Ai）;測(cè)定ABTS自由基溶液與95%乙醇1∶1混合后在734 nm波長(zhǎng)處的吸光值（A0）;測(cè)定95%乙醇溶液與樣品溶液1∶1混合后在734 nm波長(zhǎng)處的吸光值（Aj）。將數(shù)據(jù)代入下式進(jìn)行計(jì)算，得到各樣品的ABTS自由基清除率：

ABTS自由基清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100

1. 9 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 21.0、Excel 2016和Origin 8.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 方法學(xué)考察結(jié)果

2. 1. 1 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果顯示，擱置4 h以內(nèi)的RSD為0.26%（n=6），小于2%，表明供試品溶液在制備顯色后4 h內(nèi)穩(wěn)定。

2. 1. 2 精密度試驗(yàn)結(jié)果 測(cè)得總黃酮含量分別為9.56%、9.49%、9.56%、9.53%、9.49%和9.51%，平均值為9.52%，RSD=0.31%（n=6），小于2%，表明儀器精密性良好。

2. 1. 3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 測(cè)得赫章縣青胡桃中總黃酮的平均含量為9.51%，RSD=0.39%（n=6），表明該總黃酮含量測(cè)定方法的重復(fù)性良好。

2. 1. 4 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 由表1可知，平均回收率為97.47%，RSD為1.26%（n=9）。

2. 2 青胡桃不同溶劑萃取物中總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

由表2可知，不同萃取溶劑對(duì)青胡桃中總黃酮含量有明顯影響，以粗提物（80%乙醇提取物）中的總黃酮含量最高，石油醚、乙酸乙酯和水3種溶劑萃取物的總黃酮含量均顯著低于80%乙醇提取物的總黃酮含量（P<0.05）。

2. 3 不同產(chǎn)地青胡桃中總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

從表3可看出，貴州省不同產(chǎn)地青胡桃樣品間的總黃酮含量均無(wú)顯著差異（P>0.05），其中花溪區(qū)和天柱縣的青胡桃總黃酮含量最高，均為9.61%，其次為云巖區(qū)、納雍縣和白云區(qū)，總黃酮含量均為9.58%，以斗蓬山的青胡桃總黃酮含量最低，為9.36%。

2. 4 青胡桃不同溶劑萃取物的抗氧化活性比較結(jié)果

因不同產(chǎn)地樣品間的總黃酮含量相差不明顯，且赫章縣為貴州省胡桃最主要產(chǎn)地，故選取赫章縣樣品進(jìn)行體外抗氧化活性試驗(yàn)。不同溶劑萃取物對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基清除能力的曲線方程、相關(guān)系數(shù)及半抑制濃度（IC50）如表4所示。根據(jù)IC50評(píng)價(jià)青胡桃不同溶劑萃取物清除DPPH自由基和ABTS自由基能力的強(qiáng)弱，IC50越小，清除能力越強(qiáng)。

2. 4. 1 DPPH自由基清除能力測(cè)定結(jié)果 從表4可知，80%乙醇提取物、乙酸乙酯萃取物和水萃取物清除DPPH自由基的IC50分別為27.39、144.78和52.35 μg/mL，石油醚萃取物在檢測(cè)范圍內(nèi)對(duì)DPPH自由基清除能力始終較低，4種萃取物的相關(guān)系數(shù)分別為0.997、0.999、0.999和0.999。青胡桃不同溶劑萃取物對(duì)DPPH自由基的清除效果如圖1所示，4種溶劑萃取物的清除能力隨溶液質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，且在10～160 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈明顯的量效關(guān)系;當(dāng)質(zhì)量濃度為160 μg/mL時(shí)，80%乙醇提取物、Trolox和水萃取物對(duì)DPPH自由基清除率分別為92.66%、92.42%和87.75%，均具有較強(qiáng)的抗氧化能力。各萃取物在低濃度時(shí)均表現(xiàn)出對(duì)DPPH自由基的清除能力小于Trolox，但粗提物在質(zhì)量濃度達(dá)80 μg/mL后對(duì)DPPH自由基的清除能力與Trolox相當(dāng)。石油醚萃取物與乙酸乙酯萃取物的DPPH自由基清除能力相似，對(duì)DPPH自由基清除能力均較弱。相同質(zhì)量濃度下各萃取物對(duì)DPPH自由基清除能力排序?yàn)?0%乙醇提取物>水萃取物>乙酸乙酯萃取物>石油醚萃取物。

2. 4. 2 ABTS自由基清除能力測(cè)定結(jié)果 由表4可知，80%乙醇提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和水萃取物清除ABTS自由基的IC50分別為30.81、146.34、114.60和49.46 μg/mL，相關(guān)系數(shù)分別為0.989、0.999、0.999和0.996。從圖2可看出，青胡桃不同溶劑萃取物對(duì)ABTS自由基均有一定的清除能力，且呈明顯量效關(guān)系;隨著青胡桃不同溶劑萃取物質(zhì)量濃度的增加，清除ABTS自由基的能力逐漸增強(qiáng)，但清除率均低于同等質(zhì)量濃度的Trolox清除率，其中80%乙醇提取物和水萃取物在質(zhì)量濃度達(dá)160 μg/mL時(shí)對(duì)ABTS自由基的清除能力與Trolox的清除能力相近。相同質(zhì)量濃度下各萃取物對(duì)ABTS自由基清除能力排序?yàn)?0%乙醇提取物>水萃取物>乙酸乙酯萃取物>石油醚萃取物。

3 討論

本研究對(duì)青胡桃不同溶劑萃取物的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，青胡桃對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基清除能力的排序均為80%乙醇提取物>水萃取物>乙酸乙酯萃取物>石油醚萃取物。其中80%乙醇提取物的抗氧化能力最強(qiáng)（清除DPPH自由基和ABTS自由基的IC50分別為27.39和30.81 μg/mL），與胡桃楸種仁殼粗提液（用60%乙醇、料液比1∶31、超聲波功率250 W、超聲波時(shí)間31 min進(jìn)行超聲波輔助提取所得）（清除DPPH自由基和ABTS自由基的IC50分別為2.76和33.26 μg/mL）（徐紅艷等，2012）相比，青胡桃粗提物清除ABTS自由基的能力更強(qiáng)。張衛(wèi)星等（2014）在核桃青皮提取物的抗菌和抗氧化活性研究中發(fā)現(xiàn)核桃青皮各提取相均有不同程度的抗氧化能力，其中乙酸乙酯相和氯仿相的抗氧化能力遠(yuǎn)強(qiáng)于其他各相;邵冬冬等（2018）對(duì)昆侖雪菊不同溶劑萃取物的抗氧化活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)正丁醇部位對(duì)DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，乙酸乙酯部位對(duì)OH自由基清除能力最強(qiáng)。本研究結(jié)果與張衛(wèi)星等（2014）、邵冬冬等（2018）的不同相間抗氧化能力排序結(jié)果不同，可能與試驗(yàn)樣品、樣品部位、產(chǎn)地、采收時(shí)間等存在差異有關(guān)。本研究中，青胡桃不同溶劑萃取物的抗氧化能力強(qiáng)弱順序與青胡桃不同溶劑萃取物的總黃酮含量順序一致，因此得出青胡桃中抗氧化活性成分可能為總黃酮。青胡桃的抗氧化活性隨總黃酮質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，與張福平等（2013）研究發(fā)現(xiàn)黃皮葉黃酮類(lèi)化合物對(duì)油脂的抗氧化能力隨總黃酮質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)的結(jié)果相同。本研究中，同種溶劑萃取物在相同質(zhì)量濃度下對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力存在差異，即同種溶劑萃取物對(duì)不同自由基清除作用具有選擇性。

本研究在總黃酮含量測(cè)定中選取10個(gè)不同產(chǎn)地的青胡桃;在抗氧化活性評(píng)價(jià)中將不同極性部位作為研究對(duì)象，研究?jī)?nèi)容與形式較傳統(tǒng)方法更嚴(yán)謹(jǐn)，研究結(jié)果也更具可比性、系統(tǒng)性和科學(xué)性，為貴州青胡桃的深入研究提供參考依據(jù)和新思路。但本研究中抗氧化活性評(píng)價(jià)考察因素較少，未能確定青胡桃中起抗氧化能力的具體成分。因此對(duì)超氧陰離子自由基、OH自由基等還原能力進(jìn)行考察，確定青胡桃中生物活性成分，同時(shí)展開(kāi)對(duì)其藥動(dòng)及藥效學(xué)的過(guò)程研究將是今后研究的重點(diǎn)。

4 結(jié)論

建立的青胡桃中總黃酮含量測(cè)定方法簡(jiǎn)單、快速、便捷，其線性、穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性和回收率良好。青胡桃具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑進(jìn)行開(kāi)發(fā)，具有較好的功能性食品和藥品開(kāi)發(fā)前景。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）