長鏈非編碼RNA CBR3-AS1在膽管癌中的表達及其臨床意義

呂波，朱新鋒，蔡常春，鄭小林

（華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院 肝膽胰外科 ，湖北 武漢 430014）

膽管癌（cholangiocarcinoma，CCA）起源于肝臟或膽道內(nèi)的上皮細胞。英美發(fā)達國家發(fā)病率呈下降趨勢，但全球發(fā)病率持續(xù)增加，大多數(shù)CCA患者診斷時處于晚期，對常見化療藥物易產(chǎn)生耐藥性而導(dǎo)致預(yù)后不佳[1-2]。CCA發(fā)病與寄生蟲感染、原發(fā)性膽道硬化和膽道畸形等危險因素相關(guān)[3]。CCA的發(fā)生是個涉及遺傳改變和環(huán)境因素相互作用的復(fù)雜過程[4]，多種致癌或抑癌基因的突變被認為參與CCA發(fā)生和進展[5]。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長度超過200 nt的RNA分子，其異常表達與包括癌癥在內(nèi)的多種疾病密切相關(guān)[6-8]。lncRNA CBR3-AS1（也稱PlncRNA1）最早發(fā)現(xiàn)其在前列腺癌組織中上調(diào)并調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡[9]。然而，lncRNA CBR3-AS1在CCA中的功能尚未完全闡明。本研究旨在探討CCA患者癌組織中l(wèi)ncRNA CBR3-AS1表達狀態(tài)及其與預(yù)后的關(guān)系，并探討其對CCA細胞增殖和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 組織標本收集

本研究收集華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院肝膽胰外科于2012年1月—2014年1月期間手術(shù)切除的CCA患者組織標本58例。納入標準：⑴ 患者經(jīng)病理診斷為原發(fā)性CCA；⑵ 除CCA外不存在其他部位原發(fā)性惡性腫瘤；⑶ 術(shù)前患者未經(jīng)過任何放化療或生物治療；⑷ 具有完整的病例和隨訪資料。排除標準：不符合上述標準者。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準同意。

1.2 臨床資料收集和隨訪

收集患者臨床資料和隨訪信息?；颊呖偵鏁r間為手術(shù)后出院第1天到死亡時間或隨訪截止時間。通過電話或門診隨訪，每3個月隨訪1次，行肝臟彩超、腹部CT及腫瘤標志物檢查，隨訪內(nèi)容包括患者復(fù)發(fā)及死亡情況，隨訪截止至2019年1月，最長隨訪時間6年，共2例失訪。

1.3 實驗材料和試劑

CCA細胞系（RBE和QBC939）和正常人膽管上皮細胞系（HIBE）購自日本生物樣本保存庫。lncRNA CBR3-AS1過表達質(zhì)粒、陰性對照質(zhì)粒及l(fā)ncRNA CBR3-AS1敲降質(zhì)粒均由上海吉瑪生物科技有限公司合成。MTT試劑盒、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清均購于美國Gibco公司，RIPA細胞裂解液及BCA試劑盒購于北京碧云天公司，TRIzol提取試劑、一步法cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green real-time PCR MasterMix購于美國Invitrogen 公司，ABI-7500平臺。LipofectamineTM3000 購買自美國Invitrogen公司，qPCR引物由上海生工公司設(shè)計并合成。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 所有細胞系在5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，取對數(shù)期生長良好的細胞行下一步實驗。

1.4.2 組織及細胞分組 將CCA細胞系RBE在六孔板上長至匯合80%以上時，按LipofectamineTM3000說明書分別轉(zhuǎn)染lncRNA CBR3-AS1過表達質(zhì)粒（過表達組）、陰性對照質(zhì)粒（對照組）及l(fā)ncRNA CBR3-AS1沉默表達質(zhì)粒（沉默組）。

1.4.3 細胞活力檢測 使用3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑溴化物（MTT）細胞增殖/活力測定試劑盒根據(jù)說明書檢測細胞活力。測量并記錄570 nm波長下每孔的吸光度A570nm，細胞活力計算公式=（A570nm樣本/A570nm對照）×100%。

1.4.4 細胞侵襲測定 使用具有8 mm聚碳酸酯核孔過濾器Transwell室行侵襲測定。將轉(zhuǎn)染細胞種植到用40 μL Matrigel預(yù)涂覆上室中，用200 μL無血清培養(yǎng)基孵育，且下室用600 μL含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基填充。多聚甲醛用于細胞固定，0.1%結(jié)晶紫用于染色，37 ℃孵育24 h后計數(shù)黏附在下表面的細胞數(shù)目。

1.4.5 實 時 定 量PCR（qRT-PCR） 使 用TRIzol從腫瘤標本或細胞系中提取總RNA，并使用SuperScriptIII逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用SYBR Premix Ex Taq TM II試 劑 盒 在ABI-7500平臺上進行PCR擴增，GAPDH為內(nèi)參。lncRNA CBR3-AS1表達采用以下引物測定：lncRNA CBR3-AS1引物序列，正向：5'-CAG TGG GGA ACT CTG ACT CG-3'， 反 向5'-GTG CCT GGT GCT CTC TTA CC-3'。GAPDH引物序列，正向：5'-GTC AAC GGA TTT GGT CTG TAT T-3'，反向：5'-AGT CTT CTG GGT GGC AGT GAT-3'。采用2-ΔΔCt法定量，計算lncRNA CBR3-AS1相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 lncRNA CBR3-AS1在CCA組織與細胞系中的表達

lncRNA CBR3-AS1在CCA組織中表達量明顯高于癌旁組織[（8.2±1.4）vs.（1.3±0.4），P＜0.01]（圖1A）；CCA細胞系RBE和QBC939中CBR3-AS1平均表達水明顯高于正常膽管上皮細胞系HIBE（均P＜0.01）（圖1B）。

圖1 qRT-PCR檢測lncRNA CBR3-AS1表達 Figure1 Expressions of lncRNA CBR3-AS1 determined by qRT-PCR

2.2 lncRNA CBR3-AS1表達與CCA患者臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)lncRNA CBR3-AS1表達相對水平中位值，將58例CCA患者分為lncRNA CBR3-AS1高表達組30例和lncRNA CBR3-AS1低表達組28例。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，lncRNA CBR3-AS1表達與年齡、腫瘤部位、血管浸潤、分化狀態(tài)、HBV感染和血清腫瘤標志物CEA和CA19-9均無明顯關(guān)系（均P＞0.05），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.030）、TNM分期（P=0.007）和術(shù)后復(fù)發(fā)（P=0.001）明顯有關(guān)（表1）。

表1 lncRNA CBR3-AS1表達與CCA患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系[n（%）]Table1 The relations of lncRNA CBR3-AS1 expression with the clinicopathologic characteristics of cholangiocarcinoma patients [n (%)]

2.3 lncRNA CBR3-AS1高表達與CCA患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier生存分析示，lncRNA CBR3-AS1高表達組CCA患者總生存率明顯低于lncRNA CBR3-AS1低表達組CCA患者（P=0.004）（圖2）。

圖2 不同lncRNA CBR3-AS1表達水平CCA患者的生存曲線Figure2 The survival curves of CCA patients with different lncRNA CBR3-AS1 expression levels

2.4 影響CCA患者總生存率的危險因素分析

單因素分析顯，示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤、TNM分期、術(shù)后復(fù)發(fā)和CBR3-AS1表達是影響總生存率的危險因素（均P＜0.01），多因素分析顯示，TNM分期（P=0.014）和lncRNA CBR3-AS1表達（P=0.020）是影響CCA患者總生存率的獨立危險因素（表2）。

2.5 轉(zhuǎn)染效率檢測及l(fā)ncRNA CBR3-AS1對CCA細胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染后，沉默組lncRNA CBR3-AS1表達量明顯低于對照組（P＜0.01）；過表達組lncRNA表達量明顯高于對照組（P＜0.01）（圖3）。轉(zhuǎn)染24、48、72 h后，過表達組細胞增殖活力明顯高于對照組；沉默組細胞增殖活力明顯低于對照組（圖4）。

表2 影響CCA患者總生存率的危險因素分析Table2 Analysis of risk factors for overall survival of CCA patients

圖3 轉(zhuǎn)染效率檢測Figure3 Transfection efficiency measurement

圖4 細胞增殖活性檢測Figure4 Cell proliferation assay

2.6 CBR3-AS1在體外調(diào)節(jié)細胞侵襲

200倍視野下，過表達組侵襲細胞數(shù)為（340±23）個，沉默組侵襲細胞數(shù)為（115±9）個，對照組侵襲細胞數(shù)為（203±17）個；過表達組侵襲細胞數(shù)明顯多于對照組（P＜0.01），沉默組侵襲細胞數(shù)明顯少于對照組（P＜0.01）（圖5）。

3 討 論

CCA是第二常見的原發(fā)性肝腫瘤[9]。CCA早期診斷不易，大多數(shù)患者診斷時處于晚期而失去最佳手術(shù)時機，導(dǎo)致患者5年生存率低至10%，因此，鑒別CCA預(yù)后相關(guān)分子標志物對改善患者預(yù)后至關(guān)重要[10]。

全基因組測序技術(shù)發(fā)展促進了各種非編碼RNA（no coding RNA，ncRNA）的發(fā)現(xiàn)，其中大量非編碼RNA被證實參與癌癥發(fā)生和發(fā)展過程[11]，對多種人類癌癥具有診斷和預(yù)后價值[12]。lncRNA是一種新發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA分子，涉及細胞發(fā)育和分化、轉(zhuǎn)錄和翻譯及代謝調(diào)節(jié)[13]。越來越多的研究表明lncRNA可作為致癌基因或腫瘤抑制基因參與包括胃癌、肝細胞癌、肺癌、前列腺癌和結(jié)腸直腸癌在內(nèi)的多種腫瘤進展[14-16]。最近研究認為lncRNA也參與CCA發(fā)生和進展：如NEAT-1過表達有助于CCA細胞增殖、侵襲和遷移，同時使CCA細胞對化療藥物吉西他濱更敏感[17]，CCAT1被證實為CCA患者不良預(yù)后標志物[18]，而AFAP1-AS1可作為CCA細胞生長和轉(zhuǎn)移啟動因子[19]。

lncRNA CBR3-AS1是21號染色體上的蛋白質(zhì)編碼基因，位于羰基還原酶3（CBR3）的反義區(qū)域，其可在體外促進乳腺癌細胞增殖和侵襲[20]，lncRNA CBR3-AS1在前列腺癌[21]和食道癌[22]的癌組織中過表達且體外調(diào)節(jié)細胞凋亡和增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，與相應(yīng)CCA癌旁組織和正常細胞系比較，lncRNA CBR3-AS1在CCA組織和細胞系中顯著上調(diào)，lncRNA CBR3-AS1高表達與較差的總生存率相關(guān)。單因素和多因素分析顯示，lncRNA CBR3-AS1是CCA患者預(yù)后不良的獨立危險因素。上述結(jié)果表明lncRNA CBR3-AS1可能參與CCA腫瘤進展，并可作為潛在預(yù)后標志物。近年來研究報道多個lncRNA分子可作為預(yù)測CCA不良預(yù)后的分子，最新研究報道lncRNA SPRY4-IT1可在CCA中發(fā)揮癌基因作用，促進腫瘤發(fā)展且與CCA不良預(yù)后相關(guān)，是新的預(yù)后生物標志物[23]；而lncRNANEF下調(diào)與CCA不良預(yù)后相關(guān)，并發(fā)揮抑癌基因作用[24]。

本研究通過功能喪失和獲得實驗證明lncRNA CBR3-AS1在CCA腫瘤進展中的功能。lncRNA CBR3-AS1敲降后可顯著抑制體外CCA細胞增殖活力；反之，lncRNA CBR3-AS1過表達可顯著促進體外CCA細胞增殖。CBR3-AS1過表達可促進CCA細胞侵襲。反之，CBR3-AS1敲降后可抑制CCA細胞侵襲，這與骨肉瘤[25]中的報道類似，在骨肉瘤細胞系中，敲降lncRNA CBR3-AS1可抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移及侵襲，并誘導(dǎo)凋亡[25]。研究結(jié)果提示lncRNA CBR3-AS1作為致癌lncRNA分子在CCA發(fā)生和進展中可能起重要作用，這可能解釋了CCA lncRNA CBR3-AS1高表達的患者預(yù)后差的原因。盡管如此，lncRNA CBR3-AS1靶基因和致癌潛在機制尚值得更進一步研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA CBR3-AS1在CCA組織和細胞系中上調(diào)表達，與CCA患者不良預(yù)后顯著相關(guān)。lncRNA CBR3-AS1可調(diào)節(jié)CCA細胞增殖和侵襲，可能是CCA一種新的預(yù)后分子標志物和治療靶點。