米象GST基因的表達(dá)及其對(duì)磷化氫的應(yīng)答

葉侃 胡飛 魏兆軍

摘要分析米象代謝解毒相關(guān)基因谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）的表達(dá)，獲得米象基因遺傳信息，進(jìn)而從本質(zhì)上全面揭示米象的磷化氫抗性。米象敏感品系經(jīng)磷化氫不同濃度熏蒸和不同時(shí)間熏蒸處理，2個(gè)基因經(jīng)LC30濃度磷化氫熏蒸的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他2個(gè)濃度；4個(gè)GSTs基因經(jīng)LC50濃度磷化氫熏蒸的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和LC30、LC10處理組；3個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組。7個(gè)GSTs基因隨著熏蒸時(shí)間的增加，相對(duì)表達(dá)量逐漸升高。米象GSTs基因在不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)模式中，SoGSTd1基因在四齡幼蟲階段的相對(duì)表達(dá)量最高；SoGSTe1基因在成蟲階段的相對(duì)表達(dá)量最高；SoGSTe2和SoGSTe5基因在四齡幼蟲階段的相對(duì)表達(dá)量最大，SoGSTe6基的相對(duì)表達(dá)量在三齡幼蟲階段最大。米象13個(gè)GSTs基因在不同組織部位的相對(duì)表達(dá)模式中。米象13個(gè)GSTs基因中的11個(gè)在中腸、脂肪體或馬氏管中的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于頭部和表皮中的表達(dá)量。

關(guān)鍵詞 米象；谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶；磷化氫；基因表達(dá)

中圖分類號(hào)S433.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2019）08-0114-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.029

AbstractThrough transcriptome technology，several resistant genes related to S.oryzae such as glutathione Stransferase，cytochrome were analyzed and the transcriptome genetic information was obtained，revealing the resistance of insects in nature at transcriptome level is gaining a huge interest among the researchers.The S.oryzae sensitive strains of different concentrations of phosphine fumigation and fumigation treatment at different time were investiagted.The concentration of two genes was significantly higher than the other two concentrations by the concentration of LC30，and the relative expression of the four GSTs genes was significantly higher than that of the control group and the LC30，LC10 treatment group，and the relative expression of the three genes was significantly lower than that of the control group.The relative expression level of 7 GSTs genes increased gradually with the increase of fumigation time.The relative expression of the SoGSTd1 in the fourinstar stage was the highest in the relative expression pattern of the GSTs gene in the different developmental stages，and the relative expression of the SoGSTe1 gene in the adult stage was the highest.The relative expression of the SoGSTe2 and SoGSTe5 genes in the four instar stage was the largest，and the relative expression of the SoGSTe6 gene in the three instar larvae was maximum.13 GSTs genes of S.oryzae were differently expression in different tissues.The relative expression level of 13 GSTs genes in midgut，fat body or malpighian tubules in S.oryzae was significantly higher than that in the head and cuticle.The relative expression level of 11 genes in the midgut，fat body or malpighian tubules was higher than that in the head and cuticle.

Key wordsSitophilus oryzae；Glutathione Stransferases；Phosphine；Gene expression

米象（Sitophilus oryzae）屬于鞘翅目，象蟲科，是一種完全變態(tài)昆蟲。它有卵、幼蟲、蛹、成蟲4個(gè)發(fā)育形態(tài)，是貯藏谷物的主要害蟲之一，主要寄生在貯存2～3年的陳糧中，例如玉米、水稻、小麥、高粱等谷物中，成蟲在外部啃食谷物顆粒，幼蟲則寄生在谷物內(nèi)部蛀食[1]。由于其地理分布遍布全世界，生長(zhǎng)繁殖速度快，因此對(duì)貯藏谷物危害嚴(yán)重[2]。在我國(guó)，米象主要生長(zhǎng)在南方地區(qū)。

我國(guó)在1960年就為了防治儲(chǔ)糧害蟲，開始使用磷化氫熏蒸劑，由于磷化氫具有成本低、使用便捷、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、無(wú)明顯殘留以及對(duì)絕大多數(shù)害蟲、鼠類的殺蟲效果明顯等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用，至今仍沒(méi)有出現(xiàn)比它更高效的熏蒸劑替代物[3]。到了90年代中期，由于熏蒸劑磷化鋁的長(zhǎng)期使用，一些儲(chǔ)糧害蟲產(chǎn)生了一定的磷化氫抗性[4]。根據(jù)調(diào)查，儲(chǔ)糧害蟲的磷化氫抗性品系從20世紀(jì)60年代的3種發(fā)展到31種，尤其在米象、谷蠹和扁谷盜中出現(xiàn)了對(duì)磷化氫的高抗性品種[5]，在印度發(fā)現(xiàn)的高抗性米象品系，其LC50已經(jīng)達(dá)1.7 mg/L（熏蒸20 h）[6]。我國(guó)研究人員于1988年測(cè)定了29種米象，其中12種具有抗性，抗性品種約占40%；1992年測(cè)定的37個(gè)品系中有26種為抗性品種，占比超過(guò)70%[7]。2004年對(duì)21種米象進(jìn)行研究，13種米象被發(fā)現(xiàn)具有磷化氫抗性[8]。研究表明，2005年我國(guó)發(fā)現(xiàn)1種磷化氫抗性米象，LC50已經(jīng)達(dá) 6.313 mg/L，為敏感品系的1 034倍[9]。結(jié)合這些數(shù)據(jù)，說(shuō)明米象產(chǎn)生抗藥的品種越來(lái)越多，并且抗藥性越來(lái)越強(qiáng)。

細(xì)胞色素P450、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和乙酰膽堿酯酶是昆蟲體內(nèi)的三大解毒酶。多年來(lái)，已開展了廣泛的抗性機(jī)制研究，結(jié)果表明昆蟲抗藥性的產(chǎn)生有不同的機(jī)制，已公認(rèn)的包括對(duì)殺蟲劑暴露的減少、對(duì)殺蟲劑代謝的增強(qiáng)以及靶標(biāo)部位敏感性的降低等[10]。

真核生物擁有多種谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）的不同催化活性，以適應(yīng)廣泛的酶家族功能[11]。生物體都具有一套精細(xì)的防御體系來(lái)抵抗外來(lái)和內(nèi)源有害物質(zhì)。在該體系中，GSTs的作用十分重要，它常在極端條件發(fā)揮抗氧化及解毒作用，從而對(duì)生物體起保護(hù)作用[12]。GSTs 的功能非常多樣，主要表現(xiàn)為以下3 個(gè)方面：①分解異源有毒物質(zhì)；②對(duì)細(xì)胞具有還原作用；③對(duì)內(nèi)源代謝物和外源化合物進(jìn)行細(xì)胞間運(yùn)輸[13]。

最早，GSTs是在大鼠中被發(fā)現(xiàn)具有活性[14]。近來(lái)，對(duì)于哺乳動(dòng)物和昆蟲GSTs 的研究報(bào)道越來(lái)越多，并且對(duì)昆蟲GSTs 基因家族的結(jié)構(gòu)、功能和進(jìn)化進(jìn)行了綜述，如針對(duì)岡比亞按蚊（Anopheles gambiae），克隆得到其GSTs 基因28 個(gè)，并且已經(jīng)完成對(duì)其測(cè)序[15] 。在一些有機(jī)磷殺蟲劑產(chǎn)生抗性的家蠅中，發(fā)現(xiàn)了GSTs 水平上升[16]。研究GSTs與殺蟲劑抗性的關(guān)系對(duì)防治儲(chǔ)糧害蟲有重要的理論和實(shí)踐意義[17]。昆蟲GSTs的研究焦點(diǎn)主要集中于殺蟲劑抗性。在果蠅和家蠅中證實(shí)了GSTs基因與磷化氫抗性有關(guān)，按蚊中也發(fā)現(xiàn)了磷化氫抗性有關(guān)的基因，過(guò)量表達(dá)的重組按蚊GSTs基因產(chǎn)物在體外能催化磷化氫降解，大規(guī)模全基因組測(cè)序的完成使得果蠅和按蚊的GSTs研究迅速發(fā)展[18]。

目前已經(jīng)從二十多種昆蟲中克隆得到了近百個(gè)GSTs 基因序列。它們分別屬于至少3個(gè)類別：Ⅰ 類GSTs基因被劃分為Delta，屬于昆蟲特有的GSTs[19]。2007年，國(guó)內(nèi)發(fā)現(xiàn)了家蠶中1個(gè)由220個(gè)氨基酸組成的GST，其結(jié)構(gòu)與果蠅和按蚊中相似，同屬Delta類[20]；Ⅱ 類GSTs基因包括Theta、Sigma、Omega和Zeta類；Ⅲ 類GSTs 基因也是昆蟲特異性的，稱為Epsilon類。除了這三大類以外，有人認(rèn)為果蠅中還存在第4類GSTs 基因[21]。此外，昆蟲GSTs 基因的表達(dá)調(diào)控也取得了初步進(jìn)展。其中雙翅目昆蟲GSTs 基因水平的研究報(bào)道最多，其次是鱗翅目昆蟲，其他種類的昆蟲研究很少[22]。筆者分析了米象代謝解毒相關(guān)基因谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，獲得了米象基因遺傳信息，進(jìn)而從本質(zhì)上全面揭示米象的磷化氫抗性。

1材料與方法

1.1供試?yán)ハx處理

1.1.1供試?yán)ハx。試驗(yàn)所用的米象材料采集自河南工業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品儲(chǔ)藏實(shí)驗(yàn)室。飼養(yǎng)條件為（27±1）℃，相對(duì)濕度為（70±5）%。將采集到的米象按不同的蟲態(tài)（卵、幼蟲、蛹、成蟲）分別放置，收集試蟲，每個(gè)蟲態(tài)收集300頭，裝入滅菌后的EP管中，放入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。米象成蟲飼養(yǎng)于廣口瓶中，用棉布封口，以上述同樣條件在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以備進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.1.2磷化氫氣體的制備。磷化氫氣體是由磷化鋁與10%的稀硫酸反應(yīng)制備的，磷化氫濃度用鉬蘭比色法測(cè)定。磷化氫用密封式注射器注射入盛有試蟲的特制的真空干燥器中。

1.1.3抗性測(cè)定。使用聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）方法熏蒸處理20 h（25 ℃、70%RH）。處理的試蟲從干燥器中取出后放置在養(yǎng)蟲室內(nèi)飼養(yǎng)14 d，檢查死亡狀況，計(jì)算死亡率。

1.1.4受試米象的逆境處理。

1.1.4.1不同濃度磷化氫處理。用不同的熏蒸室，磷化氫濃度分別設(shè)置為L(zhǎng)C50：0.039 mg/L、LC30：0.030 mg/L和LC10：0.005 mg/L，每種濃度設(shè)2 個(gè)平行。

1.1.4.2不同熏蒸時(shí)間處理。將磷化氫濃度統(tǒng)一設(shè)置為L(zhǎng)C30：0.030 mg/L，熏蒸處理時(shí)間設(shè)置為12、24、36和48 h，每個(gè)時(shí)間設(shè)2個(gè)平行。

1.1.5數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)是用SPSS軟件進(jìn)行分析處理和統(tǒng)計(jì)。

1.2米象轉(zhuǎn)錄組分析通過(guò)Solexa RNA 的paired-end 測(cè)序方法對(duì)各試驗(yàn)樣品進(jìn)行測(cè)序，將最短的reads片段從頭組裝成轉(zhuǎn)錄組。將得到的Unigene與數(shù)據(jù)庫(kù)中編碼已知功能蛋白的基因序列進(jìn)行比對(duì)，鑒定出GSTs，細(xì)胞色素P450以及EST基因。

1.3RACE反應(yīng)獲得米象代謝解毒基因全長(zhǎng)

1.3.1設(shè)計(jì)RACE引物。根據(jù)上一步獲得的米象代謝解毒基因部分中間片段，分別設(shè)計(jì)5′RACE和3′RACE特異性引物，擴(kuò)增5′末端和3′末端全長(zhǎng)序列，并預(yù)測(cè)長(zhǎng)度。

1.3.2合成5′RACE和3′-RACE-Ready cDNA模板。為了獲得RACE-Ready cDNA模板，準(zhǔn)備3′-RACE-Ready cDNA合成反應(yīng)體系，共需要2個(gè)反應(yīng)管，每管均為10 μL反應(yīng)體系。

米象13個(gè)GSTs基因在不同組織部位的相對(duì)表達(dá)模式如圖3所示。米象13個(gè)GSTs基因中的11個(gè)（SoGSTd1、SoGSTe1、SoGSTe2、SoGSTe3、SoGSTe4、SoGSTe5、SoGSTe6、SoGSTs1、SoGSTs2、SoGSTs3、SoGSTs4）在中腸、脂肪體或馬氏管中的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于頭部和表皮中的表達(dá)量；SoGSTe6、SoGSTs2和SoGSTt2基因在表皮中的相對(duì)表達(dá)量最低；僅SoGSTt1基因在米象5種組織部位中的相對(duì)表達(dá)量均無(wú)顯著性差異。

3結(jié)論與討論

克隆獲得米象GSTs基因全長(zhǎng)序列13個(gè)。根據(jù)序列的相似性和進(jìn)化關(guān)系，將其中的6個(gè)基因歸類于Epsilon家族，4個(gè)基因歸類于Sigma家族，2個(gè)基因歸類于Theta家族，另歸類于Delta家族1個(gè)。米象GSTs基因中共鑒定出6個(gè)Epsilon家族的基因。米象GSTs基因中沒(méi)有鑒定出Omega、Zeta和Unclassified家族的基因。

米象敏感品系經(jīng)磷化氫不同濃度熏蒸和不同時(shí)間熏蒸處理。3個(gè)GST基因經(jīng)不同濃度的磷化氫熏蒸后的相對(duì)表達(dá)量均無(wú)顯著性差異；2個(gè)基因經(jīng)LC30濃度磷化氫熏蒸的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他2個(gè)濃度；4個(gè)GSTs基因經(jīng)LC50濃度的磷化氫熏蒸的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和LC30、LC10處理組；3個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組。GSTs從總體上來(lái)看，表達(dá)量受熏蒸時(shí)間和劑量的影響，且與時(shí)間、劑量呈正相關(guān)?？傮w上來(lái)說(shuō)，隨著米象生長(zhǎng)發(fā)育，GSTs表達(dá)量逐漸增加。

在不同組織部位上，中腸、脂肪體或馬氏管中的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于頭部和表皮中的表達(dá)量。7個(gè)GSTs基因隨著熏蒸時(shí)間的增加，相對(duì)表達(dá)量逐漸升高；1個(gè)GSTs基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組。米象13個(gè)GSTs基因在不同組織部位的相對(duì)表達(dá)模式中。米象GST基因成蟲階段的相對(duì)表達(dá)量最高，在四齡幼蟲的相對(duì)表達(dá)量其次。

米象11個(gè)GSTs基因在中腸、脂肪體或馬氏管中的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于頭部和表皮中的表達(dá)量。

通過(guò)對(duì)米象GST基因的分析，不僅發(fā)現(xiàn)了米象進(jìn)化中的親緣關(guān)系，而且揭示了米象相關(guān)的抗藥性基因的分子機(jī)理，對(duì)抗性昆蟲產(chǎn)生的原理做出進(jìn)一步闡釋，為新藥物的開發(fā)提供了指導(dǎo)。同時(shí)，擴(kuò)充了米象的遺傳信息資源，為以后米象轉(zhuǎn)錄組的研究打下基礎(chǔ)。該研究選取米象中的GST基因進(jìn)行系統(tǒng)分析，可以假設(shè)，建立抗性基因數(shù)據(jù)庫(kù)，一方面可以研究昆蟲的種間關(guān)系，另一方面，對(duì)綜合治理昆蟲抗藥性以及維持生態(tài)平衡都有積極的意義。

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