一株產(chǎn)木聚糖酶菌株的篩選鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

王月琳 吳玉婷 石玉

摘要 從土壤中篩選出一株高產(chǎn)木聚糖酶的菌株ZK2，結(jié)合形態(tài)學(xué)以及16S rDNA 序列同源性分析對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，并對(duì)菌株的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，菌株與枯草芽孢桿菌的相似度最高，在溫度38 ℃、初始pH 8.0、發(fā)酵時(shí)間54 h、接種量10%時(shí)，菌株的產(chǎn)酶條件最優(yōu)。

關(guān)鍵詞 木聚糖酶；枯草芽孢桿菌；篩選；發(fā)酵條件

中圖分類號(hào) Q814.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）08-0168-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.044

Abstract A strain ZK2 with producing xylanase ability was isolated from the soil in Wuhan，Hubei Province.Strain ZK2 was identified based on physiological and sequence homology analysis of 16S rDNA sequence.Single factor experiments such as temperature，initial pH，fermentation period，inoculum size，were preliminarily optimized.The results showed that the strain had high similarity to the sequence of Bacillus subtilis.The optimum conditions for xylanase production were as follows：the optimal fermentation temperature of 38 ℃，initial pH of 8.0，fermentation period of 54 h，inoculum size of 10%.

Key words Xylanase；Bacillus subtilis；Screening；Fermentation conditions

木聚糖（xylan）為多聚五碳糖，是主要存在于植物細(xì)胞壁中的半纖維素成分，也是除纖維素外自然界中含量最豐富的可再生多糖[1-2]。木聚糖雖然廣泛存在于植物體內(nèi)，但動(dòng)物基本不能消化吸收。木聚糖酶（DxylanxylanohydrolaseEC3.2.1.8）是一類木聚糖降解酶系，屬于水解酶類[3]。木聚糖的完全降解需要木聚糖水解酶系中各種酶相互之間協(xié)同完成，其中木聚糖酶（β-1，4-D-xylanase）是最關(guān)鍵的水解酶，以內(nèi)切方式作用于木聚糖主鏈內(nèi)部的 β-1，4-木糖苷鍵，其主要水解產(chǎn)物為低聚木糖和少量木糖[4]，為木聚糖的進(jìn)一步應(yīng)用起著極為重要的作用。

木聚糖酶具有重要的應(yīng)用價(jià)值，在飼料[5]、造紙[6]、食品和醫(yī)藥[2-3]等行業(yè)均有廣泛的應(yīng)用。因此，對(duì)木聚糖酶的開發(fā)研究具有極大的商業(yè)價(jià)值。木聚糖酶主要來源于真菌、細(xì)菌、藻類和原生動(dòng)物[7-9]，當(dāng)前絕大多數(shù)商用木聚糖酶來源于真菌，主要由于真菌的產(chǎn)酶量相對(duì)較高。但真菌發(fā)酵周期長，且大部分真菌木聚糖酶最適作用條件偏于中性，使其在造紙、飼料、食品等工業(yè)極端環(huán)境下應(yīng)用受到一定限制[10]，而細(xì)菌木聚糖酶在耐極端條件方面有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)[10-13]，因此，從自然界中篩選細(xì)菌源的木聚糖酶仍具有極其重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 土樣采自湖北省武漢市湯遜湖旁。酵母浸粉、蛋白胨、磷酸氫二鉀、氯化鈉、硫酸鎂、硝酸銨，均為分析純，購自國藥集團(tuán)有限公司，木聚糖購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，瓊脂購于Biosharp，Japan。

BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器、JY600 DNA電泳儀、HH-S6 恒溫水浴鍋、OHG-914385-III電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、TG16-WS 臺(tái)式高速離心機(jī)、 SW-CJ-ZG超凈工作臺(tái)、Bio-rad MyCycler PCR儀、Spx-250b-d全溫振蕩培養(yǎng)箱、722型紫外可見分光光度計(jì)。

1.2 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：牛肉膏0.50%、蛋白胨1.00%、氯化鈉0.50%、pH 7。

選擇培養(yǎng)基：櫸樹木聚糖0.50%、硝酸銨0.30%、酵母浸粉0.40%、氯化鈉0.50%、磷酸氫二鉀0.20%、硫酸鎂0.02%、瓊脂2.00%、pH 7。發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米芯粉3.00%、蛋白胨0.50%、磷酸氫二鉀0.50%、pH 7。

1.3 產(chǎn)木聚糖酶菌株的分離與篩選

取100 mL蒸餾水加入裝有玻璃珠的250 mL錐形瓶中，高壓滅菌，將1 g土樣加入錐形瓶中，振蕩30 min，按 10 倍稀釋法進(jìn)行稀釋，取土樣稀釋液10-4、10-5、10-6的菌懸液涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的平皿中，30 ℃培養(yǎng)48 h。挑取單菌落，用牙簽點(diǎn)樣至選擇培養(yǎng)基，并做好標(biāo)記；于30 ℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)后，用0.2%的剛果紅染色20 min，用蒸餾水洗去染液，再用1 mol/L氯化鈉洗脫10 min，觀察有無透明圈，測(cè)量透明圈的直徑D及菌斑的直徑d，并計(jì)算D/d，挑選比值最大的菌株做后續(xù)研究。

1.4 產(chǎn)木聚糖酶菌株的鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定。觀察菌株的菌落特征，并挑取少許菌體做細(xì)胞染色，觀察其形態(tài)特征。

1.4.2 菌株的16S rDNA 序列分析。

采用細(xì)菌通用引物27F（5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′ ）和1492R（5′-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′）[14]擴(kuò)增分離株的16S rDNA。PCR反應(yīng)條件：首先預(yù)變性3 min，然后94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)后回收，送至上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序，序列通過NCBI的Blastn比對(duì)分析，并利用軟件Mega 4構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 木聚糖酶活力的測(cè)定

1.5.1 木聚糖酶液的制備。

將菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后，取適量于50 mL離心管中，5 000 r/min離心15 min，取上清液，即為粗酶液[15]。

1.5.2 木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。

配制1.0 μmol/mL的木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取標(biāo)準(zhǔn)木糖溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL， 去離子水補(bǔ)足至2 mL，再加入2 mL DNS溶液，沸水浴10 min，立即放冷水中冷卻，定容至10 mL，用分光光度計(jì)測(cè)定 540 nm下的吸收值。以木糖含量為橫坐標(biāo)，OD540為縱坐標(biāo)，繪制木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.3 木聚糖酶活性的測(cè)定。

1.9 mL含1%木聚糖的底物，加入0.1 mL 適當(dāng)稀釋的酶液，30 ℃準(zhǔn)確反應(yīng)10 min后加入2 mL DNS溶液終止反應(yīng)，沸水浴10 min，冷卻后加水定容至10 mL，充分搖勻，以滅活酶液做對(duì)照，測(cè)量樣品540 nm波長處的吸光度。

木聚糖酶活力的定義： 30 ℃條件下，1 mL粗酶液1 min水解木聚糖生成1 μmol還原糖（木糖）的酶量，稱為1個(gè)酶活力單位，U/mL。

1.6 產(chǎn)木聚糖酶菌株的產(chǎn)酶條件優(yōu)化

1.6.1 溫度對(duì)酶活的影響。將菌株接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始pH 7、接種量為10%，溫度分別為22、26、30、34、38、42 ℃，培養(yǎng)48 h，提取粗酶液，測(cè)定處理液的酶活。

1.6.2 初始pH對(duì)酶活的影響。

將菌株接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，溫度為30 ℃，接種量為10%，pH分別為4、5、6、7、8、9，培養(yǎng)48 h，提取粗酶液，測(cè)定處理液的酶活。

1.6.3 發(fā)酵周期對(duì)酶活的影響。

將菌株接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，溫度為30 ℃，接種量為10%，pH 7，發(fā)酵時(shí)間分別為18、30、42、54、66、78 h，提取粗酶液，測(cè)定處理液的酶活。

1.6.4 接種量對(duì)酶活的影響。將菌株接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，溫度為30 ℃，pH 7，接種量分別為1%、5%、10%、15%、20%、25%，培養(yǎng)48 h，提取粗酶液，測(cè)定處理液的酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與篩選

經(jīng)過平板篩選，挑取能產(chǎn)生透明圈的菌株2株。由表1可知，菌株ZK2的產(chǎn)木聚糖酶活性較ZK5高，因此選取ZK2做后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 菌株ZK2的形態(tài)學(xué)鑒定與分子生物學(xué)鑒定

2.2.1 菌株ZK2的形態(tài)鑒定。菌株ZK2 的菌落為白色、圓形，邊緣光滑，菌落不透明。鏡檢發(fā)現(xiàn)菌體桿狀，革蘭氏染色為陽性，產(chǎn)芽孢（圖1）。

2.2.2 菌株ZK2 16S rDNA的鑒定。以菌株ZK2基因組DNA為模板，采用細(xì)菌16S rDNA的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1.5 kb左右大小的條帶（圖2）。

16S rDNA比對(duì)結(jié)果表明，ZK2與枯草芽孢桿菌的相似性最高。從系統(tǒng)發(fā)育樹看，ZK2與枯草芽孢桿菌聚為一簇，結(jié)合形態(tài)學(xué)、 16S rDNA序列分析，將菌株ZK2鑒定為枯草芽孢桿菌（圖3）。

2.3 菌株ZK2產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.3.1 木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。按“1.5.2”制作木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖4。

2.3.2 培養(yǎng)溫度對(duì)酶活的影響。

由圖5可知，產(chǎn)木聚糖酶的發(fā)酵培養(yǎng)最適溫度為38 ℃，在該溫度下發(fā)酵培養(yǎng)液產(chǎn)酶能力最好。在培養(yǎng)溫度22～38 ℃時(shí)，酶活力隨溫度的升高而增加，溫度高于38 ℃時(shí)，產(chǎn)酶能力開始下降。

2.3.3 初始pH對(duì)酶活的影響。由圖6可知，產(chǎn)木聚糖酶的發(fā)酵初始培養(yǎng) pH為 8.0 時(shí)，產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，說明菌株ZK2最適宜在堿性環(huán)境下產(chǎn)木聚糖酶。

2.3.4 發(fā)酵周期對(duì)酶活的影響。

由圖7可知，在發(fā)酵時(shí)間為18～54 h時(shí)，產(chǎn)酶能力逐漸增加，發(fā)酵時(shí)間為54 h時(shí)，產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，菌株ZK2產(chǎn)木聚糖酶的最適發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為54 h。

2.3.5 接種量對(duì)酶活的影響。

由圖8可知，當(dāng)接種量為15%時(shí)，產(chǎn)木聚糖酶菌株的產(chǎn)酶活力最高，接種量為0～15%時(shí)，酶活逐漸增加，當(dāng)接種量大于15%后，酶活漸漸降低。由于接種量較大時(shí)，菌體生長過快，導(dǎo)致發(fā)酵液的黏度增加，在供氧量不變的情況下，會(huì)造成溶氧量不足而影響木聚糖酶的生成，因此最適接種量為10%。

3 結(jié)論與討論

通過稀釋涂平板，用透明圈法檢測(cè)酶活的大小，從土壤中篩選出一株高產(chǎn)木聚糖酶菌株ZK2。對(duì)ZK2進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定以及分子生物學(xué)鑒定，通過16S rDNA比對(duì)，ZK2與枯草芽孢桿菌的相似性大于99%，鑒定ZK2為枯草芽孢桿菌。

對(duì)ZK2產(chǎn)酶條件進(jìn)行初步優(yōu)化，產(chǎn)酶條件在培養(yǎng)溫度38 ℃、初始pH 8.0、接種量15%、發(fā)酵周期54 h時(shí)最優(yōu)。劉程程等[1]篩選到的一株木聚糖酶高產(chǎn)菌株FJAT-14260（沙福芽孢桿菌 Bacillus safensis），最適培養(yǎng)溫度為30 ℃，最適初始pH為7.0，與FJAT-14260相比，ZK2能耐受一定的堿性；易旭東等[11]從土壤中篩選出一株堿性木聚糖酶產(chǎn)生菌株 YH158，培養(yǎng)基初始 pH 8.0產(chǎn)酶活性較高，為堿性酶；真菌產(chǎn)木聚糖酶活性較細(xì)菌高，但真菌來源的木聚糖酶一般為酸性酶[16]，堿性木聚糖酶的開發(fā)利用具有廣泛的應(yīng)用前景。

目前，我國對(duì)木聚糖酶的需求日益增高，堿性木聚糖酶可應(yīng)用于紡織業(yè)、造紙業(yè)等，該研究篩選到的產(chǎn)木聚糖酶菌株ZK2，與一些產(chǎn)木聚糖酶菌株相比，有較高的耐堿性，具有一定的應(yīng)用開發(fā)價(jià)值。

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