超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀檢測(cè)動(dòng)物源性食品中氟蟲(chóng)腈及其代謝物

黎小鵬 梁雪琪 陳楠 鄧桂添 馬世柱 周嘉誠(chéng) 梁錦填

摘要 [目的]使用QuEChERS-EMR-Lipid前處理，超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀建立動(dòng)物源性食品中氟蟲(chóng)腈及其代謝物的檢測(cè)方法。[方法]優(yōu)化后的前處理?xiàng)l件：以乙腈作為萃取溶劑，搖勻后，旋渦振蕩1 min，以10 000 r/min常溫離心3 min，取5 mL上清液倒入已活化好的EMR-Lipid dSPE增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化管并放入陶瓷顆粒，劇烈振蕩3 min，以10 000 r/min常溫離心3 min;上清液全部轉(zhuǎn)移至EMR-Lipid Polish反萃取管中加入陶瓷顆粒并立即劇烈振蕩，超聲至管內(nèi)粉末全部溶解，以10 000 r/min常溫離心3 min，吸200 μL到樣品瓶中用超純水定容到1 mL，旋渦振蕩后上機(jī)檢測(cè)。色譜條件：色譜柱為Poroshell 120? EC-C18，流動(dòng)相為甲醇-水，在4.6 min內(nèi)4種組分分離良好。質(zhì)譜條件：噴射流電噴霧離子源（AJS ESI）;負(fù)離子模式同時(shí)掃描;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）采集方式。[結(jié)果]氟蟲(chóng)腈及其代謝物在0.1～20.0 ng/g均具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)≥0.999，平均加標(biāo)回收率為94.9%～113.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%～4.9%，方法檢出限為0.010～0.023 ng/g。[結(jié)論]超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀適用于動(dòng)物源性食物中氟蟲(chóng)腈及其代謝物的快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 QuEChERS-EMR;氟蟲(chóng)腈及其代謝物;動(dòng)物源性食物;超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀

中圖分類(lèi)號(hào) TS207.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）14-0204-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.14.060

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract [Objective]A method for the determination of fipronil and its metabolites in animalderived foods was established using QuEChERSEMRLipid pretreatment and ultra performance liquid chromatographytriple quadrupole mass spectrometry.[Method]Optimized preprocessing conditions：acetonitrile as an extraction solvent， whirlpool concussion， centrifugal， adding supernatant into activated EMRLipid dSPE enhanced lipid removal purification tube， whirlpool concussion， centrifugal again. dilute the supernatant. Chromatographic conditions： chromatographic column： Poroshell 120 ECC18， mobile phase is methanol water， and 4 components are well separated in 4.6 minutes. Mass spectrum conditions： jet flow electrospray ion source （AJS ESI）; negative ion mode simultaneous scanning; multi reaction monitoring （MRM） acquisition mode.[Result]The calibration curves for fipronil and its metabolites had good linear relationship in the range of 0.1 - 20.0 ng/g， with correlation coefficients not less than 0.999. The average spiked recoveries ranged from 94.9% to 113.0% with relative standard deviations of 1.9%-4.9%. The limits of detection were in the range of? 0.01-0.023 ng/g. [Conclusion]The method was applied in the determination for fipronil and its metabolites in animal derived foods with satisfactory results.

Key words QuEChERSEMRLipid;Fipronil and its metabolites; Foods of animal origin; Ultra high performance liquid chromatographytriple quadrupole mass spectrometry（UHPLCQQQ）

作者簡(jiǎn)介 黎小鵬（1965—），女，廣東中山人，高級(jí)農(nóng)藝師，從事農(nóng)產(chǎn)品安全檢測(cè)研究。

收稿日期 2019-01-22

氟蟲(chóng)腈是由法國(guó)羅納-普朗克農(nóng)化公司在1987 年所開(kāi)發(fā)研制的苯基吡唑類(lèi)高活性殺蟲(chóng)劑，化學(xué)名稱(chēng)（RS）-5-氨基-（2.6-二氯-4a-三氟甲基苯基）-4-三氟甲基亞磺?；吝?3-腈基吡唑，銳勁特（Regent）是其商標(biāo)的名稱(chēng)，英文的通用名稱(chēng)為 Fipronil。早期主要用于防治蔬菜、水稻、煙草、棉花、蓄牧業(yè)、公共衛(wèi)生、貯存用品及地面建筑中各類(lèi)別的作物害蟲(chóng)以及衛(wèi)生害蟲(chóng)，殺蟲(chóng)譜廣，活性高，且持效期長(zhǎng)。但氟蟲(chóng)腈對(duì)蜜蜂和水生生物高風(fēng)險(xiǎn)，在水和土壤中降解慢[1]，危害生態(tài)環(huán)境安全，我國(guó)于2009年10月1日起禁用，目前，氟蟲(chóng)腈僅可用于衛(wèi)生和玉米等部分旱田種子包衣劑[2]。氟蟲(chóng)腈被世界衛(wèi)生組織列為“對(duì)人類(lèi)有中度毒性”的化學(xué)品[3]，且其代謝物具有更高的毒性[4]，大量進(jìn)食含有高濃度氟蟲(chóng)腈的食品，會(huì)損害肝臟、甲狀腺和腎臟[5]。國(guó)際食品法典（CAC）和日本食品安全標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，氟蟲(chóng)腈在蛋中的最大殘留限量為0.02 mg/kg;美國(guó)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，氟蟲(chóng)腈在蛋中的最大殘留限量為0.03 mg/kg;歐盟相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，氟蟲(chóng)腈在食品中的最大殘留限量為0.005 mg/kg，且不得用于人類(lèi)食品產(chǎn)業(yè)鏈的畜禽養(yǎng)殖過(guò)程。美國(guó)環(huán)境保護(hù)局于2011年將氟蟲(chóng)腈列為C級(jí)致癌物[5]。

2017年7月20日，比利時(shí)通過(guò)歐盟食品和飼料類(lèi)快速預(yù)警系統(tǒng)（RASFF）通報(bào)雞蛋中檢出氟蟲(chóng)腈，之后多個(gè)歐洲國(guó)家相繼檢出[6]。據(jù)報(bào)道，問(wèn)題雞蛋產(chǎn)自荷蘭，氟蟲(chóng)腈被不恰當(dāng)?shù)赜糜陴B(yǎng)雞場(chǎng)的清潔物品中，造成雞蛋被檢出殘留物。此次污染事件因其使用的清潔用品非法添加了氟蟲(chóng)腈。8月26日，臺(tái)灣農(nóng)業(yè)主管部門(mén)發(fā)布新聞稿，經(jīng)檢驗(yàn)全臺(tái)蛋雞場(chǎng)氟蟲(chóng)腈殘留超過(guò)定量極限標(biāo)準(zhǔn)的雞蛋不合格的有44個(gè)蛋雞場(chǎng)，逾100萬(wàn)顆雞蛋回收封存或退回[7]。

我國(guó)國(guó)標(biāo)中規(guī)定了多種種植業(yè)產(chǎn)品中氟蟲(chóng)腈的最大殘留限量[8]，但未對(duì)任何動(dòng)物源性食品做出規(guī)定。2016年11月，農(nóng)業(yè)部發(fā)布《關(guān)于公開(kāi)征求對(duì)食品中農(nóng)藥最大殘留限量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的意見(jiàn)的函》，該函中有2個(gè)附件，其中附件2中補(bǔ)充規(guī)定了氟蟲(chóng)腈在牛肉、脂肪、牛腎、牛肝、家禽肉類(lèi)、家禽可食用內(nèi)臟、蛋類(lèi)及牛奶中的要求，但附件中規(guī)定的2個(gè)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中均沒(méi)有氟蟲(chóng)腈及其代謝物項(xiàng)目。在已發(fā)表的文獻(xiàn)中[9-13]，對(duì)于動(dòng)物源性食品中的氟蟲(chóng)腈及其代謝物前處理凈化方法，常用QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，and safe，意為快速、容易、便宜、有效、簡(jiǎn)單和安全）或固相萃?。⊿PE）。該研究探討使用對(duì)脂肪去除能力更佳的QuEChERS-EMR前處理方法，經(jīng)過(guò)3次渦旋振蕩離心，即可定容待測(cè)，使用超高液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀（LC-QQQ）同時(shí)測(cè)定動(dòng)物源性食品中氟蟲(chóng)腈及其代謝物的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀UHPLC-QQQ 1290-6495，美國(guó)安捷倫公司;渦旋混合器XW-80A，上海精科實(shí)業(yè)有限公司;電子天平OHAUS-CP2102，奧豪斯儀器有限公司;3-30k高速冷凍離心機(jī)，SIGMA公司;超聲波清洗機(jī)KQ-500E，昆山超聲波儀器有限公司。

1.2 試劑

甲醇、乙腈均為色譜純，德國(guó)Merck公司生產(chǎn);EMR-Lipid dSPE增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化管（PN：5982-1010），EMR-Lipid Polish反萃取管（PN：5982-0101），陶瓷均質(zhì)子（PN：5982-9312），均為美國(guó)安捷倫公司生產(chǎn)。

氟蟲(chóng)腈及其代謝物：氟蟲(chóng)腈、氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜、氟蟲(chóng)腈硫醚，濃度1 000 μg/mL，所有標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所（天津）?；旌虾笈涑蓾舛葹?00 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)逐級(jí)稀釋?zhuān)蠙C(jī)前用空白基質(zhì)將4種農(nóng)藥混標(biāo)配制成校正曲線工作液，其濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L。

1.3 儀器條件

1.3.1

色譜條件。色譜柱為Poroshell 120? EC-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）;柱溫45 ℃;流速0.4 mL/min;進(jìn)樣量5 μL;流動(dòng)相：水-甲醇，梯度洗脫，詳見(jiàn)表1。

1.3.2 質(zhì)譜條件。噴射流電噴霧離子源（AJS ESI）;負(fù)離子模式同時(shí)掃描;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）采集方式;ifunnel高壓120 V、低壓90 V;干燥氣溫度200 ℃;干燥氣流量14.0 L/min;霧化氣壓力241.3 kPa;鞘氣溫度350 ℃;鞘氣流量10.0 L/min;毛細(xì)管電壓3 kV;噴嘴電壓1 500 V;MS及MS均為單位分辨率;碰撞能380 V;離子加速電壓4 V;4種化合物的質(zhì)譜采集參數(shù)見(jiàn)表2。

1.4 樣品前處理

稱(chēng)取5 g（精確到0.01 g）的雞蛋、雞肉或牛奶樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈快速搖勻后，旋渦振蕩1 min，以10 000 r/min冷凍離心3 min;等待離心時(shí)對(duì)EMR-Lipid dSPE增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化管進(jìn)行預(yù)處理，加入5 mL水并立即旋渦混合，備用;離心結(jié)束后吸取5 mL上清液到上述已活化好的EMR-Lipid dSPE增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化管并放入2個(gè)陶瓷均質(zhì)子，劇烈振蕩1 min，旋渦混合2 min，以10 000 r/min常溫離心3 min;上清液全部轉(zhuǎn)移至EMR-Lipid? Polish反萃取管中加入2個(gè)陶瓷均質(zhì)子，蓋緊蓋子并立即劇烈振蕩，超聲至粉末全部溶解，以10 000 r/min常溫離心3 min，吸200 μL上清液到樣品瓶中并加入800 μL超純水，旋渦振蕩后上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

液相連接兩通，0.1 mg/L單標(biāo)溶液進(jìn)樣5 μL，采用負(fù)離子掃描模式對(duì)相應(yīng)模式的母離子進(jìn)行掃描，待測(cè)物母離子均為[M-H]-，以準(zhǔn)分子離子為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，得到各個(gè)化合物相應(yīng)響應(yīng)值最佳的碎片離子。

利用分子量計(jì)算器計(jì)算單同位素質(zhì)量數(shù)，獲得氟甲腈、氟蟲(chóng)腈、氟蟲(chóng)腈硫醚、氟蟲(chóng)腈砜4個(gè)化合物的單同位素質(zhì)量數(shù)分別為435.94、387.97、451.93和419.94。在MS Tune模式下，用單同位素質(zhì)量數(shù)開(kāi)展手動(dòng)調(diào)諧方法研究。在電噴霧正離子電離（ESI +）模式下，4個(gè)化合物均無(wú)響應(yīng);在電噴霧負(fù)離子電離（ESI-）模式下，均有響應(yīng)值高的分子離子峰[M-H]-，該試驗(yàn)采用負(fù)離子模式掃描，MRM參數(shù)詳見(jiàn)表2。

2.2 流動(dòng)相及色譜條件優(yōu)化

該試驗(yàn)在相同梯度洗脫程序等液相條件下，比較不同有機(jī)溶劑（甲醇、乙腈作為流動(dòng)相）的色譜分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖1～2），使用甲醇作為流動(dòng)相時(shí)4種化合物有效分離;使用乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，氟蟲(chóng)腈砜與氟蟲(chóng)腈硫醚不能有效分離。所以該試驗(yàn)采用甲醇作為流動(dòng)相。

2.3 前處理凈化方法的選擇

分別比較QuEChERS-EMR、QuEChERS、固相萃取（SPE）3種前處理凈化方法，在樣品中加入2 ng/g的氟蟲(chóng)腈及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算3種前處理方法下的回收率。

2.3.1 QuEChERS-EMR凈化。按“1.4”處理。

2.3.2 QuEChERS凈化。按“1.4”前部分提取，第1次離心后吸取5 mL上清液至分散固相萃取試劑盒（15 mL離心管，含50 mg乙二胺-N丙基硅烷 PSA、150 mg C18 EC、900 mg硫酸鎂，PN：5982-4950）中，放入2個(gè)陶瓷均質(zhì)子，劇烈振蕩1 min，旋渦混合2 min，以10 000 r/min常溫離心3 min，取200 μL上清液到樣品瓶中并加入800 μL超純水，旋渦振蕩后上機(jī)檢測(cè)。

2.3.3 SPE凈化。按“1.4”前部分提取，第1次離心后吸取2 mL上清液至玻璃試管中，50 ℃氮吹至近干，加入2 mL正己烷待凈化;依次用5 mL V（丙酮）∶V（正己烷）=1∶9、5 mL正己烷預(yù)淋洗弗羅里矽SPE小柱（1 g，6 mL），小柱條件化后，加入上述2 mL提取物正己烷溶液，用5 mL V（丙酮）∶V（正己烷）=1∶9沖洗試管后洗脫弗羅里矽柱，重復(fù)1次，收集洗脫液，氮吹至近干，加入1 mL正己烷，渦旋混合，取200 μL到樣品瓶中并加入800 μL超純水，旋渦振蕩后上機(jī)檢測(cè)。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種凈化方法的加標(biāo)回收率無(wú)顯著差異，詳見(jiàn)表3;但使用質(zhì)譜進(jìn)行全掃描，其凈化效果見(jiàn)圖3，從圖中可看出，QuEChERS-EMR的雜質(zhì)峰更少，因EMR凈化管對(duì)脂肪吸附能力更強(qiáng)，對(duì)動(dòng)物源性樣品的潔凈效果更明顯，則儀器清潔維護(hù)的成本可大大減少;從操作簡(jiǎn)易程度看，QuEChERS最快捷，但凈化效果不夠理想，SPE的凈化效果與QuEChERS-EMR相當(dāng)，但操作復(fù)雜，需時(shí)更長(zhǎng)，10個(gè)樣本約3 h完成凈化處理，該試驗(yàn)選擇QuEChERS-EMR作為凈化方法。

2.4 定量方法的線性檢測(cè)范圍

以混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)、各目標(biāo)化合物色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性關(guān)系相關(guān)系數(shù)、回歸方程見(jiàn)表4。氟蟲(chóng)腈及其代謝物在0.1～20.0 ng/mL線性關(guān)系良好，r值均大于0.999。

2.5 方法檢出限

最低檢出限按最低濃度點(diǎn)1.0 ng/g的響應(yīng)值與基線的噪聲響應(yīng)的3倍計(jì)算，檢出限結(jié)果見(jiàn)表4。氟蟲(chóng)腈及其代謝物的方法檢出限為0.010～0.023 ng/g，能滿足動(dòng)物源性食物中微量氟蟲(chóng)腈及其代謝物的檢測(cè)。

2.6 方法回收率和精密度

在相同的試驗(yàn)條件下，分別對(duì)6個(gè)空白禽肉、禽蛋樣品添加濃度為2.0、10.0、20.0 ng/g的氟蟲(chóng)腈及其代謝物混合標(biāo)樣，進(jìn)行加標(biāo)回收和精密度測(cè)試，測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表4。氟蟲(chóng)腈及其代謝物的加標(biāo)回收率為94.9%～113.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%～4.9%，可見(jiàn)該方法具有很好的回收率和精密度。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)采用QuEChERS-EMR前處理，提取效率高，操作簡(jiǎn)便快捷，且有機(jī)溶劑用量少，對(duì)環(huán)境友好;使用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立了動(dòng)物源性食物中氟蟲(chóng)腈及其代謝物的檢測(cè)方法，整個(gè)分析過(guò)程簡(jiǎn)單快捷，大大減少人為誤差，檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性好、精密度高，適合于動(dòng)物源性食物中氟蟲(chóng)腈及其代謝物的快速檢測(cè)。

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