固相萃取—超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定解郁安神顆粒中8種非法添加化學(xué)藥物的實驗研究

李應(yīng)才

【摘 要】 目的：建立解郁安神顆粒中8種非法添加藥物的固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜檢驗方法。方法：樣品經(jīng)提取和固相萃取凈化后，采用 Agilent C18色譜柱，流動相梯度洗脫，電噴霧離子源電離，正離子多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式（MRM）定性和定量分析。結(jié)果：8種藥物成分線性相關(guān)系數(shù)均>0.9995，檢出限均低于2.6ng/ml，回收率為87%～97%。結(jié)論：該方法能有效去除基質(zhì)干擾，檢出限低、線性及回收率良好，適用于解郁安神顆粒中8種非法添加藥物的檢驗。

【關(guān)鍵詞】 解郁安神顆粒；固相萃??；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；化學(xué)藥物

【中圖分類號】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2016）12-0030-03

Abstract：Objective The establishment of Jieyu Anshen granules in 8 kinds of prohibited drugs in solid phase extraction high performance liquid chromatography - three four MS / MS test series. Methods The samples were extracted and purified by Agilent solid phase extraction， C18 column， mobile phase gradient elution， electrospray ionization， positive ion multiple reaction monitoring （MRM） scan mode of qualitative and quantitative analysis. Result 8 kinds of drug ingredients linear correlation coefficient （R） were greater than 0.9995， the detection limit is lower than 2.6 ng/ml，the recovery rate of 87%-97%. Conclusion This method can effectively eliminate matrix interference， low detection limit， linearity and good recovery rate， suitable for adding 8 prohibited Jieyu Anshen granules drug test.

Keywords：Jieyu Anshen granules； Spe； UPLC-ms/ms； Chemical drugs

解郁安神顆粒收載于2015年版中國藥典一部[1]，具有疏肝解郁，安神定志的功效，常用于情志不暢、肝郁氣滯所至的失眠、心煩、焦慮、健忘等癥狀。近年來不法分子為了片面追求療效，可能在中成藥中非法添加化學(xué)藥物[2]。國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品檢驗補(bǔ)充檢驗方法和項目批準(zhǔn)件（批準(zhǔn)件編號2009024）[3]中僅采用樣品和標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖做比較來進(jìn)行定性，缺少質(zhì)譜參數(shù)及定量信息，使得在具體監(jiān)督檢驗中缺少可操作性。解郁安神顆粒的處方由柴胡、大棗、石菖蒲、姜半夏、炒白術(shù)等16味中藥組成，輔料為蔗糖。處方成分多，樣品基質(zhì)復(fù)雜，對檢驗其中可能非法添加的化學(xué)藥物帶來影響。研究采用固相萃取前處理，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀定性定量檢測，能有效去除雜質(zhì)，排除干擾，提高檢出靈敏度，建立適合解郁安神顆粒中8種可能非法添加化學(xué)藥物的檢測方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 超Agilent 1290高效液相色譜儀；4000 QTPAP三重四級桿質(zhì)譜儀 ；C18色譜柱（1.8μm×2.1mm×50mm，Agilent）；Generik C8/BCX固相萃取小柱（sepax）。

1.2 材料 奧沙西泮、地西泮、硝西泮、氯硝西泮、勞拉西泮、咪達(dá)唑侖、艾司唑侖、三唑侖對照品均購于中國食品藥品檢驗研究院；解郁安神顆粒（批號：20150501，吉林百姓堂藥業(yè)有限公司）。甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 對照品溶液的配制 分別精密稱定各標(biāo)準(zhǔn)品約20mg置于50ml容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，于4℃冷藏，作為儲備液。使用時用甲醇稀釋至所需濃度。

2.2 混合對照品溶液 取上述各對照品儲備液1.0ml，置于10ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 樣品制備 取樣品3g，研細(xì)，精密稱定，置25ml具塞比色管中，加氯仿10ml，超聲萃取30min，放冷，搖勻，將氯仿轉(zhuǎn)移至小燒杯中，殘渣再分別加10ml氯仿提取2次，轉(zhuǎn)移至燒杯中，用氮氣吹至近干，3ml甲醇溶解，作為樣品提取液。

2.4 固相萃取方法 取固相小柱，分別用3ml甲醇和3ml 0.1mol/l乙酸溶液活化。將樣品提取液加入固相柱，流速為1ml/min，用3ml 0.1mol/l乙酸溶液淋洗，用3ml 10% 氨化甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，氮氣吹至近干，加 1ml甲醇定容，以備測定。

2.5 色譜條件 流動相為 0.1% 甲酸溶液（A）-甲醇（B）梯度洗脫：0～3min，35%～38%B；3～5min，38%～39%B；5～16min，39%～40%B；16～17min，40%～65%B；17～19min，65%B；19～19.5min，65%～35%B；19.5～25min，35%B。流速：0.25ml/min；柱溫35℃。

2.6 質(zhì)譜條件 電噴霧正離子，MRM多反應(yīng)監(jiān)測掃描；氣簾氣，離子源霧化氣，離子源輔助加熱氣，分別設(shè)定為25、55、55，噴霧電壓為5500V，加熱器溫度為550℃，接口加熱器打開。

2.7 樣品測定 取固相萃取凈化后的樣品及加標(biāo)樣品溶液，進(jìn)樣量為1μl，照優(yōu)化好的液相、質(zhì)譜方法條件進(jìn)行測定。

3 結(jié)果

3.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化 分別用甲醇將8種對照品儲備液稀釋成約為1μg/ml的對照溶液，直接注射進(jìn)樣方式進(jìn)樣，分別掃描各對照品母離子Q1 和子離子Q3，優(yōu)化離子質(zhì)荷比、去簇電壓、碰撞電壓等參數(shù)，選用三個離子對作為定量和定性離子，建立8種藥物混標(biāo)的質(zhì)譜檢測方法。各成分優(yōu)化結(jié)果見表1。

3.2 色譜條件優(yōu)化 采用等度洗脫，后出峰的峰變寬，使方法靈敏度變低，檢出限變高。采用梯度洗脫，同一梯度內(nèi)，所有峰的峰寬是一致的。洗脫梯度大，則勞拉西泮和三唑侖無法完全分離，見圖1。采用增加水相比例，降低梯度的方式，使二者有效分離開來。液相條件優(yōu)化后，8種藥物總離子流色譜圖，見圖2。

3.3 固相萃取條件優(yōu)化 如果樣品只用甲醇溶解，則上樣后勞拉西泮有部分隨甲醇流出，見圖3。用超純水淋洗，則淋洗液中也會帶出氯硝西泮和勞拉西泮，見圖4。用5%氨化甲醇洗脫，有部分奧沙西泮和勞拉西泮殘留在柱子里，見圖5。本文優(yōu)化了條件，采用甲醇和0.1mol/L的乙酸溶液進(jìn)行活化，用3ml 0.1mol/L乙酸溶液淋洗。各成分回收率均大于95%，見圖6。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取混合對照品溶液逐級稀釋，照上述液質(zhì)聯(lián)用條件測定。按S/N=3，計算各成分檢出限；同一濃度連續(xù)進(jìn)5針，計算保留時間及峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，評價精密度；系列各濃度平行進(jìn)樣2針，以峰面積對濃度做線性回歸，得回歸方程和相關(guān)系數(shù)，見圖7。

3.5 樣品的測定 取樣品3g，按上述條件處理上機(jī)測定，計算回收率，見圖8。將各成分所得參數(shù)統(tǒng)計，結(jié)果見表2。

4 討論

C8/BCX為陽離子混合型固相萃取柱，所檢測物質(zhì)為弱堿性，使樣品成酸性，使被檢測物帶 H+，有利于和固相柱的苯磺酸離子結(jié)合，洗脫液呈堿性，則有利于置換出目標(biāo)物質(zhì)。研究建立的實驗方法，提取完全、凈化干凈、檢出限低，定量定性準(zhǔn)確，能有效用于開展該類藥物中非法添加這幾種化學(xué)物質(zhì)的監(jiān)督檢驗。

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（收稿日期：2016.04.21）