白頭翁皂苷抗小鼠血吸蟲(chóng)病肝纖維化的試驗(yàn)

陳巖勤 高秀麗 諸葛洪祥 楊世林 李笑然 楊盛剛

摘要 [目的]研究白頭翁皂苷經(jīng)腹腔注射給藥對(duì)血吸蟲(chóng)病肝纖維化的作用機(jī)制。[方法]將30只C57BL/6雌性小鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和白頭翁皂苷組，每組10只。血吸蟲(chóng)感染40條尾蚴6周后，陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射0.9%生理鹽水，白頭翁皂苷組腹腔注射白頭翁皂苷注射液。感染8周后，檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）及天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）含量;稱取小鼠體重及肝重;免疫組化觀察肝組織α-SMA表達(dá)。[結(jié)果]白頭翁皂苷組小鼠的體重、肝重、ALT及AST含量與陽(yáng)性對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，白頭翁皂苷組肝臟α-SMA表達(dá)明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組。[結(jié)論]白頭翁皂苷經(jīng)腹腔注射給藥可明顯減輕日本血吸蟲(chóng)病所引起的肝纖維化程度。

關(guān)鍵詞 白頭翁皂苷;肝纖維化;丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶;天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶;α-平滑肌肌動(dòng)蛋白

中圖分類號(hào) S567文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）14-0181-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.14.053

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract [Objective]The research aimed to study the effects of total saponins of pulsatilla against liver fibrosis in mice infected with Schistosoma japonicum. [Method]Thirty C57BL/6 female mice were randomly divided evenly into negative control group， positive control group and Pulsatilla saponin group. After positive control group and Pulsatilla saponin group infected with 40 S.japonicum cercariae for 6 weeks， the negative control group and the positive control group were intraperitoneally injected with 0.9% normal saline， and the Pulsatilla saponin group were intraperitoneally injected with Pulsatilla saponin. After 8 weeks of infection， The serum of all mice were measured the value of ALT and AST;body weight and liver weight of the mice were weighed;αSMA expression was observed by immunohistochemistry. [Result] The body weight， liver weight， ALT and AST content of the pulsatilla saponin group were significantly different from those of the positive control group. The expression of αSMA in the liver of the pulsatilla saponin group was significantly lower than that of the positive control group. [Conclusion] The pulsatilla saponin by intraperitoneal injection can significantly reduce the degree of liver fibrosis caused by Schistosoma japonicum.

Key words Pulsatilla saponin;Hepatic fibrosis;ALT;AST;αSMA

作者簡(jiǎn)介 陳巖勤（1972—），女，河南南陽(yáng)人，副教授，博士，從事感染與免疫方向的研究。*通信作者，副教授，博士，從事藥物分析研究。

收稿日期 2019-03-04;修回日期 2019-03-21

血吸蟲(chóng)病是一種慢性蟲(chóng)卵肉芽腫的免疫病理反應(yīng)，沉積于肝微血管內(nèi)的大量蟲(chóng)卵以及宿主對(duì)蟲(chóng)卵的炎癥反應(yīng)和纖維化為血吸蟲(chóng)病的主要病變[1]。目前治療血吸蟲(chóng)病的有效藥物是吡喹酮，但經(jīng)過(guò)殺蟲(chóng)治療后，肝組織中的沉積蟲(chóng)卵繼續(xù)釋放蟲(chóng)卵可溶性抗原激活一系列導(dǎo)致肝臟病變的信號(hào)通路，使肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫持續(xù)出現(xiàn)并誘導(dǎo)肝纖維化[2]。在肝纖維化過(guò)程中肝星狀細(xì)胞由靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，膠原蛋白分泌增多，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）合成增多，肝臟損傷的同時(shí)調(diào)動(dòng)多種與免疫相關(guān)細(xì)胞的應(yīng)答以及細(xì)胞間的浸潤(rùn)，加速肝纖維化的發(fā)生[3]。臨床上丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）常作為觀察肝病患者疾病發(fā)展及預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)，是檢測(cè)肝功能最敏感的指標(biāo)之一，在一定程度上作為肝纖維化的診斷、治療的動(dòng)態(tài)變化的參考[4]。

白頭翁為毛茛科植物白頭翁的干燥根，作為中藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性寒，味苦，具有清熱解毒、涼血止痢、燥濕殺蟲(chóng)的功效[5];尚有文獻(xiàn)報(bào)道其在抗腫瘤[6-9]、抗病毒[10]等方面的藥理作用;路西明等[11]研究發(fā)現(xiàn)白頭翁對(duì)異煙肼和利福平引起的血清ALT升高有對(duì)抗作用，且能對(duì)抗藥物引起的肝細(xì)胞死亡，具有保肝作用。因此探索白頭翁皂苷在干預(yù)血吸蟲(chóng)肝纖維化發(fā)展進(jìn)程中的作用，期望從白頭翁皂苷對(duì)血吸蟲(chóng)病所致的肝纖維化著手來(lái)研究其作用機(jī)制，為肝纖維化的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和釘螺

C57BL/6小鼠，雌性，由蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重18～20 g;陽(yáng)性釘螺（O.hupensis）購(gòu)自江蘇省血吸蟲(chóng)病防治研究所。

1.2 藥品試劑及儀器

白頭翁皂苷由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院楊世林教授課題組提供;0.9%生理鹽水購(gòu)自江蘇四環(huán)生物股份有限公司;ALT、AST試劑盒購(gòu)自南京建成生物技術(shù)公司;20 mg/mL 白頭翁皂苷注射液用無(wú)菌生理鹽水溶解200 mg PRS定容至100 mL經(jīng)無(wú)菌抽濾后分裝4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。?SMA一抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;二抗免疫組化試劑盒購(gòu)自上海基因科技有限公司;XD-811半自動(dòng)生化分析儀為上海迅達(dá)醫(yī)療儀器有限公司產(chǎn)品;德國(guó)Leica公司產(chǎn)UC6病理切片機(jī)。

1.3 方法

用去氯水25 ℃浸泡釘螺白熾燈下照射逸出尾蚴。將30只小鼠隨機(jī)平均分為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、白頭翁皂苷組，采用腹部貼片法感染尾蚴40條;感染6周后，白頭翁皂苷組每日按劑量200 mg/kg腹腔注射白頭翁皂苷藥物，陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組按0.02 mL/g容量給小鼠腹腔注射生理鹽水。8周后，禁食12 h，小鼠眼眶靜脈叢采血，離心，取血清測(cè)定ALT、AST含量;取肝臟稱重，并取左葉組織1 cm3置入10%中性甲醛溶液中，4 ℃冰箱中固定24 h制作石蠟切片用于免疫組化檢測(cè)α-SMA表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)用±S表示，利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組件比較利用t檢驗(yàn)評(píng)價(jià)，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體重及肝臟重量的變化

從表1可看出，經(jīng)過(guò)白頭翁皂苷治療后第8周末，陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組體重顯著降低（P<0.05）;白頭翁皂苷組比陽(yáng)性對(duì)照組體重升高顯著（P<0.05）;陽(yáng)性對(duì)照組肝重與陰性對(duì)照組相比顯著升高（P<0.05）;白頭翁皂苷組與陽(yáng)性對(duì)照組比較肝重下降顯著（P<0.05）。

2.2 血清ALT、AST含量的變化

從表2可看出，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠血清中ALT、AST含量均顯著高于陰性對(duì)照組（P<0.05）;白頭翁皂苷組小鼠血清中ALT、AST含量均顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組（P<0.05）。

2.3 小鼠肝臟免疫組化結(jié)果

肝臟α-SMA免疫組化顯示（圖1），陰性對(duì)照組少有α-SMA表達(dá);陽(yáng)性對(duì)照組α-SMA表達(dá)主要集中在蟲(chóng)卵內(nèi)部及周圍區(qū)域，著色明顯深于白頭翁皂苷組α-SMA的表達(dá)。

3 討論與結(jié)論

日本血吸蟲(chóng)感染小鼠引起肝臟纖維化的病理模型與人類血吸蟲(chóng)病肝纖維化極為相似，以此為研究對(duì)象研究開(kāi)發(fā)治療或逆轉(zhuǎn)肝纖維化的藥物具有重要的意義。有學(xué)者認(rèn)為肝纖維化可以逆轉(zhuǎn)，肝硬化不可逆轉(zhuǎn)，在血吸蟲(chóng)肝病的早期應(yīng)用抗纖維化的治療措施有利于肝纖維化的逆轉(zhuǎn)。該研究建立了血吸蟲(chóng)病肝纖維化小鼠模型，利用白頭翁皂苷腹腔給藥發(fā)現(xiàn)能夠顯著降低血吸蟲(chóng)病小鼠血清中ALT和AST的含量。而ALT和AST能夠敏感體現(xiàn)肝細(xì)胞膜損傷的程度，肝細(xì)胞膜損傷后會(huì)使ALT和AST進(jìn)入血液，從而使小鼠血清中AIT和AST升高。所以血清中ALT和AST數(shù)值的大小可以間接地反映出肝細(xì)胞受損的程度。試驗(yàn)結(jié)果顯示白頭翁皂苷能夠有效降低ALT和AST水平。肝星狀細(xì)胞活化是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，α-SMA表達(dá)是肝星狀細(xì)胞激活的標(biāo)志，其表達(dá)量直接與肝纖維化程度相關(guān)聯(lián)。通過(guò)對(duì)白頭翁皂苷對(duì)血吸蟲(chóng)病引起的肝纖維化的治療研究發(fā)現(xiàn)其能減弱肝纖維化的進(jìn)展，為其能夠成為治療肝纖維化藥物打下基礎(chǔ)。

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