扶正化瘀方抗肝纖維化的主要作用機制與效應物質(zhì)

趙志敏+劉成海

摘 要 扶正化瘀方是治療肝纖維化的有效中藥復方，本文綜述了扶正化瘀方抗肝纖維化的主要作用機制及其效應物質(zhì)，包括該方影響肝臟多種細胞的功能及細胞外基質(zhì)代謝，其入血成分、活性物質(zhì)及其組織分布代謝特征。

關鍵詞 扶正化瘀方 肝纖維化 作用機制 效應物質(zhì)

中圖分類號：R286 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533（2016）13-0013-04

The main mechanism and the substantial basis of FZHY recipe in the treatment of hepatic fibrosis*

ZHAO Zhimin1，2**， LIU Chenghai1，2，3***（1. Institute of Liver Diseases， Shuguang Hospital， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China； 2. Shanghai Key Laboratory of Traditional Chinese Clinical Medicine， Shanghai 201203， China； 3. E-institute of TCM Internal Medicine， Shanghai Municipal Education Commission， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Fuzheng Huayu recipe （FZHY） is an effective traditional Chinese medicine for the treatment of liver fibrosis.

This review summarizes the main mechanism and the substantial basis of FZHY recipe in the treatment of hepatic fibrosis， including its effects on the function of multiple types of cells in liver and extracellular matrix metabolism， the blood components and active substances and their characteristics of tissue distribution and metabolism.

KEY WORDS FZHY recipe； liver fibrosis； mechanism； substantial basis

肝纖維化的中醫(yī)基本病機為“正虛血瘀”，正虛主要表現(xiàn)為氣陰兩虛，血瘀則主要表現(xiàn)為瘀血阻絡。扶正化瘀方（制劑為扶正化瘀膠囊/片）立足于中醫(yī)“血瘀阻絡、正氣虧虛”的基本病機，由丹參、冬蟲夏草、桃仁、松花粉、絞股藍、五味子等6味中藥組成?？筛纳聘窝缀蟾斡不颊吒喂δ?、調(diào)整異常免疫功能和降低血清肝纖維化標志物水平等，對乙肝肝纖維化的組織學逆轉(zhuǎn)率達52%，且肝組織炎癥活動度也有明顯改善[1]?？贡胃卫w維化美國多中心Ⅱ期臨床試驗也顯示出該藥良好作用。對其主要作用機制與效應物質(zhì)，近年也有較多研究，歸納于下。

1 扶正化瘀方影響肝纖維化的作用機制

1.1 抑制肝星狀細胞活化

肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC）的活化是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)，其激活途徑包括肝細胞損傷后形成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物、胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）改變與肝庫普弗細胞等激活后分泌細胞因子的旁分泌刺激，以及星狀細胞活化后自身分泌細胞因子以刺激與維持細胞活化的自分泌作用，細胞因子以轉(zhuǎn)化生長因子-b1（transforming growth factor β1，TGF-b1）與血小板衍生生長因子bb（platelet derived growth factor-bb，PDGF-bb）作用尤為顯著。扶正化瘀方抑制纖維化大鼠肝組織a-平滑肌肌動蛋白（a-smooth muscle actin，a-SMA）表達，其藥物血清抑制正常傳代活化、體外PDGF-bb刺激活化與肝纖維化大鼠體內(nèi)活化的HSC增殖[2]，即抑制HSC活化，進一步研究發(fā)現(xiàn)其細胞分子藥理機制如下。

1）抑制HSC的自分泌活化 5%～20%扶正化瘀藥物血清能濃度依賴性抑制傳代活化HSC細胞內(nèi)外膠原生成率，尤其以抑制細胞外膠原分泌率最為顯著，并抑制I型膠原的分泌量及其I型前膠原mRNA表達[3]?；罨菭罴毎臈l件培養(yǎng)液可顯著促進靜止星狀細胞的增殖與I型膠原分泌，但經(jīng)藥物血清溫育條件培養(yǎng)液后，靜止星狀細胞的促細胞增殖與膠原生成作用則明顯減弱[4]。表明扶正化瘀方抑制活化星狀細胞的功能，并通過抑制其自分泌作用，阻斷活化的級聯(lián)反應，從而阻止肝纖維化的持續(xù)發(fā)展。

2）抑制庫普弗細胞的旁分泌 以CCl4誘導急性肝損傷大鼠模型，而后分離培養(yǎng)體內(nèi)激活的庫普弗細胞，繼以扶正化瘀方藥物血清溫育，結果發(fā)現(xiàn)藥物血清抑制庫普弗細胞（kupffer cell，KC）培養(yǎng)上清中TGF-b1與PDGF的活性，而且經(jīng)藥物血清作用后的KC培養(yǎng)上清對靜止星狀細胞的促增殖作用明顯減弱[5]。說明扶正化瘀方可通過抑制KC的激活及其旁分泌作用，而抑制星狀細胞的活化，從而發(fā)揮抗肝纖維化作用。

3）抑制纖維粘連蛋白（fibronectin， FN）/整合素信號途徑 肝損害早期FN增加可明顯促進HSC活化，而HSC激活后又可生成FN[6]，HSC與胞外基質(zhì)密切聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，扶正化瘀方可明顯抑制FN刺激的HSC增殖活化，抑制細胞的整合素蛋白的表達、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）磷酸化與黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）活性，從而干預整合素的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，干擾FN與HSC的相互聯(lián)系，抑制FN的促HSC增殖活化，而發(fā)揮抗肝纖維化作用。

1.2 保護肝細胞過氧化損傷與凋亡

損傷肝細胞是肝纖維化發(fā)生的病理啟動因素，防止肝細胞過氧化損傷與肝細胞凋亡是抗肝纖維化的重要環(huán)節(jié)。CCl4可導致明顯的肝臟脂質(zhì)過氧化損傷與肝纖維化，對于CCl4中毒肝纖維化大鼠，扶正化瘀方明顯減輕肝細胞變性壞死、促進肝功能恢復；顯著提高肝組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，降低丙二醛含量；且這些作用與降低肝組織羥脯氨酸含量，即抗肝纖維化作用呈相同趨勢[7]。并且扶正化瘀方可明顯抑制纖維化肝組織ERK1/2磷酸化水平與基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）2/9活性。二甲基亞硝胺（dimethylnitrosamine，DMN）化學中毒也可通過脂質(zhì)過氧化途徑導致肝纖維化[8]，扶正化瘀方對該模型也有良好的抗肝臟脂質(zhì)過氧化與肝纖維化作用。

體外分離培養(yǎng)正常大鼠肝細胞，經(jīng)CCl4刺激損傷，同時以扶正化瘀方藥物血清溫育細胞48 h，結果該含藥血清明顯促進體外損傷肝細胞的功能恢復。采用脂多糖誘導的肝細胞凋亡小鼠模型與體外誘導肝細胞凋亡模型，扶正化瘀方及其藥物血清可明顯抑制整體動物與培養(yǎng)肝細胞的凋亡，其作用機制與調(diào)節(jié)凋亡/抗凋亡因子、抑制半胱氨酸3活性等有關。提示抗肝細胞凋亡是扶正化瘀方抗肝纖維化的重要作用機制之一[9]。

1.3 調(diào)節(jié)肝臟細胞胞外基質(zhì)代謝與血管新生

纖維化時，肝臟細胞胞外基質(zhì)代謝與血管新生密切相關。在肝竇毛細血管化大鼠模型中，肝臟間質(zhì)性MMP13蛋白表達與活性明顯下降，纖溶酶酶原激活劑的抑制物-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）表達增加，酶活性抑制物金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）表達上升；門脈壓力升高，肝竇內(nèi)皮失窗孔與基底膜連續(xù)化。扶正化瘀方可明顯減少PAI-1與TIMP1、TIMP2蛋白表達，提高MMP13活性水平；降低血清透明質(zhì)酸水平與減輕內(nèi)皮細胞損傷，改善肝竇毛細血管化，減輕門脈壓力[10]。進一步以具有抗肝纖維化作用的血管新生抑制劑索拉非尼為對照，觀察扶正化瘀方對纖維化肝臟血管新生的作用，并圍繞血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路、MMP2/9活性變化、肝星狀細胞活化與肝竇內(nèi)皮細胞去分化等探討相關作用機制，結果發(fā)現(xiàn)，扶正化瘀方與索拉非尼能明顯減輕小鼠肝纖維化，同時，血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）與血小板-內(nèi)皮細胞黏附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31）陽性表達的微血管數(shù)量明顯減少，該方能夠抑制纖維化肝臟的肝竇內(nèi)皮失窗孔和連續(xù)性基底膜形成，提示有抑制肝竇內(nèi)皮細胞去分化作用。內(nèi)皮下基底膜降解是血管新生的生化基礎，缺氧誘導因子1a（hypoxia inducible factor-1a，HIF-1a）調(diào)節(jié)的VEGF/MAPK信號通路是其重要分子機制，扶正化瘀方能夠抑制肝臟MMP2/9活性，減少HIF-1a表達，抑制VEGF及其受體表達，下調(diào)ERK-1/2磷酸化。結果說明扶正化瘀方具有抑制肝纖維化小鼠的肝血管新生作用，該作用是其發(fā)揮抗肝纖維化效應的重要原因[11]。

1.4 調(diào)節(jié)纖維化肝臟差異表達的蛋白質(zhì)組、mRNAs與miRNAs

以CCl4大鼠肝纖維化模型作為研究對象，對肝纖維化過程中血漿蛋白質(zhì)組表達的研究發(fā)現(xiàn)了10個明顯差異表達的蛋白質(zhì)，其中8個蛋白在肝硬化大鼠血漿中表達減少，扶正化瘀方干預后表達增加，另外2個蛋白則相反，其機制涉及促進蛋白質(zhì)合成、抗氧化、調(diào)控細胞增殖和轉(zhuǎn)化等多方面[12]。在以DMN誘導的大鼠肝纖維化模型肝組織中發(fā)現(xiàn)了12個與纖維生成有關的蛋白，其中8個受扶正化瘀調(diào)控，與調(diào)控新陳代謝和應激反應相關蛋白及肌成纖維細胞活化相關[13]。

采用基因表達譜分析法，對CCl4誘導的大鼠肝纖維化模型發(fā)現(xiàn)，扶正化瘀方對肝纖維化組織的差異基因數(shù)量為397個，其中上調(diào)的有195個，下調(diào)的有202個；富集的GO功能共有160條，參與調(diào)節(jié)的信號通路有17條，主要從調(diào)控纖維母細胞、上皮細胞增殖等信號通路改善CCl4誘導的大鼠肝纖維化病變[14]。應用miRNAs芯片分析扶正化瘀對CCl4纖維化小鼠肝臟miRNAs表達譜，篩選出3個扶正化瘀調(diào)控的miRNAs；信號通路分析等共得到32條這些miRNAs可能調(diào)控的信號通路，其中三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）酶活性調(diào)節(jié)、細胞連接、凋亡調(diào)節(jié)、Ras蛋白信號轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)及小GTP酶活性調(diào)節(jié)等與肝纖維化密切相關[15]。

2 扶正化瘀方抗肝纖維化的主要藥效物質(zhì)基礎

圍繞扶正化瘀方的主要藥效藥物，曾發(fā)現(xiàn)該方劑的幾種抗肝纖維化成分，包括桃仁中的苦杏仁苷、丹參中丹酚酸B與蟲草菌絲中的蟲草組分等?？嘈尤受湛娠@著抑制肝星狀細胞的增殖與膠原生成，與蟲草菌絲合用可顯著改善血吸蟲病患者的肝纖維化病理，苦杏仁苷單用對肝纖維化模型大鼠也有良好的改善作用[16]。其中丹酚酸B可顯著改善慢乙肝肝纖維化患者的肝纖維化[17]，可抗肝細胞過氧化損傷、抑制肝星狀細胞活化，尤其是調(diào)節(jié)肝星狀細胞內(nèi)TGF-b1/Smads的信號轉(zhuǎn)導[18]。

扶正化瘀方為口服給藥，其有效物質(zhì)多以血液為介質(zhì)發(fā)揮作用，因而扶正化瘀方中被吸收入血的成分可能是其體內(nèi)效應物質(zhì)的關鍵所在?；诖?，我們采用液相譜/電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC/ESI-MS）技術，檢測扶正化瘀方口服給藥大鼠血清中的藥物成分，共鑒定和推斷了60多種入血成分[19]。進一步采用多種培養(yǎng)細胞、斑馬魚、與小鼠大鼠模型，評價入血成分的抗肝纖維化活性，發(fā)現(xiàn)部分活性成分，包括丹酚酸B、原兒茶醛、咖啡酸、丹參素鈉、丹酚酸A、迷迭香酸、隱丹參酮、腺苷、五味子甲素、五味子丙素、五味子酯甲等。采用UHPLC–MS/MS技術，比較扶正化瘀在正常和DMN纖維化大鼠藥代動力學及組織分布特點發(fā)現(xiàn)，模型大鼠給予扶正化瘀口服后在藥代動力學和組織分布中有明顯差異。4種扶正化瘀來源的生物活性成分丹參素鈉、丹酚酸B和迷迭香酸在模型大鼠中分別升高1.49、3.31和2.37倍；丹參素鈉、丹酚酸B、苦杏仁苷主要分布在肺、腎組織，這3種物質(zhì)在纖維化肝臟中分布明顯低于正常大鼠[20]。在此基礎上嘗試以方劑學君臣佐使理論為指導，結合現(xiàn)代實驗技術評價方法，形成了新的組分成分復方，并經(jīng)DMN肝纖維模型初步驗證，該組分復方具有抗肝纖維化療效[21]。

3 結語

綜上所述，扶正化瘀方抗肝纖維化作用機制主要在于抑制肝星狀細胞活化；改善肝細胞過氧化損傷與肝細胞凋亡；抑制細胞外基質(zhì)代謝與抑制肝血管新生等。對該方入血成分通過采用多細胞多模型綜合篩選，發(fā)現(xiàn)了其效應物質(zhì)，并從細胞、器官、整體等不同水平進行活性評價，結合中醫(yī)方劑理論以血管新生為靶點，形成了新的組分復方并初步驗證其有效性。這些研究實踐表明，堅持中醫(yī)理論指導，結合傳統(tǒng)及臨床經(jīng)驗擇方用藥，按照循證醫(yī)學的基本要求進行臨床試驗研究，是探索中醫(yī)藥治療難治性疾病的有效途徑之一。而結合現(xiàn)代生命科學理論與技術，是發(fā)現(xiàn)有效中藥制劑作用原理與物質(zhì)基礎的重要方法。

參考文獻

[1] Liu CH， Hu YY， Xu LM， et al. Effect of Fuzheng Huayu formula and its actions against liver fibrosis[J/OL]. Chin Med， 2009， 4：12. doi： 10.1186/1749-8546-4-12.

[2] 姜春萌， 劉成海， 劉成. 扶正化瘀膠囊對肝星狀細胞激活的干預[J]. 中國中西醫(yī)結合消化雜志， 2003， 11（5）： 280-283.

[3] 劉成海， 王曉玲， 劉平等. 扶正化瘀319方藥物血清對肝星狀細胞Ⅰ型膠原及轉(zhuǎn)化生長因子b1表達的影響[J]. 中國中西醫(yī)結合雜志， 1999， 19（7）： 412-414.

[4] 姜春萌， 劉成. 扶正化瘀方對大鼠肝星狀細胞旁分泌與自分泌活化途徑的干預[J]. 上海中醫(yī)藥大學學報， 2002， 16（2）： 51-53.

[5] 劉成， 姜春萌， 劉平. 扶正化瘀方對大鼠肝星狀細胞旁分泌活化途徑的抑制作用[J]. 中華消化雜志， 2001， 21（6）： 367-369.

[6] 劉成海， 宣紅萍， 陶艷艷， 等. 基于FN/整合素信號途徑探討扶正化瘀方抑制肝星狀細胞活化的作用機制[J]. 上海中醫(yī)藥雜志， 2008， 42（1）： 3-7.

[7] 胡義揚， 劉成， 劉平， 等. 扶正化瘀方抗CCl4大鼠肝纖維化作用與抗脂質(zhì)過氧化[J]. 新消化病學雜志， 1997， 5（8）： 485-486.

[8] 劉成海， 陳文慧， 劉平， 等. 二甲基亞硝胺致大鼠脂質(zhì)過氧化變化與藥物干預作用[J]. 中華肝臟病雜志， 2001， 9（S）： 18-20.

[9] 周滔， 閆秀川， 陳倩， 等. 扶正化瘀方對實驗性急性肝損傷肝細胞凋亡的影響[J]. 藥品評價， 2008， 5（5）： 204-208.

[10] 陸雄， 劉平， 劉成海， 等. 扶正化瘀方促進二甲基亞硝胺肝纖維化大鼠肝竇毛細血管化逆轉(zhuǎn)作用的實驗研究[J]. 中醫(yī)雜志， 2003， 44（2）： 136-139.

[11] Lv J， Wang QL， Tao YY， et al. The mechanism and active components of Fuzheng Huayu decoction action against liver fibrosis relating to angiogenesis [J]. Hepatology， 2011， 54（suppl）： 749A-750A.

[12] 劉杰. 肝硬化模型比較蛋白質(zhì)組學研究及扶正化瘀方對血漿蛋白質(zhì)組影響[D]. 上海： 復旦大學， 2007.

[13] Xie HD， Tao YY， Lv J， et al. Proteomic analysis of the effect of fuzheng huayu recipe on fibrotic liver in rats [J/ OL]. Evid Based Complement Alternat Med， 2013， doi： 10.1155/2013/972863.

[14] 董姝， 陳啟龍， 馮琴， 等. 基于基因表達譜分析扶正化瘀方改善大鼠肝纖維化的分子機制[J]. 中華中醫(yī)藥雜志， 2015， 30（5）： 1812-1817.

[15] 王清蘭， 陶艷艷， 呂靖， 等. 扶正化瘀方調(diào)節(jié)差異微小RNAs表達的抗肝纖維化的作用機制[J]. 臨床肝膽病雜志， 2016， 32（3）： 503-508.

[16] 徐列明， 劉平， 劉成， 等. 桃仁提取物抗實驗性肝纖維化的作用觀察[J]. 中國中藥雜志， 1994， 19（8）： 491-494.

[17] Liu P， Hu YY， Liu C， et al. Clinical observation of salvianolic acid B in treatment of liver fibrosis in chronic hepatitis B [J]. World J Gastroenterol， 2002， 8（4）： 679-685.

[18] 劉成海， 劉平， 胡義揚， 等. 丹酚酸B鹽對轉(zhuǎn)化生長因子-β1刺激肝星狀細胞活化與胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的作用[J]. 中華醫(yī)學雜志， 2002， 82（18）： 1267-1272.

[19] 沈丹萍， 楊莉， 陶艷艷， 等. HPLC-MSn分析扶正化瘀方中五味子的入血成分[J]. 中國中藥雜志， 2011， 36（7）： 854-858.

[20] Yang T， Liu S， Wang CH， et al. Comparative pharmacokinetic and tissue distribution profiles of four major bioactive components in normal and hepatic fibrosis rats after oral administration of Fuzheng Huayu recipe [J]. J Pharm Biomed Anal， 2015， 114： 152-158.

[21] 呂靖， 譚燁， 趙志敏， 等. 扶正化瘀組分復方抑制血管新生的抗肝纖維化作用機制[J]. 世界中醫(yī)藥， 2015， 10（2）： 186-191.