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    腹腔致敏途徑下的大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)影響因素研究

    2019-08-27 08:11:20王功霞
    食品與藥品 2019年4期
    關(guān)鍵詞:弗氏皮膚過敏佐劑

    王 萍,王功霞,曹 沖*

    (1.山東醫(yī)藥技師學(xué)院,山東 泰安 271016;2.山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省化學(xué)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 濟(jì)南250101)

    被動皮膚過敏試驗(yàn)是《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[1]規(guī)定的檢測注射劑藥物過敏性的試驗(yàn)方法之一,通常選用大鼠為試驗(yàn)動物,陽性對照組給予牛血清白蛋白或卵白蛋白或已知致敏陽性物質(zhì),致敏給藥方法可選擇靜脈、腹腔或皮下注射液等,共給藥3~5次,末次致敏后第10~14天制備致敏血清。

    研究發(fā)現(xiàn)[2-5],以卵白蛋白為致敏原進(jìn)行大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)時(shí),加入佐劑條件下動物對抗原更為敏感,免疫效果較好,常用的佐劑為氫氧化鋁凝膠佐劑,但配制方法較繁瑣,對pH值要求較高。大鼠抗體產(chǎn)生階段,致敏給藥方法多選用皮下注射,由于佐劑的吸收速度慢,導(dǎo)致皮下注射后易形成腫塊,且有些受試物臨床給藥途徑明確指出禁止皮下給藥。針對以上問題,本試驗(yàn)以卵白蛋白為致敏原,佐劑選擇Sigma公司生產(chǎn)的油佐劑──弗氏完全佐劑,致敏給藥方法選擇腹腔注射,研究不同給藥劑量,不同致敏次數(shù),末次致敏后不同制備血清時(shí)間等因素條件對大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)免疫應(yīng)答結(jié)果的影響。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器

    ACS-JJ-Tiger電子計(jì)價(jià)秤(梅特勒-托利多);ME204E電子天平(梅特勒-托利多)。

    1.2 試劑

    卵白蛋白(批號:326A052,Sigma公司);0.9 %氯化鈉注射液(批號:1C16101307,山東齊都藥業(yè));弗氏完全佐劑(批號SLBM2183V,Sigma公司)。

    1.3 動物

    SD大鼠,SPF級,體重100~200 g,雌雄各48只,北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供,實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016-0006,動物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境動物實(shí)驗(yàn)設(shè)施。試驗(yàn)在屏障環(huán)境動物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號SYXK(魯)20140008,動物房溫度20~26 ℃,濕度40 %~70 %。

    2 方法

    2.1 分組、致敏與致敏血清制備

    96只大鼠隨機(jī)分為16組,每組6只,2只用于抗血清制備,4只用于被動激發(fā)。將卵白蛋白溶液與弗氏完全佐劑按1:1比例混勻,1,2,5,6,9,10組大鼠于第1,3,5天分別腹腔注射給予致敏物與佐劑混合物1 ml,各組均致敏3次;3,4,7,8,11,12組大鼠于第1,3,5,7,9天分別腹腔注射給予相同混合物1 ml,各組均致敏5次。陰性對照組大鼠給予0.9 %氯化鈉注射液與弗氏完全佐劑的混合物,13、14組致敏3次,15,16組致敏5次。末次致敏后第10天或第14天,大鼠以1 %戊巴比妥鈉麻醉(50 mg/kg,腹腔注射)后腹主動脈采血,血液樣本在室溫下1500 r/min離心10 min。取上清,將每組動物的抗血清混合。

    表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    2.2 被動致敏及激發(fā)

    各組制備好的抗血清用0.9 %氯化鈉注射液稀釋成不同濃度,分別為原液、1:2,1:4,1:8。采用10 mg/ml丙泊酚,按10 mg/kg尾靜脈注射麻醉大鼠,在距離脊柱約1.5 cm處背部脫毛,脫毛區(qū)域約5 cm×6 cm。在脫毛區(qū)域旁,按一定方向皮內(nèi)注射各對應(yīng)組的不同稀釋度抗血清0.1 ml。24 h后分別靜脈注射與致敏劑量相同的激發(fā)抗原加等量0.5 %伊文思藍(lán)染料共1 ml[6]。

    2.3 藍(lán)斑測定

    激發(fā)后約30 min用3 %戊巴比妥鈉麻醉(90 mg/kg,腹腔注射)處死動物,測量背部皮膚藍(lán)斑直徑,以長徑與短徑的平均值作為藍(lán)斑直徑。

    2.4 數(shù)據(jù)處理

    3 結(jié)果

    3.1 3次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)結(jié)果(第10天制備致敏血清)

    13組:采用0.9 %氯化鈉注射液3次致敏,末次致敏后第10天制備血清,4只動物均未出現(xiàn)藍(lán)斑。

    1,5,9組:卵白蛋白劑量為5 mg/只時(shí),4只動物在原液、1:2注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑,藍(lán)斑直徑均大于5 mm,陽性反應(yīng)率為100 %;4只動物在1:4注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑,3只動物藍(lán)斑直徑大于5 mm,陽性反應(yīng)率為75 %;2只動物在1:8注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑,1只動物藍(lán)斑直徑大于5 mm,陽性反應(yīng)率為25 %。卵白蛋白劑量為10,20 mg/只時(shí),各組均有4只動物在原液、1:2、1:4、1:8注射點(diǎn)均出現(xiàn)藍(lán)斑,且藍(lán)斑直徑均大于5 mm,陽性反應(yīng)率為100 %。見表2。

    表2 3次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)結(jié)果(第10天制備致敏血清,)

    表2 3次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)結(jié)果(第10天制備致敏血清,)

    注:n代表陽性反應(yīng)動物數(shù),N代表動物總數(shù)

    卵白蛋白+弗氏完全佐劑(1:8)n/N 藍(lán)斑直徑/mm n/N 藍(lán)斑直徑/mm n/N 藍(lán)斑直徑/mm n/N 藍(lán)斑直徑/mm 1 5 4/4 14.19±3.08 4/4 8.68±1.99 3/4 6.90±2.78 1/4 2.86±3.29 5 10 4/4 17.18±1.97 4/4 10.00±1.77 4/4 8.35±2.10 4/4 6.44±1.10 9 20 4/4 19.17±2.09 4/4 13.69±2.32 4/4 10.21±1.71 4/4 6.50±1.03 13 - 0/4 0 0/4 0 0/4 0 0/4 0組別 劑量/mg·只-1原液 卵白蛋白+弗氏完全佐劑(1:2)卵白蛋白+弗氏完全佐劑(1:4)

    3.2 3次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)結(jié)果(第14天制備致敏血清)

    14組:采用0.9 %氯化鈉注射液3次致敏,末次致敏后第14天制備血清,4只動物均未出現(xiàn)藍(lán)斑。

    2,6,10組:卵白蛋白劑量為5 mg/只時(shí),4只動物在原液、1:2注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑,陽性反應(yīng)率為100 %;2只動物在1:4注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑,陽性反應(yīng)率為50 %;1只動物在1:8注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑,陽性反應(yīng)率為25 %。卵白蛋白劑量為10,20 mg/只時(shí),各組均有4只動物在原液、1:2注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑,陽性反應(yīng)率為100 %;3只動物在1:4注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑,陽性反應(yīng)率為75 %;2只動物在1:8注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑,陽性反應(yīng)率為50 %。見表3。

    表3 3次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)結(jié)果(第14天制備致敏血清,)

    表3 3次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)結(jié)果(第14天制備致敏血清,)

    注:n代表陽性反應(yīng)動物數(shù),N代表動物總數(shù)

    卵白蛋白+弗氏完全佐劑(1:8)n/N 藍(lán)斑直徑/mm n/N 藍(lán)斑直徑/mm n/N 藍(lán)斑直徑/mm n/N 藍(lán)斑直徑/mm 2 5 4/4 12.93±2.92 4/4 9.82±1.53 2/4 3.72±4.00 1/4 1.29±2.39 6 10 4/4 14.23±3.70 4/4 10.87±1.20 3/4 6.78±4.50 2/4 3.60±4.03 10 20 4/4 16.06±3.33 4/4 11.06±1.24 3/4 6.54±4.23 2/4 3.71±4.07 14 - 0/4 0 0/4 0 0/4 0 0/4 0組別 劑量/mg·只-1原液 卵白蛋白+弗氏完全佐劑(1:2)卵白蛋白+弗氏完全佐劑(1:4)

    3.3 5次致敏后被動皮膚過敏試驗(yàn)結(jié)果(第10天大鼠制備致敏血清)

    15組:采用0.9 %氯化鈉注射液5次致敏,末次致敏后第10天制備血清,4只動物均未出現(xiàn)藍(lán)斑。

    3,7,11組:卵白蛋白劑量為5 mg/只時(shí),4只動物在原液、1:2注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑,陽性反應(yīng)率為100 %;3只動物在1:4注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑,陽性反應(yīng)率為75 %;1只動物在1:8注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑,陽性反應(yīng)率為25 %。卵白蛋白劑量為10 mg/只時(shí),4只動物在原液、1:2注射點(diǎn)均出現(xiàn)藍(lán)斑,陽性反應(yīng)率為100 %;3只動物在1:4注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑,陽性反應(yīng)率為75 %;1只動物在1:8注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑,陽性反應(yīng)率為25 %。卵白蛋白劑量為20 mg/只時(shí),4只動物在原液、1:2、1:4注射點(diǎn)均出現(xiàn)藍(lán)斑,陽性反應(yīng)率為100 %;2只動物在1:8注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑,陽性反應(yīng)率為50 %。見表4。

    表4 5次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)結(jié)果(第10天制備致敏血清,)

    表4 5次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)結(jié)果(第10天制備致敏血清,)

    注:n代表陽性反應(yīng)動物數(shù),N代表動物總數(shù)

    卵白蛋白+弗氏完全佐劑(1:8)n/N 藍(lán)斑直徑/mm n/N 藍(lán)斑直徑/mm n/N 藍(lán)斑直徑/mm n/N 藍(lán)斑直徑/mm 3 5 4/4 13.37±2.38 4/4 10.17±2.80 3/4 5.64±4.16 1/4 1.99±3.69 7 10 4/4 16.10±2.88 4/4 12.82±1.99 3/4 6.07±4.17 1/4 1.81±3.40 11 20 4/4 17.13±2.65 4/4 12.08±1.88 4/4 10.90±1.90 2/4 3.98±4.31 15 - 0/4 0 0/4 0 0/4 0 0/4 0組別 劑量/mg·只-1原液 卵白蛋白+弗氏完全佐劑(1:2)卵白蛋白+弗氏完全佐劑(1:4)

    3.4 5次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)結(jié)果(第14天制備致敏血清)

    16組:采用0.9 %氯化鈉注射液,5次致敏,末次致敏后第14天制備血清,4只動物均未出現(xiàn)藍(lán)斑。

    4,8,12組:卵白蛋白劑量為5,10,20 mg/只時(shí),各組均有4只動物在原液、1:2注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑,陽性反應(yīng)率為100 %;3只動物在1:4注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑,陽性反應(yīng)率為75 %;各組4只動物在1:8注射點(diǎn)均未出現(xiàn)藍(lán)斑。見表5。

    表5 5次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)結(jié)果(第14天制備致敏血清,)

    表5 5次致敏后大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)結(jié)果(第14天制備致敏血清,)

    注:n代表陽性反應(yīng)動物數(shù),N代表動物總數(shù)

    卵白蛋白+弗氏完全佐劑(1:8)n/N 藍(lán)斑直徑/mm n/N 藍(lán)斑直徑/mm n/N 藍(lán)斑直徑/mm n/N 藍(lán)斑直徑/mm 4 5 4/4 13.25±2.06 4/4 9.74±1.35 3/4 5.92±3.82 0/4 0 8 10 4/4 15.40±2.40 4/4 11.41±1.83 3/4 6.67±4.20 0/4 0 12 20 4/4 17.09±1.71 4/4 13.11±1.60 3/4 8.18±5.12 0/4 0 16 - 0/4 0 0/4 0 0/4 0 0/4 0組別 劑量/mg·只-1原液 卵白蛋白+弗氏完全佐劑(1:2)卵白蛋白+弗氏完全佐劑(1:4)

    4 討論

    被動皮膚過敏試驗(yàn)中影響免疫應(yīng)答的因素很多,如動物種屬、致敏劑量、致敏次數(shù)、致敏途徑、抗血清制備時(shí)間、是否添加佐劑等。大鼠已被廣泛用于過敏性評價(jià)試驗(yàn)[9],SD大鼠是常用的非臨床研究用實(shí)驗(yàn)動物,有大量的生物學(xué)歷史數(shù)據(jù),動物免疫原性較強(qiáng),因此本研究選用SD大鼠進(jìn)行試驗(yàn)。王金華等[10]研究表明,以卵白蛋白為致敏原進(jìn)行大鼠被動皮膚試驗(yàn),在不加佐劑的條件下,激發(fā)后無藍(lán)斑出現(xiàn),結(jié)果為陰性,但在加弗氏完全佐劑的條件下,結(jié)果為陽性。不同佐劑對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響也不同,戴學(xué)棟等[11]使用3種佐劑比較了SD大鼠被動皮膚過敏的反應(yīng)程度,陽性反應(yīng)率和藍(lán)斑直徑從大到小依次為氫氧化鋁>百白破聯(lián)合疫苗>弗氏完全佐劑,加入佐劑時(shí),均能提高SD大鼠的敏感性,其中以氫氧化鋁效果最好。氫氧化鋁凝膠無市售成品,需自行配制[12],方法繁瑣,而弗氏佐劑為油性佐劑[13],無需配制,質(zhì)量穩(wěn)定,因此本試驗(yàn)致敏過程也選用弗氏完全佐劑,1:1與卵白蛋白混合后致敏。指導(dǎo)原則中,致敏給藥方法可選擇靜脈、腹腔或皮下注射等,共給藥3~5次,末次致敏后第10~14天制備致敏血清,大鼠抗體產(chǎn)生階段,致敏給藥方法多選用皮下注射[14-15],有些藥物說明書中明確說明禁止皮下給藥,因此本試驗(yàn)研究了腹腔注射致敏途徑下,不同致敏劑量(5,10,20 mg/只)、致敏次數(shù)(3次、5次)、不同抗血清制備時(shí)間(末次致敏后第10天、第14天)等因素對大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)的影響。

    結(jié)果表明,以卵白蛋白+弗氏完全佐劑作為抗原,卵白蛋白在5~20 mg/只劑量下,各組藍(lán)斑直徑與血清稀釋倍數(shù)呈遞減關(guān)系,藍(lán)斑直徑隨血清稀釋度的增加而減小,即原液注射點(diǎn)藍(lán)斑直徑最大,其他注射點(diǎn)依次減小。所有動物在原液、1:2注射點(diǎn)均出現(xiàn)藍(lán)斑,陽性反應(yīng)率為100 %,各組動物在1:4、1:8注射點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)斑動物例數(shù)及陽性反應(yīng)率不同,卵白蛋白10,20 mg/只劑量下的陽性反應(yīng)率高于卵白蛋白5 mg/只劑量,但20 mg/只劑量下的原液注射點(diǎn)藍(lán)斑直徑過大,邊緣不易區(qū)分,10 mg/只劑量下的各注射點(diǎn)藍(lán)斑邊緣清晰,較易區(qū)分。在卵白蛋白劑量相同,致敏次數(shù)及末次致敏后抗血清制備時(shí)間不同時(shí),各組在原液、1:2注射點(diǎn)陽性反應(yīng)率并無明顯區(qū)別,均為100 %,但在1:4,1:8注射點(diǎn)陽性反應(yīng)率存在差異,特別是5次致敏后第14天制備抗血清組,所有動物在1:8注射點(diǎn)均未出現(xiàn)藍(lán)斑。王沖等[16]研究發(fā)現(xiàn),致敏8 d與致敏12~14 d的藍(lán)斑直徑比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,各組藍(lán)斑直徑并無明顯區(qū)別;井中旭等[17]研究發(fā)現(xiàn),致敏效果與致敏次數(shù)不呈依賴關(guān)系,本研究結(jié)果也顯示致敏效果與致敏劑量相關(guān),與致敏次數(shù)并無遞增關(guān)系,末次致敏后第10天制備抗血清的陽性反應(yīng)要優(yōu)于末次致敏后第14天制備抗血清的陽性反應(yīng)。藍(lán)繼奎等[18]研究表明,使用豚鼠進(jìn)行被動皮膚試驗(yàn)試驗(yàn)時(shí),增加免疫次數(shù)能提高陽性反應(yīng)率,分析可能與動物種屬特異性有關(guān)。需要注意的是,大鼠腹腔注射致敏,由于佐劑的吸收速度慢,導(dǎo)致大鼠腹脹、腹腔內(nèi)腸黏膜粘連[10],體重增長緩慢,致敏期間應(yīng)密切關(guān)注動物狀態(tài)。

    綜上,大鼠被動皮膚過敏試驗(yàn),致敏途徑為腹腔注射給藥時(shí),推薦的方法為:SD大鼠連續(xù)隔日3次注射給予受試物與弗氏完全佐劑1:1混合乳液1 ml/只致敏,卵白蛋白致敏劑量10 mg/只,末次致敏后第10天取血制備抗血清??寡灏丛海?:2,1:4,1:8倍比稀釋,大鼠背部皮膚皮內(nèi)分別注射0.1 ml各濃度抗血清被動致敏,24 h后靜脈注射與致敏劑量相同抗原激發(fā)。

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