基于代謝組學(xué)的多西他賽調(diào)控肺癌細(xì)胞代謝重編程研究

孫海超 樸海龍 齊歡 顏敏 劉宏旭

肺癌不僅是中國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，也是全世界范圍內(nèi)病死率最高的惡性腫瘤[1]，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者約占肺癌患者總數(shù)的80%[2]。40%-50%的NSCLC患者在確診時已經(jīng)處于局部晚期或發(fā)生轉(zhuǎn)移，5年生存率僅為5%。多西他賽（Docetaxel，多西紫杉醇）屬于紫杉醇類，是一種微管穩(wěn)定劑[3]，通過穩(wěn)定微管蛋白質(zhì)，抑制微管解聚和腫瘤細(xì)胞有絲分裂，發(fā)揮其抗腫瘤作用，臨床上主要用于治療NSCLC、乳腺癌、前列腺癌和宮頸癌等[4]。目前，多西他賽是治療局部晚期或發(fā)生轉(zhuǎn)移的NSCLC患者的一線用藥[5]，其對順鉑治療產(chǎn)生耐藥性的患者也有效[6]。但是，多西他賽治療NSCLC的分子機(jī)制尚未完全闡明。

代謝物變化是對細(xì)胞所進(jìn)行生理活動的最直觀反應(yīng)，代謝物對研究細(xì)胞生理和病理機(jī)制具有重要意義，目前已鑒定出的生物體內(nèi)代謝物大于4萬個[7]。代謝組學(xué)是一種新興的研究方法，是對整個生物體系總的代謝物所進(jìn)行的全面定性定量研究[8]。其和基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)一起，成為系統(tǒng)生物學(xué)的重要研究方法。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用以其高分辨力、高通量和高靈敏度的優(yōu)勢，已成為代謝組學(xué)的主流研究技術(shù)之一?；跉庀嗌V-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS）技術(shù)的代謝組學(xué)方法在檢測糖酵解、三羧酸（tricarboxylic acid, TCA）循環(huán)、氨基酸和有機(jī)酸等代謝物中具有優(yōu)勢。并且，相對于其他代謝組學(xué)技術(shù)，GCMS技術(shù)較成熟、儀器更加穩(wěn)定、價格便宜[9]。

1922年瓦博格首次發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與糖酵解代謝異常密切相關(guān)。在氧氣充足的條件下，細(xì)胞大量攝取葡萄糖生成乳酸，激活相關(guān)信號通路和改變腫瘤微環(huán)境。相關(guān)研究表明，許多調(diào)控代謝的相關(guān)蛋白質(zhì)可以調(diào)控細(xì)胞凋亡的發(fā)生，同時某些調(diào)控細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)也在代謝通路中發(fā)揮信使作用。靶向腫瘤代謝治療的研究是基于代謝組學(xué)的方法，通過分析腫瘤異常代謝物和代謝通路，使用現(xiàn)有的生物化學(xué)技術(shù)合成新的靶向代謝的藥物，為治療腫瘤尋找新的突破點，為預(yù)防腫瘤尋找新的策略[10]。靶向腫瘤代謝的基本研究方法包括：①靶向代謝突變基因和激活的代謝基因；②回補(bǔ)腫瘤內(nèi)缺失的代謝基因；③靶向代謝通路重編程等。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 使用GCMS-QP 2010Plus系統(tǒng)進(jìn)行GC-MS代謝組學(xué)分析（日本島津公司）。自動進(jìn)樣器：AOC-20i autosampler（日本島津公司）。觀察細(xì)胞使用倒置顯微鏡（德國Leica公司）。Western blot分析使用Fusion Fx化學(xué)發(fā)光儀（法國VILBER公司）。CO2培養(yǎng)箱、96孔板、細(xì)胞培養(yǎng)皿等均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

超純水來自于Milli-Q水純化系統(tǒng)（美國Millipore公司）。40 mg/mL多西他賽（溶于吐溫80溶劑）購于齊魯制藥有限公司。甲氧胺鹽酸鹽、吡啶、二氯甲烷及N-甲基-N-（三甲基硅基）三氟乙酰胺（MSTFA）和十三酸均購自美國Sigma-Aldrich公司。色譜純甲醇購自德國Merck公司。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、青霉素鏈霉素液（penicillin-streptomycin, PS）、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline, PBS）、通用細(xì)胞凍存液和0.25%EDTA胰蛋白酶均購自美國Gibco公司。

人源NSCLC細(xì)胞A549和H1299購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，并使用含10%FBS及1%PS的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)在5%CO2、37 ℃恒溫孵箱中。細(xì)胞培養(yǎng)至密度為80%-90%時進(jìn)行傳代。

1.2 CCK-8測定細(xì)胞活力 活細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶可與細(xì)胞增殖及毒性檢測試劑（cell counting kit-8, CCK-8）反應(yīng)變橙色。使用96孔板培養(yǎng)細(xì)胞，消化處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，96孔板每孔接種3,000-5,000個細(xì)胞，24 h后A549和H1299細(xì)胞按照梯度0.3 nM、1 nM、3 nM、10 nM、30 nM、100 nM、300 nM、1,000 nM處理多西他賽，平行設(shè)置三個對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，吸取上清后每孔按照1:9（CCK-8:培養(yǎng)基）加入CCK-8試劑100 μL，培養(yǎng)2 h后使用酶標(biāo)儀（450 nm波長）測取并計算平均吸光度值A(chǔ)，細(xì)胞活力（%）=（A處理組-A空白組）/（A對照組-A空白組）。

1.3 蛋白質(zhì)免疫印跡分析 分別取對數(shù)生長期的A549和H1299細(xì)胞2×106個接種于4個10 cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿。24 h后分別在培養(yǎng)基中加入30 nM和100 nM的多西他賽，處理0 h、6 h、12 h和24 h。棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3次后。加入RIPA裂解液，刮下細(xì)胞，并將含細(xì)胞碎片的裂解液移至新離心管中。冰上裂解細(xì)胞1 h，每10 min渦旋一次。4 ℃，13,000g離心15 min，取上清。通過BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，等量蛋白質(zhì)加入蛋白質(zhì)上樣緩沖液后，97 ℃變性10 min。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離不同分子量大小的蛋白質(zhì)，再將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。室溫封閉1 h，4 ℃孵育一抗過夜。室溫孵育二抗1 h，加入顯影劑，化學(xué)發(fā)光成像儀檢測蛋白質(zhì)條帶。本研究所用一抗：Vinculin，購自美國Sigma-Aldrich公司，1:1,000稀釋使用；PARP、IDH1和IDH2均購自美國Proteintech公司，1:1000稀釋使用。

1.4 樣品提取及衍生 分別取對數(shù)生長期的A549和H1299細(xì)胞2×106個接種于10個10 cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿。24 h后，5組作為處理組分別加入藥物多西他賽30 nM（A549）或100 nM（H1299），5組作為對照組僅換液。藥物處理24 h后，棄去培養(yǎng)基，使用5 mL冷PBS緩沖液輕柔沖洗細(xì)胞兩次，立即液氮淬滅。加入含10 μg/mL十三酸的甲醇：水（4:1）1 mL，刮下細(xì)胞至（Eppendorf, EP）管中。渦旋兩次，每次1 min。4 ℃，13,000g離心15 min，取上清，真空干燥凍干機(jī)（美國Labconco公司）中凍干[11]。

取出凍干樣品，每個樣品加50 μL甲氧吡啶（20 mg/mL），渦旋60 s，37 ℃水浴肟化1.5 h。再加入40 μL MSTFA，渦旋30 s，37 ℃水浴，硅烷化1 h。4 ℃，13,000g離心15 min。棄去不溶顆粒沉淀，取上清行GC-MS分析[12]。

1.5 GC-MS條件 色譜條件：使用DB-5 MS（30 μm×250 μm×0.25 μm；美國J&W Scientific公司）毛細(xì)管柱；使用程序性升溫進(jìn)行分析，起始溫度為70 ℃，保持3 min后，以5 ℃/min速率升高溫度至300 ℃，保持10 min；接口溫度230 ℃；電離模式70 eV；進(jìn)樣量1 μL；載氣線性速度40.0 cm/s，恒流模式流速1.19 mL/min；采用全掃描模式；掃描范圍33 m/z-600 m/z。

針對當(dāng)前農(nóng)村小學(xué)生口語交際信心不足的現(xiàn)狀，教師應(yīng)當(dāng)在日常的教學(xué)活動中，加強(qiáng)和學(xué)生之間的溝通交流，樹立學(xué)生口語交際的自信心。首先，構(gòu)建和諧互動的課堂教學(xué)氛圍，在潛移默化中培養(yǎng)學(xué)生善于交際的能力。農(nóng)村小學(xué)語文教師要改變過去“一言堂”的教育模式，在課堂教學(xué)中積極和學(xué)生之間交流互動，形成融洽的交際氛圍，消除學(xué)生的心理障礙和畏難情緒；其次，針對個別自信心尤其不足的孩子，農(nóng)村小學(xué)語文教師要積極溝通，了解原因，積極鼓勵，幫助學(xué)生樹立信心，為培養(yǎng)學(xué)生的口語交際和表達(dá)能力奠定基礎(chǔ)。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析方法 GC-MS所獲取的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)（CDF格式）通過ChromaTOF 4.43軟件（美國LECO公司）進(jìn)行處理，結(jié)合數(shù)據(jù)庫及組內(nèi)標(biāo)樣，進(jìn)行代謝物定性。通過GC-MS solution軟件進(jìn)行代謝物積分定量。得到代謝物峰表后，使用SIMCA-P 11.0軟件（瑞典Umetrics公司）進(jìn)行偏最小二乘法判別分析，繪制PLS-DA得分圖，可視化組間聚集及離散程度。運(yùn)用統(tǒng)計學(xué)t檢驗方法（P＜0.05），得到對照組和多西他賽處理組的A549和H1299細(xì)胞差異代謝物。使用MeV熱圖軟件繪制差異代謝物熱圖，使用MetaboAnalyst 3.0在線軟件進(jìn)行通路富集分析，使用GraphPad Prism 5繪圖軟件制作柱狀圖。

2 結(jié)果

2.1 多西他賽對NSCLC細(xì)胞A549和H1299的抑制作用 為探討多西他賽對NSCLC增殖的影響，本實驗采用CCK-8試劑盒測定了多西他賽對A549和H1299細(xì)胞活力的作用。圖1A-圖1B為多西他賽8個濃度梯度和3個作用時間對A549和H1299細(xì)胞活力的影響。隨著多西他賽藥物濃度升高和作用時間延長，A549和H1299細(xì)胞活力下降，多西他賽對NSCLC的增殖抑制作用具有明顯的濃度和時間依賴性。

為探討多西他賽對NSCLC凋亡的作用。通過Western blot實驗，測定多西他賽作用A549和H1299細(xì)胞0 h、6 h、12 h和24 h時，凋亡敏感指標(biāo)PARP蛋白質(zhì)表達(dá)。結(jié)果表明，隨著多西他賽處理時間延長，A549和H1299細(xì)胞中的PARP蛋白質(zhì)均逐漸被激活裂解形成P89片段（圖1C），細(xì)胞發(fā)生凋亡。上述結(jié)果提示多西他賽能誘導(dǎo)NSCLC發(fā)生凋亡。

2.2 GC-MS代謝組學(xué)技術(shù)分析多西他賽處理前后的A549和H1299細(xì)胞差異代謝物 基于代謝組學(xué)中需要活細(xì)胞提取代謝物進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，綜合考慮多西他賽對NSCLC增殖和凋亡的影響，保證多西他賽的藥理作用，同時保持相當(dāng)程度的細(xì)胞活力。根據(jù)CCK-8實驗結(jié)果，選擇作用A549細(xì)胞的藥物濃度為30 nM，作用H1299細(xì)胞的藥物濃度為100 nM，作用時間為24 h，A549和H1299細(xì)胞活力均在70%-80%之間，實驗具有可行性。

提取代謝物前使用液氮淬滅細(xì)胞，去除微環(huán)境變化對細(xì)胞代謝狀態(tài)的影響[14]。依前述方法樣品經(jīng)提取硅烷化衍生，利用GC-MS技術(shù)分析細(xì)胞代謝物。得到對照組和多西他賽處理組A549和H1299細(xì)胞代謝物的GC-MS總離子流圖。

考慮到非藥物因素的影響，排除復(fù)雜的環(huán)境條件干擾，最大化組間分離，并尋找各組間的差異代謝物。進(jìn)一步通過偏最小二乘法判別分析（partial least square discriminant analysis, PLS-DA）經(jīng)行多元數(shù)據(jù)處理。圖2是對照組和處理組A549和H1299細(xì)胞代謝物全譜數(shù)據(jù)的PLS-DA得分圖，該模型包含兩個主成分[14]，其中R2X=0.831、R2Y=0.983和Q2=0.878，提示該模型具有較高的穩(wěn)定性和較好的預(yù)測率。在PLS-DA得分圖上，對照組和處理組A549和H1299細(xì)胞代謝物可以明顯的區(qū)分開。

圖2 對照組和多西他賽處理24 h的A549和H1299細(xì)胞代謝物的PLS-DA得分圖（n=5）Fig 2 PLS-DA score plot of control and docetaxel treated A549 and H1299 cells for 24 h (n=5)

圖3 多西他賽對A549和H1299細(xì)胞中代謝物和代謝通路的影響（n=5）。A-B：對照組和多西他賽處理24 h組的A549細(xì)胞（A）和H1299細(xì)胞（B）差異代謝物的熱圖；C：韋恩圖統(tǒng)計A549和H1299細(xì)胞中共同的差異代謝物，并對8種差異代謝物進(jìn)行通路富集分析。Fig 3 Effects of docetaxel on metabolites and metabolic pathways in A549 and H1299 cells (n=5).A-B: Heatmap of metabolites in A549 cells (A)and H1299 cells (B) following docetaxel treatment for 24 h; C: Venn diagram of commonly differential metabolites in both A549 and H1299 cells.Pathway Impact analysis results by 8 differential metabolites.

圖4 多西他賽對A549和H1299細(xì)胞的TCA循環(huán)的影響。A-E：對照組和多西他賽處理24 h的A549和H1299細(xì)胞中TCA循環(huán)中間產(chǎn)物：蘋果酸、富馬酸、琥珀酸、檸檬酸、α-酮戊二酸變化情況；F：對照組和多西他賽處理6 h的A549和H1299細(xì)胞的TCA循環(huán)關(guān)鍵酶IDH1和IDH2蛋白質(zhì)的表達(dá)。n=5，*P＜0.05，**P＜0.01及*** P＜0.001。Vinculin作為內(nèi)參蛋白質(zhì)。Fig 4 Effects of docetaxel on TCA cycle in A549 and H1299 cells.A-E: Alterations of intermediate metabolites of TCA cycle, included malic acid,fumaric acid, succinic acid, citric acid, α-ketoglutaric acid, in control and docetaxel treatment group in A549 and H1299 cells for 24 h; F: The expression of the key enzymes protein of TCA cycle, included isocitrate dehydrogenase 1 and isocitrate dehydrogenase 2, in control and docetaxel treatment group in A549 and H1299 cells for 6 h.n=5, *P＜0.05, ** P＜0.01, *** P＜0.001 vs the control group.Vinculin was used as a loading control.

結(jié)合t檢驗的統(tǒng)計方法，得到多西他賽處理前后的A549差異代謝物31種和H1299細(xì)胞差異代謝物19種，MeV熱圖分析提示處理組的大部分代謝物含量下降 (圖3A-圖3B）。處理組A549細(xì)胞的丙酮酸、丙酸、甘氨酸等25種代謝物含量下降，絲氨酸、磷酸、腺嘌呤等6種代謝物含量上升。處理組H1299細(xì)胞的乳酸、琥珀酸、膽固醇等11種代謝物含量下降，乳糖、木糖醇、葡萄糖等8種代謝物含量上升。

2.3 多西他賽可下調(diào)NSCLC的TCA循環(huán)代謝途徑 多西他賽處理組A549和H1299的共同差異代謝物包括：蘋果酸（malic acid）、富馬酸（fumaric acid）、琥珀酸（succinic acid）、檸檬酸（citric acid）、亞?；撬幔╤ypotaurine）、核糖酸（ribonic acid）、棕櫚酸（palmitic acid）和谷胱甘肽（glutathione），在藥物處理后含量下降。通過使用在線工具M(jìn)etaboAnalyst 3.0軟件，進(jìn)行8種共同差異代謝物的通路富集分析（圖3C），結(jié)果顯示主要影響TCA循環(huán)代謝途徑（P=0.002,14）。

圖4A-圖4E所示為多西他賽處理后含量下降的TCA循環(huán)中間產(chǎn)物。蘋果酸、富馬酸、琥珀酸、檸檬酸在處理組的A549細(xì)胞中含量下降。蘋果酸、富馬酸、琥珀酸、檸檬酸、α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid）在處理組的H1299細(xì)胞中含量下降。

異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase, IDH）是TCA循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶，可催化異檸檬酸轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸。對對照組和多西他賽處理6 h后的A549和H1299細(xì)胞進(jìn)行Western blot分析，藥物處理6 h后IDH1和IDH2蛋白質(zhì)的表達(dá)量下降（圖4F）。推測多西他賽通過抑制TCA循環(huán)關(guān)鍵酶，下調(diào)NSCLC細(xì)胞的TCA循環(huán)。

3 討論

本研究通過CCK-8實驗、Western blot分析，使用基于GC-MS技術(shù)的代謝組學(xué)方法，結(jié)合多種統(tǒng)計軟件，探索多西他賽對A549和H1299細(xì)胞代謝的影響。結(jié)果表明，多西他賽對NSCLC的主要作用有：①可濃度和時間依賴地抑制細(xì)胞活力和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；②下調(diào)TCA循環(huán)的中間代謝物：蘋果酸、富馬酸、琥珀酸和檸檬酸含量，同時也下調(diào)亞?；撬?、核糖酸、棕櫚酸、谷胱甘肽的含量；③下調(diào)TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶異檸檬酸脫氫酶蛋白質(zhì)水平。

TCA循環(huán)是產(chǎn)生ATP的一條重要電子傳遞鏈，主要在生物體細(xì)胞的線粒體內(nèi)進(jìn)行[15]，是生物能量的重要來源，同時也為腫瘤細(xì)胞增殖提供了必要條件。TCA循環(huán)與NSCLC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[16]。TCA循環(huán)中的關(guān)鍵酶：琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase）、異檸檬酸脫氫酶和延胡索酸水合酶（fumarate hydratase）突變表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌患者有著更高的復(fù)發(fā)率和死亡率[17]。研究[18]表明，通過分析注射同位素13C標(biāo)記葡萄糖肺癌患者的肺組織，相比正常肺組織，肺癌組織內(nèi)大量的13C富集在琥珀酸和檸檬酸中。大量葡萄糖經(jīng)過TCA循環(huán)轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸以滿足肺癌組織生長的高合成代謝需求。

靶向代謝重編程藥物的研究，主要是針對腫瘤細(xì)胞內(nèi)存在的異常代謝。瓦博格提出，在氧氣絕對充足的條件下，相比于正常組織，腫瘤組織的細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化被抑制[19]，糖酵解水平升高200倍以上（瓦博格效應(yīng)）。糖酵解通過轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺合成α-酮戊二酸，參與TCA循環(huán)，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)一步發(fā)展[20]。添加外源檸檬酸，負(fù)反饋調(diào)節(jié)抑制腫瘤細(xì)胞的TCA循環(huán)可抑制A549細(xì)胞的增殖和裸鼠異體移植瘤的生長[21]，研究結(jié)果表明對代謝重編程的調(diào)控可以治療NSCLC。

代謝組學(xué)是研究生物體系內(nèi)各種生理活動調(diào)節(jié)后最終狀態(tài)的學(xué)科，為本研究提供了重要的理論基礎(chǔ)。GCMS氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，為本研究提供了技術(shù)上的可行性。通過對差異代謝物的代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)多西他賽作用于NSCLC細(xì)胞后TCA循環(huán)等代謝通路的改變，證明了多西他賽對代謝通路調(diào)控作用。后續(xù)實驗需進(jìn)一步驗證多西他賽作用于TCA循環(huán)的機(jī)制，三羧酸循環(huán)影響NSCLC的機(jī)制和多西他賽對代謝調(diào)控作用的動物實驗。希望可通過本研究，為靶向代謝重編程藥物的開發(fā)和藥理學(xué)研究提供一種新的策略。