血漿miR-34b-3p和miR-302a-5p在非小細(xì)胞肺癌診斷中的臨床應(yīng)用

宋治鵬 張宗德 劉洋

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)其發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)明顯增加[1,2]，且5年內(nèi)存活率＜15%，盡管有一些化療及手術(shù)等手段，存活率仍＜60%[3]。目前，肺癌的臨床診斷主要依靠影像學(xué)檢查、臨床指征分析和組織活檢[4]等，但以上方法均存在一定的局限性，尚無(wú)敏感性和特異性較高的檢測(cè)手段。血液腫瘤標(biāo)志物可以用于疑似肺癌患者的初步診斷判斷，但現(xiàn)有的肺癌血液腫瘤標(biāo)志物[癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）、糖類(lèi)抗原199（carbohydrate atigen 19-9, CA199）、糖類(lèi)抗原125（carbohydrate atigen 125, CA125）、神經(jīng)元烯醇化酶（neuron-specific enolase,NSE）、血清骨膠素（cytokeratin 19 fragments 21-1,CYFRA21-1）、SCC等]雖然被廣泛地應(yīng)用，但其在非腫瘤疾病中也會(huì)存在異常表達(dá)，因此，CEA等腫瘤標(biāo)志物用于肺癌診斷的敏感性較差。

微小核糖核酸（microRNA, miRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA，其表達(dá)異常與疾病密切相關(guān)[5]，具有成為多疾病尤其是腫瘤診斷標(biāo)志物的潛能[6,7]。本項(xiàng)研究在前期通過(guò)關(guān)鍵詞[lung cancer and（microRNA or miR）and（serum or plasma）]檢索，整合基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（gene expression omnibus, GEO）中獲得的不同的數(shù)據(jù)（GSE68951、GSE16512、GSE46729、GSE67804、GSE70080、GSE76462），挑選在多個(gè)數(shù)據(jù)中出現(xiàn)并且差異表達(dá)較高的指標(biāo)。其中，miR-34b-3p在多種惡性腫瘤（前列腺癌、乳腺癌、子宮頸癌、肺癌）中表達(dá)異常，有望成為惡性腫瘤的生物學(xué)標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)[8-11]；miR-302a異常表達(dá)與與卵巢癌[12]、急性髓細(xì)胞白血病（acute myeloid leukemia, AML）[13]、胃癌[14]的發(fā)生均密切相關(guān)，但在肺癌患者中的表達(dá)情況至今未見(jiàn)報(bào)道。以此為依據(jù)，最終確定所要研究的miRNA（miR-34b-3p和miR-302a-5p）。

本項(xiàng)研究通過(guò)檢測(cè)血漿中miR-34b-3p和miR-302a-5p在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者中的表達(dá)水平，分析其表達(dá)情況與臨床病理特征之間的關(guān)系及其在NSCLC診斷的潛在價(jià)值，以期為NSCLC的診斷提供新思路和新依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年6月-2018年10月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院收治并確診的NSCLC患者86例作為肺癌組，其中男性54例，女性32例，平均年齡（61.35±8.52）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)組織病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)診斷明確；②臨床資料完整，包括人口學(xué)特征，如年齡、性別、吸煙狀況、職業(yè)暴露、病理診斷、腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumor-node-metastasis, TNM）；③在本醫(yī)院進(jìn)行首程治療；④未合并其他腫瘤或器官功能障礙性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＞80歲；②肺內(nèi)合并活動(dòng)性炎癥。選取同期收治并確診為PTB的患者64例作為良性對(duì)照組，其中男性44例，女性20例，平均年齡（59.02±11.19）歲，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS288-2017）。同期進(jìn)行健康體檢的39例作為健康對(duì)照組，其中男性24例，女性15例，平均年齡（57.32±9.18）歲。各組的性別、年齡等一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 清晨空腹采集靜脈血5 mL置于EDTA抗凝管中，所有血液自收集至處理時(shí)間不超過(guò)2 h。血液樣本在4 ℃下、4,000 rpm離心10 min；取上層血漿置于新的1.5 mL RNase-Free的離心管中，處理后的血漿于-80 ℃保存。

1.2.2 miRNA的提取 凍存的樣本室溫融解后，4 ℃，16,000g離心10 min，取上層血漿200 μL。miRNA的提取嚴(yán)格按照商品化試劑盒（miRcute血清/血漿miRNA提取分離試劑盒，TIANGEN）的操作步驟進(jìn)行。提取的microRNA加入25 μL的RNase-Free水溶解，使用NanoDrop2000微量分光光度計(jì)測(cè)定其濃度與純度，而后直接進(jìn)行miRNA的反轉(zhuǎn)錄。

1.2.3 miRNA檢測(cè) 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒，TIANGEN）進(jìn)行反轉(zhuǎn)，其反應(yīng)體系包括miRNA 8 μL，反轉(zhuǎn)錄緩沖液10 μL，反轉(zhuǎn)錄酶混合液2 μL；反轉(zhuǎn)條件為42 ℃ 60 min、95 ℃ 3 min，4 ℃ 5 min。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5 μL加45 μL RNase-Free水稀釋。采用商品化試劑盒[miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒（SYBR Green），TIANGEN]進(jìn)行熒光定量PCR（real-time polymerase chain reaction, RT-PCR）檢測(cè)，其反應(yīng)體系包括預(yù)混液10 μL，正向引物0.4 μL，反向引物0.4 μL，取稀釋后的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，ROX染料2 μL，加5.2 μL RNase-Free水補(bǔ)足至20 μL。設(shè)置空白對(duì)照，所有反應(yīng)采用3個(gè)復(fù)孔，使用QuantStudio 7熒光定量PCR儀（美國(guó)，Thermo Fisher Scientific）按照95 ℃ 15 min、5個(gè)預(yù)循環(huán)（94 ℃ 20 s、64 ℃ 30 s、72 ℃ 34 s）、40個(gè)循環(huán)（94 ℃ 20 s、60 ℃ 34 s）進(jìn)行擴(kuò)增。采用相對(duì)定量法對(duì)血漿中各miRNA含量進(jìn)行分析。以U6為內(nèi)參，2-ΔCt作為其相對(duì)含量，其中ΔCt=CtmiRNA-CtU6。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用IBM SPSS 24.0軟件進(jìn)行分析和處理。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位間距）[M（Q1, Q3）]表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，兩組間血漿中miRNA表達(dá)水平的比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。通過(guò)受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve, ROC curve）分析miR-34b-3p和miR-302a-5p以及腫瘤標(biāo)志物的診斷價(jià)值，獲得臨界值（cut-off point）以及靈敏度和特異度。使用Logistic回歸分析miR-34b-3p和miR-302a-5p與NSCLC發(fā)生的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 多組血漿miR-34b-3p和miR-302a-5p表達(dá)水平比較 結(jié)果顯示miR-34b-3p、miR-302a-5p在NSCLC組、PTB組以及健康對(duì)照組中的表達(dá)水平存在差異，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表1。

對(duì)miR-34b-3p、miR-302a-5p在NSCLC組和PTB組、NSCLC組和健康對(duì)照組中的表達(dá)情況，進(jìn)行兩組間的比較分析。結(jié)果顯示miR-34b-3p和miR-302a-5p的表達(dá)在NSCLC組與PTB組以及NSCLC組與健康對(duì)照組中存在差異（P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.2 NSCLC患者血漿miR-34b-3p和miR-302a-5p表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)果顯示血漿miR-34b-3p表達(dá)水平與腫瘤直徑相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與年齡、性別、吸煙狀況、職業(yè)暴露、病理分期、病理類(lèi)型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)；而miR-302a-5p表達(dá)水平與年齡、性別、吸煙狀況、職業(yè)暴露、病理分期、病理類(lèi)型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑無(wú)關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3。

2.3 血漿miR-34b-3p和miR-302a-5p單獨(dú)及與腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)對(duì)NSCLC的診斷價(jià)值 ROC曲線用來(lái)評(píng)估血漿miRNA對(duì)NSCLC的診斷價(jià)值。結(jié)果顯示，單項(xiàng)檢測(cè)NSCLC時(shí)，miR-302a-5p的靈敏度最高（82.6%），CEA的特異度最高（81.6%）；雙項(xiàng)檢測(cè)NSCLC時(shí)，miR-34b-3p+miR-302a-5p的靈敏度最高（80.2%），miR-34b-3p+CEA的特異度最高（89.3%）；多項(xiàng)檢測(cè)NSCLC時(shí)，miR-302a-5p+NSE+CYFRA21-1的靈敏度最高（81.4%），miR-34b-3p+CEA+NSE的特異度最高（90.3%）。當(dāng)聯(lián)合miR-34b-3p、miR-302a-5p和CEA這三項(xiàng)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，其ROC曲線下面積（area under the curve, AUC）最大，為0.832。見(jiàn)表4和圖1。

2.4Logistic回歸 將miR-34b-3p、miR-302a-5p進(jìn)行單因素Logistic回歸分析 結(jié)果顯示在NSCLC組與對(duì)照組（PTB組+健康對(duì)照組）中，miR-34b-3p的優(yōu)勢(shì)比（odds ratio,OR）為9.214（P＜0.05），說(shuō)明其具有一定的預(yù)測(cè)性，可能為NSCLC發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表5。

3 討論

在臨床上，新的生物標(biāo)志物是肺癌患者的診斷、指導(dǎo)治療和監(jiān)測(cè)肺部病變的關(guān)鍵[15,16]?；蚪M學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的飛速進(jìn)展加快了許多潛在的臨床應(yīng)用標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。血液學(xué)檢查對(duì)患者創(chuàng)傷小且操作簡(jiǎn)便，因此在血液中找到合適的分子標(biāo)志物，闡明其與肺癌發(fā)生的關(guān)系，顯得尤為重要[17]。miRNA是一種非編碼的小分子單鏈RNA，是調(diào)控基因在轉(zhuǎn)錄后及翻譯水平表達(dá)的主要元件[18]，報(bào)道表明miRNA與腫瘤、炎癥等許多疾病的發(fā)生、發(fā)展等密切相關(guān)，且miRNA取材方便，在血漿中穩(wěn)定存在，可連續(xù)監(jiān)測(cè)，有望成為一種理想的潛在血漿腫瘤標(biāo)志物[19,20]。

表1 多組間血漿miRNAs表達(dá)水平比較[M（Q1, Q3）]Tab 1 Comparison of plasma miRNAs expression levels among multiple groups [M（Q1, Q3）]

表2 兩組間血漿miRNAs表達(dá)水平比較[M（Q1, Q3）]Tab 2 Comparison of plasma miRNAs expression levels between the two groups [M（Q1, Q3）]

表3 非小細(xì)胞肺癌患者血漿miRNAs表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Tab 3 The relationship between plasma miRNAs expression and clinicopathological features in patients with non-small cell lung cancer

圖1 miR-34b-3p、miR-302a-5p以及腫瘤標(biāo)志物的ROC曲線Fig 1 ROC curve of miR-34b-3p, miR-302a-5p and tumor markers.ROC: receiver operating characteristic.

表5 單因素Logistic回歸Tab 5 Univariate Logistic regression

本研究發(fā)現(xiàn)miR-34b-3p和miR-302a-5p，與對(duì)照組（PTB組+健康對(duì)照組）相比，兩者在NSCLC血漿中均高表達(dá)，表示其在肺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能起正向調(diào)控作用。其中miR-34b-3p的表達(dá)與既往研究結(jié)果相一致[21]，并且還發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平與腫瘤直徑相關(guān)，在腫瘤直徑＞5 cm的患者血漿中的表達(dá)水平明顯高于腫瘤直徑≤5 cm的患者。分析其原因可能是腫瘤負(fù)荷越大，腫瘤組織釋放具有原癌基因作用的miRNA進(jìn)入血液的機(jī)會(huì)越大，使得機(jī)體原有的具有抑癌作用的miRNA表達(dá)水平受到抑制，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體miRNA表達(dá)水平異常升高。由此可見(jiàn)，miR-34b-3p在一定程度上參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展。然而miR-34b-3p的表達(dá)在年齡、性別、吸煙狀況、職業(yè)暴露、病理分期、病理類(lèi)型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分類(lèi)中卻未發(fā)現(xiàn)差異。分析其原因可能是因?yàn)楸敬窝芯康臉颖玖肯鄬?duì)較小，仍需進(jìn)一步擴(kuò)大，才能驗(yàn)證miRNA含量在不同分組中的表達(dá)差異。我們還將miR-34b-3p進(jìn)行了單因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示在NSCLC組與對(duì)照組（PTB組+健康對(duì)照組）中，miR-34b-3p的OR值為9.214[22]。由于對(duì)入組患者的相關(guān)隨訪還在進(jìn)行中，未進(jìn)行Cox回歸等相關(guān)分析。因此，miR-34b-3p可能是NSCLC發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

表4 血漿miR-34b-3p、miR-302a-5p、腫瘤標(biāo)志物對(duì)非小細(xì)胞肺癌的診斷價(jià)值Tab 4 Diagnostic value of plasma miR-34b-3p, miR-302a-5p and tumor markers for non-small cell lung cancer

關(guān)于miR-302a-5p與肺癌之間的相關(guān)研究至今未見(jiàn)報(bào)道，參考其在卵巢癌、急性髓細(xì)胞白血?。╝cute myeloid leukemia, AML）、胃癌中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-302a-5p在卵巢癌和AML細(xì)胞中高表達(dá)[12,13]，在胃癌組織中低表達(dá)[14]。本研究中miR-302a-5p的表達(dá)情況與其在卵巢癌和AML中表達(dá)相一致。在分析其表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系時(shí)，卻未發(fā)現(xiàn)兩者之間的關(guān)聯(lián)。造成這種結(jié)果可能的原因，一是受限于本次研究的樣本量；二是受限于納入研究的病理特征的分類(lèi)，其表達(dá)水平有可能在其他病理特征分類(lèi)上存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

我們通過(guò)計(jì)算ROC曲線下面積AUC，來(lái)評(píng)估m(xù)iR-34b-3p、miR-302a-5p及聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物對(duì)NSCLC的診斷價(jià)值。有研究組合6種miRNA（miR-429、miR-205、miR-200b、miR-203、miR-125b、miR-34b）對(duì)早期NSCLC進(jìn)行診斷，獲得的AUC為0.88[21]。由此可以肯定miR-34b在NSCLC早期診斷中的價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)86例NSCLC（I期-II期52例，III期-IV期34例）血漿中miR-34b-3p、miR-302a-5p的表達(dá)，獲得的曲線下面積分別為0.703和0.660，并且可以獲得≥81.4%的診斷靈敏度，但特異度并不理想（最大值為55.3%），這為miR-34b用于NSCLC診斷方面提供了更為全面的證據(jù)，并且探索了miR-302a-5p用于NSCLC診斷的價(jià)值。應(yīng)用腫瘤標(biāo)志物CEA、NSE、CYFR21-1對(duì)入組病例進(jìn)行診斷可以獲得較好的診斷特異度（≥61.2%），但是敏感度較差（最大值為72.1%）。由此，本研究嘗試將血漿中miRNA檢測(cè)與腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果結(jié)合，以此來(lái)提高診斷效能[23]。發(fā)現(xiàn)多項(xiàng)檢測(cè)NSCLC時(shí)，miR-302a-5p+NSE+CYFRA21-1的靈敏度最高（81.4%），miR-34b-3p+CEA+NSE的特異度最高（90.3%）。當(dāng)聯(lián)合miR-34b-3p、miR-302a-5p和CEA進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，其AUC最大，為0.832。由此可見(jiàn)，血漿miR-34b-3p、miR-302a-5p與腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合，有利于提高其對(duì)NSCLC的診斷靈敏度、特異度以及診斷效能，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，NSCLC患者血漿中miR-34b-3p和miR-302a-5p的表達(dá)水平高于對(duì)照人群，并且通過(guò)組合miRNA與腫瘤標(biāo)志物，可以獲得滿意的診斷效能，有望成為NSCLC輔助診斷的血漿學(xué)標(biāo)志物，為液體活檢的發(fā)展提供了新的思路。