聚苯乙烯微塑料和羅紅霉素對(duì)斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）和大型溞（Daphnia magna）的聯(lián)合效應(yīng)研究

姜航，丁劍楠, ，黃葉菁，陳微懿，鄒華, *，史紅星

1. 江南大學(xué)環(huán)境與土木工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2. 江蘇省水處理技術(shù)與材料協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 蘇州 215009；3. 國(guó)民核生化災(zāi)害防護(hù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102205

塑料以其良好的經(jīng)濟(jì)適用性成為生產(chǎn)生活中必不可少的材料。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球塑料年產(chǎn)量已從1950年的 170萬(wàn)噸增長(zhǎng)到 2016年的 3.4億噸（Murphy et al.，2017；Proki? et al.，2019）。與此同時(shí)，大量的塑料被丟棄，不可避免地會(huì)進(jìn)入土壤和水生態(tài)系統(tǒng)。這些廢塑料經(jīng)過(guò)機(jī)械磨損、熱解、水解和生物降解，逐漸降解成直徑小于5 mm的碎片，即所謂的微塑料（Microplastics，MPs）（Law et al.，2014）。海洋環(huán)境中的MPs污染已在世界范圍內(nèi)普遍證實(shí)（Eriksen et al.，2014；Andrady et al.，2011）。近期，在淡水環(huán)境中，也報(bào)道了MPs的廣泛檢出（Su et al.，2016；Wang et al.，2017；Eerkes-Medrano et al.，2015）。水體中的MPs容易被水生生物誤食或者吸附于生物體表面（Kolandhasamy et al.，2018），通過(guò)食物鏈傳遞（Mattsson et al.，2014），進(jìn)而影響水生生物的生理代謝、生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖等過(guò)程（Wright et al.，2013；Mao et al.，2018；Blarer et al.，2016）。

MPs具有比表面積大，疏水性強(qiáng)的特點(diǎn)，極有可能吸附水環(huán)境中的其他污染物，形成復(fù)合污染（Brennecke et al.，2016；Ziccardi et al.，2016）；這也導(dǎo)致風(fēng)險(xiǎn)源對(duì)水生生物的污染脅迫途徑愈發(fā)復(fù)雜（Savoca et al.，2017），可能會(huì)造成不可預(yù)知的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。目前，有關(guān)MPs與水環(huán)境中其他污染物復(fù)合污染的研究剛剛起步，且多集中于和多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯等傳統(tǒng)污染物的聯(lián)合效應(yīng)研究（Batel et al.，2016；Sleight et al.，2017；Karami et al.，2016；Oliveira et al.，2013），有關(guān)MPs與其他新興有機(jī)污染物之間的相互作用研究仍然有限。

抗生素是近年來(lái)受到較高關(guān)注的一類新興有機(jī)污染物。由于存在濫用現(xiàn)象，抗生素在我國(guó)水環(huán)境中的賦存較為廣泛（Liu et al.，2013）。羅紅霉素（Roxithromycin，ROX）是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，普遍應(yīng)用于呼吸道，泌尿和軟組織感染等病癥的治療。目前，ROX已在世界范圍內(nèi)的水環(huán)境中廣泛檢出。在意大利北部波河流域某污水廠進(jìn)出水中發(fā)現(xiàn)ROX 的濃度為 65－290 ng·L-1（Verlicchi et al.，2014）；冬季我國(guó)湘江水體中ROX的濃度范圍為1.4－190 ng·L-1（Lin et al.，2018）；Kleywegt et al.（2011）甚至在加拿大飲用水中發(fā)現(xiàn)了ROX的賦存（5 ng·L-1）。研究表明，ROX能在水生生物體內(nèi)累積，并對(duì)其神經(jīng)、代謝和氧化應(yīng)激等生理生化功能產(chǎn)生影響（Liu et al.，2014；Besseling et al.，2015；Alomar et al.，2017）。然而，水環(huán)境中共存的MPs如何影響 ROX在淡水生物的吸收、分布、累積和代謝等毒理動(dòng)力學(xué)過(guò)程，是否會(huì)引發(fā)毒性增敏效應(yīng)，目前還未可知。

浮游生物是水生生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)、能量生產(chǎn)和傳遞均有重要作用。然而，目前有關(guān)MPs水生毒理學(xué)的研究多集中于魚(yú)類（de Sá et al.，2018），有關(guān)MPs和抗生素復(fù)合污染對(duì)浮游生物的聯(lián)合毒性效應(yīng)研究還較為缺乏。本文以我國(guó)淡水水域中常見(jiàn)的浮游植物斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）和浮游動(dòng)物大型溞（Daphnia magna）作為模式生物，探究MPs和ROX復(fù)合污染對(duì)浮游生物的生理生化過(guò)程的交互效應(yīng)。研究結(jié)果可為水環(huán)境中新興污染物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和控制提供理論支持，同時(shí)可為水體中新興污染物環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)品和試劑

綠色熒光聚苯乙烯（Polystyrene，PS）微球（粒徑為0.1 μm，密度為10 mg·mL-1）購(gòu)自大鵝（天津）科技有限公司。PS-MPs原液在4 ℃下避光儲(chǔ)存，并在每次使用前進(jìn)行超聲處理。ROX標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）購(gòu)自上海升德醫(yī)藥科技有限公司，在4 ℃下避光保存，使用甲醇制備母液，并在-20 ℃下保存。

1.2 受試生物

斜生柵藻和大型溞購(gòu)自中科院水生生物研究所（武漢）。斜生柵藻在BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于光照培養(yǎng)箱（GZX-250BSH-Ⅲ，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)大繁殖和馴化培養(yǎng)。溫度控制在(25±1) ℃，光照強(qiáng)度為8000 lux，光暗比為12 h∶12 h。每天定期振蕩3次，每隔1－2周移種，以純化藻種并使其同步生長(zhǎng)。

大型溞用超純水配制的重組水進(jìn)行培養(yǎng)，每1000 mL重組水中含有58.5 mg CaCl2·2H2O，24.7 mg MgSO4·7H2O，13.0 mg NaHCO3和 1.2 mg KCl。大型溞置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度控制在(25±1) ℃，光照強(qiáng)度為 2000 lux，光暗比為 12 h∶12 h。在培養(yǎng)期間，培養(yǎng)液每周更換 3次，并每天以斜生柵藻對(duì)大型溞進(jìn)行喂食，喂食的藻細(xì)胞密度為105cells·mL-1。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

1.3.1 斜生柵藻暴露實(shí)驗(yàn)

經(jīng)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)馴化后，將斜生柵藻分別置于250 mL錐形瓶，將熒光PS-MPs和/或ROX原液添加到藻液。暴露處理包括空白對(duì)照、PS-MPs單獨(dú)暴露（1000 μg·L-1PS-MPs）、ROX 單獨(dú)暴露（2.5 μg·L-1ROX）、PS-MPs與 ROX 共同暴露（1000 μg·L-1PS-MPs+2.5 μg·L-1ROX）。每種暴露處理包括 3個(gè)平行試驗(yàn)，初始藻細(xì)胞密度為 1×106cells·mL-1，體積為200 mL。暴露周期為72 h，在暴露的第0、6、12、24、36、48和72小時(shí)，測(cè)定各暴露組藻細(xì)胞密度、葉綠素a含量和最大光化學(xué)量子產(chǎn)量（Fv/Fm）等生理指標(biāo)。在各時(shí)間點(diǎn)用玻璃吸管取暴露液樣品后，對(duì)樣品進(jìn)行 10 min的離心（1000×g），離心結(jié)束后，將上清液轉(zhuǎn)移至 15 mL離心管，保存于-80 ℃冰箱中用于測(cè)量暴露液中ROX濃度。

1.3.2 大型溞暴露實(shí)驗(yàn)

經(jīng)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)馴化后，將空腹24 h的成年大型溞分別置于100 mL燒杯中，每杯加入50 mL培養(yǎng)液，將熒光PS-MPs和/或ROX原液添加到大型溞培養(yǎng)液中，制備試驗(yàn)溶液。暴露處理包括空白對(duì)照、PS-MPs單獨(dú)暴露（250 μg·L-1PS-MPs）、ROX 單獨(dú)暴露（5 μg·L-1ROX）、PS-MPs與 ROX 共同暴露（250 μg·L-1PS-MPs+5 μg·L-1ROX）。每種暴露處理包括3個(gè)平行試驗(yàn)。喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)選取10只大型溞，投加藻細(xì)胞密度為1×106cells·mL-1的斜生柵藻，避光暴露 5 h，測(cè)定暴露前后暴露液中斜生柵藻藻細(xì)胞密度，以計(jì)算大型溞的牧食率以及濾水率。生物標(biāo)志物實(shí)驗(yàn)選取30－35只大型溞，絕食暴露48 h后，稱重后放入-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.4 生理生化指標(biāo)檢測(cè)

使用血球計(jì)數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下檢測(cè)藻細(xì)胞密度；采用丙酮萃取分光光度法測(cè)定藻胞內(nèi)葉綠素 a濃度（戴欣等，2013），再根據(jù)公式：

葉綠素含量(mg·g-1)=葉綠素濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù)/樣品鮮重 （1）

計(jì)算葉綠素含量（關(guān)愛(ài)農(nóng)等，2009）；使用FluorCam封閉式葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)（FluorCam 800F）測(cè)定Fv/Fm。

參考Ding et al.（2015）的方法對(duì)樣品中ROX濃度進(jìn)行測(cè)定。將各時(shí)間點(diǎn)取的暴露液樣品，經(jīng)0.45 μm玻璃纖維過(guò)濾器過(guò)濾以去除雜質(zhì)，過(guò)HLB固相萃取柱純化，以6 mL甲醇洗脫，氮吹至干，最后用甲醇定容至1 mL。采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC/MS/MS）（Waters ACQUITY UPLC Xevo TQ）對(duì)ROX進(jìn)行定量分析。在Acquity BEH C18柱（100 mm×2.1 mm×1.7 μm）上進(jìn)行層析分離。流動(dòng)相溶液設(shè)定：A為0.1%甲酸溶液，B為100%乙腈。具體流動(dòng)相梯度如表 1所示。流速設(shè)置為0.3 mL·min-1。每次樣品進(jìn)樣體積為5 μL。質(zhì)譜檢測(cè)的電噴霧電離源（ESI）設(shè)定為正模式。ROX的質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)：停留時(shí)間 328 ms；母離子質(zhì)荷比為837.50；子離子質(zhì)荷比為158.00；碰撞能量30.0 V；碰撞電壓37.0 V；保留時(shí)間1.58 min。外標(biāo)法定量，ROX標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2＞0.99。

表1 流動(dòng)相梯度變化Table 1 Change in mobile phase for target compound

按照商業(yè)試劑盒（中國(guó)蘇州科銘生物科技有限公司）說(shuō)明書要求測(cè)定超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）和過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）等細(xì)胞水平生物標(biāo)志物。

1.5 數(shù)據(jù)分析

牧食率和濾水率是大型溞喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的常規(guī)指標(biāo)，常用來(lái)驗(yàn)證外源污染物的富集是否會(huì)影響其對(duì)食物的攝入。牧食率（I）指某特定時(shí)間內(nèi)每只大型溞所消耗的綠藻的藻細(xì)胞個(gè)數(shù)，單位為cell·(ind·h)-1；濾水率（F）指一定量水樣中大型溞個(gè)體在單位時(shí)間內(nèi)濾過(guò)的含有一定數(shù)量綠藻的水樣量，單位可表示為μL·(ind·h)-1。濾水率和牧食率的計(jì)算公式為：

式中C0和Ct分別表示為起始和終點(diǎn)斜生柵藻的藻細(xì)胞密度（cell·μL-1）；t為試驗(yàn)時(shí)間；n 表示容器中大型溞的個(gè)數(shù)；V為試驗(yàn)水樣體積；Ct′為對(duì)照組終點(diǎn)藻細(xì)胞密度；A是指修正系數(shù)。

研究結(jié)果采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，單因素方差分析進(jìn)行差異性檢驗(yàn)（One-way ANOVA，Duncan檢驗(yàn)），分析結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 暴露液中ROX的濃度變化

圖1 72 h暴露期間ROX單獨(dú)暴露組和PS-MPs與ROX共同暴露組暴露液中ROX濃度隨時(shí)間變化Fig. 1 Temporal change in ROX concentration in media in ROX-alone treatment and PS-MPs+ROX co-treatment during 72 h exposure

如圖1所示，在ROX單獨(dú)暴露組中，暴露開(kāi)始時(shí)（0 h），暴露液中ROX的平均濃度為(2.4±1.0)μg·L-1。暴露開(kāi)始24 h后，暴露液中ROX的濃度顯著降低（P＜0.05），此時(shí) ROX 的平均濃度為(1.5±0.3) μg·L-1；隨后，暴露液中的 ROX 濃度趨于平衡。而在MPs與ROX共同暴露組中，暴露開(kāi)始時(shí)（0 h），ROX 的平均濃度為(2.7±0.4) μg·L-1。暴露開(kāi)始 24 h后，暴露液中 ROX的濃度顯著降低（P＜0.05），其平均濃度為(1.2±0.3) μg·L-1。暴露 72 h結(jié)束時(shí)，單獨(dú)暴露組和共同暴露組中 ROX濃度比初始暴露濃度分別下降了76.1%和83.8%。暴露液中 ROX濃度的下降可能是由斜生柵藻細(xì)胞、PS-MPs以及容器器壁的吸附導(dǎo)致（Smets et al.，1990）。Ding et al.（2015）發(fā)現(xiàn)在 20 μg·L-1ROX 暴露下，斜生柵藻會(huì)在暴露開(kāi)始后數(shù)小時(shí)內(nèi)迅速吸附富集暴露液中的ROX，且在24－36 h左右達(dá)到富集平衡狀態(tài)，最終暴露液中 ROX濃度僅為初始暴露濃度的44.7%。在本實(shí)驗(yàn)中，暴露6 h后，共同暴露組中ROX的濃度要低于ROX單獨(dú)暴露組（圖1），這表明PS-MPs吸附了暴露液中的ROX。MPs具有疏水性，并且能夠通過(guò)靜電作用在水中吸附多種抗生素（Li et al.，2018），有學(xué)者甚至發(fā)現(xiàn)MPs能夠?qū)前奉惪股鼗前芳讗哼虍a(chǎn)生不可逆的吸附作用（Razanajatovo et al.，2018）。實(shí)際水環(huán)境中，污染物組成更加復(fù)雜，MPs很可能吸附許多不同種類的污染物，并不同程度上改變復(fù)合污染體系中污染物的環(huán)境行為及毒理效應(yīng)，帶來(lái)不可預(yù)知的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。因此，有必要深入研究MPs與抗生素等有機(jī)污染物的聯(lián)合生態(tài)效應(yīng)。

2.2 PS-MPs與ROX對(duì)斜生柵藻的種群增長(zhǎng)影響

如表2和圖2所示，在暴露48 h后，各單獨(dú)暴露組中斜生柵藻藻細(xì)胞密度、葉綠素 a含量以及Fv/Fm均已顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05）；暴露72 h后，PS-MPs單獨(dú)暴露組中斜生柵藻的各項(xiàng)生理指標(biāo)相較于空白實(shí)驗(yàn)組分別下降了9.4%、9.2%、8.6%，這表明PS-MPs對(duì)斜生柵藻的生長(zhǎng)具有抑制作用，同時(shí)對(duì)其光合作用效率產(chǎn)生了一定的負(fù)面影響。Besseling et al.（2014）將斜生柵藻連續(xù)72 h暴露于PS-MPs，同樣觀察到PS-MPs抑制了藻類種群生長(zhǎng)并降低了藻類的葉綠素a含量，該學(xué)者認(rèn)為納米級(jí)PS-MPs會(huì)吸附在綠藻細(xì)胞膜表面，減少藻類對(duì)CO2的吸收，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)（ROS）的產(chǎn)生，造成了氧化損傷，最終抑制了藻類的生長(zhǎng)。Mao et al.（2018）研究了 PS-MPs暴露下，小球藻（Chlorella pyrenoidosa）在整個(gè)生長(zhǎng)期內(nèi)的生理指標(biāo)變化，結(jié)果顯示 PS-MPs暴露濃度為 10、50和100 mg·L-1時(shí)，藻類生長(zhǎng)最大抑制率分別為21.0%、29.0%和38.5%，其中100 mg·L-1PS-MPs暴露下，小球藻的Fv/Fm最大抑制率高達(dá)93.5%；該研究者指出附著在藻類上的PS-MPs顆粒可以增強(qiáng)光衰減并降低營(yíng)養(yǎng)和氣體交換的有效性，從而引起對(duì)藻類的生長(zhǎng)、呼吸和光合作用的不利影響。在本實(shí)驗(yàn)中，ROX單獨(dú)暴露72 h后，斜生柵藻的藻細(xì)胞密度、葉綠素a含量以及Fv/Fm分別下降了10.2%、7.6%和7.3%。Yang et al.（2008）通過(guò)72 h的暴露實(shí)驗(yàn)分析了 12種抗生素對(duì)月牙藻（Pseudokirchneriella subcapitata）生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)超過(guò)半數(shù)的抗生素對(duì)月牙藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，該研究者認(rèn)為抗生素會(huì)結(jié)合亞基50S核糖體，抑制肽的轉(zhuǎn)運(yùn)和干擾蛋白質(zhì)的合成，從而抑制綠藻的生長(zhǎng)。

表2 暴露72 h后不同暴露組中斜生柵藻各項(xiàng)生理指標(biāo)抑制率Table 2 Inhibition rates of different exposure groups on physiological indexes of S. obliquus after exposure for 72 h

圖2 不同暴露處理72 h期間斜生柵藻（A）藻細(xì)胞密度，（B）葉綠素a含量及Fv/Fm（C）的變化Fig. 2 ( A) Algal cell concentration, (B) Chlorophyll-a concentration and(C) Fv/Fm variation of S. obliquus with different exposure treatments during 72 h exposure

MPs和 ROX聯(lián)合暴露對(duì)斜生柵藻藻細(xì)胞密度、葉綠素a含量以及Fv/Fm的影響見(jiàn)圖2和表2，隨著暴露時(shí)長(zhǎng)的增加，在暴露48 h之后，PS-MPs與 ROX共同暴露組中斜生柵藻的各項(xiàng)生理指標(biāo)均顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05），PS-MPs與ROX共同暴露組中斜生柵藻的藻細(xì)胞密度相較于空白實(shí)驗(yàn)組下降了13.3%，葉綠素a含量下降了9.5%，F(xiàn)v/Fm下降了 9.3%，但是與各單獨(dú)暴露組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），這意味著PS-MPs與ROX共同暴露對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)的抑制效果并沒(méi)有比二者的單獨(dú)暴露更為明顯。Zhu et al.（2019）研究了 4種不同類型的MPs和三氯生（TCS）對(duì)中肋骨條藻（Skeletonema costatum）的聯(lián)合毒性，發(fā)現(xiàn)由于 TCS的吸附，使得 MPs的疏水性增加，導(dǎo)致MPs在水中沉淀，減少了MPs與微藻細(xì)胞之間的接觸機(jī)會(huì)，從而降低了MPs和TCS的毒性。在本實(shí)驗(yàn)，共同暴露組中的PS-MPs對(duì)ROX的吸附可能導(dǎo)致二者接觸斜生柵藻藻胞的機(jī)率降低，導(dǎo)致聯(lián)合毒性效應(yīng)并沒(méi)有比單一毒性更加顯著。Zhang et al.（2018）研究了氨基修飾的聚苯乙烯納米粒子（nPS-NH2）和草甘膦對(duì)銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）聯(lián)合毒性的影響，發(fā)現(xiàn)nPS-NH2與草甘膦共暴露對(duì)藻類生長(zhǎng)的抑制具有拮抗作用；該學(xué)者認(rèn)為，草甘膦對(duì)銅綠微囊藻有很強(qiáng)的抑制作用，但由于 nPS-NH2對(duì)草甘膦具有很強(qiáng)的吸附能力，顯著減輕了草甘膦對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)抑制作用。雖然本研究中PS-MPs和ROX的聯(lián)合暴露對(duì)斜生柵藻的急性毒性影響并沒(méi)有比單一暴露更為顯著，但是自然水環(huán)境中，MPs與抗生素很可能是長(zhǎng)期共存的，而它們對(duì)浮游植物產(chǎn)生的長(zhǎng)期聯(lián)合效應(yīng)還未可知，因此有關(guān)MPs與抗生素的慢性毒性實(shí)驗(yàn)亟待展開(kāi)。

2.3 PS-MPs與ROX對(duì)大型溞的毒理效應(yīng)

如圖 3所示，在本實(shí)驗(yàn)各暴露組中，大型溞的牧食率和濾水率均有明顯的降低，其中，PS-MPs單獨(dú)暴露組中大型溞的牧食率和濾水率相較于空白實(shí)驗(yàn)組分別下降了38.1%和39.4%，表明大型溞的覓食行為受到了PS-MPs的顯著抑制。Cole et al.（2013）將15種浮游動(dòng)物暴露于PS-MPs后，發(fā)現(xiàn)包括大型溞在內(nèi)的 13種浮游動(dòng)物均具有攝食暴露液中PS-MPs的能力，并且攝入的PS-MPs能夠累積在浮游動(dòng)物體內(nèi)，導(dǎo)致攝食器官和消化道堵塞，造成能量缺乏，從而抑制其牧食率。在 ROX單獨(dú)暴露組中，大型溞的牧食率和濾水率相較于空白實(shí)驗(yàn)組分別下降了58.9%和58.7%，表明ROX同樣抑制了大型溞的覓食行為。Pan et al.（2017）在喹諾酮類抗生素諾氟沙星對(duì)大型溞的急性毒性實(shí)驗(yàn)中同樣發(fā)現(xiàn)了覓食行為受到抑制的現(xiàn)象；該研究者認(rèn)為隨著抗生素濃度的增加，機(jī)體為了減少能量損失，適應(yīng)環(huán)境脅迫，選擇減少運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而導(dǎo)致了牧食率的降低。同樣的，Yan et al.（2019）也發(fā)現(xiàn)磺胺類抗生素磺胺二甲嘧啶能夠影響輪蟲(chóng)（Brachionus calyciflorus）的神經(jīng)信號(hào)傳遞，抑制消化酶活性，最終導(dǎo)致攝食能力的下降。

圖3 不同暴露處理48 h后大型溞（A）牧食率和（B）濾水率變化Fig. 3 (A) Ingestion rates and (B) filtration rates variation of D. magna with different exposure treatments after 48 h exposure

在暴露48 h后，PS-MPs與ROX共同暴露組中大型溞的牧食率和濾水率相較于空白實(shí)驗(yàn)組分別下降了 31.3%和31.6%。在本實(shí)驗(yàn)中，共同暴露組中大型溞的牧食率和濾水率與 PS-MPs單獨(dú)暴露組無(wú)顯著差異（P＞0.05），但遠(yuǎn)高于 ROX單獨(dú)暴露組（P＜0.05），說(shuō)明 ROX對(duì)大型溞覓食行為的抑制效果要強(qiáng)于PS-MPs，但是在二者共存的情況下，PS-MPs能夠降低ROX對(duì)大型溞覓食行為的影響。Zhang et al.（2019）研究了PS-MPs和ROX的交互效應(yīng)對(duì)紅羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）的生理生化影響，觀察到聯(lián)合暴露下的紅羅非魚(yú)腦神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿酯酶（AChE）活性受抑制程度要明顯小于ROX單獨(dú)暴露，這表明PS-MPs存在的情況下，能夠減輕ROX對(duì)紅羅非魚(yú)的覓食和運(yùn)動(dòng)等功能的抑制作用，該研究者認(rèn)為吸附在PS-MPs表面上的ROX不能直接與AChE相互作用，從而減輕抑制作用。Fonte et al.（2016）近期研究了抗生素頭孢氨芐和聚乙烯（Polyethylene，PE）MPs對(duì)蝦虎魚(yú)（Pomatoschistus microps）的聯(lián)合效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合暴露和PE-MPs單獨(dú)暴露96 h后對(duì)蝦虎魚(yú)捕食性能的影響沒(méi)有顯著差異，但是蝦虎魚(yú)在聯(lián)合暴露后的捕食性能略高于抗生素單獨(dú)暴露后的捕食性能，這表明 PE-MPs的存在降低了頭孢氨芐的毒性；該作者認(rèn)為 PE-MPs可能在生物體內(nèi)發(fā)生改性，使得本要進(jìn)入生物細(xì)胞內(nèi)的頭孢氨芐被 PE-MPs結(jié)合，導(dǎo)致頭孢氨芐的毒性降低。雖然MPs和抗生素復(fù)合污染對(duì)水生生物覓食行為的影響機(jī)理目前還不完全清楚，但本實(shí)驗(yàn)研究顯示在環(huán)境相關(guān)濃度的MPs和ROX暴露下，大型溞的攝食能力受到了顯著抑制，這可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體缺乏營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，從而對(duì)大型溞的繁殖能力產(chǎn)生抑制作用。

2.4 PS-MPs與ROX對(duì)大型溞的生理生化影響

生物體受到某些外源污染物的脅迫時(shí)，會(huì)引起其體內(nèi) ROS的含量增多。當(dāng) ROS的含量水平超出生物體自身的清除能力時(shí)，氧化脅迫隨即出現(xiàn)。作為抗氧化酶，SOD和CAT廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中。SOD能夠催化超氧化物陰離子發(fā)生歧化作用，生成過(guò)氧化氫和氧氣，然后通過(guò)CAT作用將過(guò)氧化氫分解生成水（Piddington et al.，2001）。CAT通常與 SOD聯(lián)合作用，建立起生物體對(duì)ROS脅迫的應(yīng)激防御機(jī)制。在本實(shí)驗(yàn)中，各暴露組大型溞的SOD活性和CAT活性相較于空白實(shí)驗(yàn)組都有較明顯的降低（圖 4）；PS-MPs單獨(dú)暴露組和 ROX單獨(dú)暴露組中大型溞的 SOD活性相較于空白實(shí)驗(yàn)組分別下降了 26.1%和13.7%，CAT活性分別下降了24.0%和56.0%，這表明MPs與ROX的存在使得大型溞受到污染脅迫，產(chǎn)生了大量 ROS，而大型溞體內(nèi)的抗氧化酶SOD和CAT不足以抵抗污染物引起的氧化脅迫，從而導(dǎo)致氧化損傷。有學(xué)者認(rèn)為，當(dāng)污染脅迫超過(guò)一定限度后，將會(huì)抑制抗氧化酶的合成，這時(shí)，抗氧化酶的清除速率低于ROS產(chǎn)生速率，導(dǎo)致其體內(nèi)積累過(guò)量的ROS而受到毒害（Basha et al.，2003），這可能是導(dǎo)致大型溞抗氧化酶活性降低的原因。

圖4 不同暴露處理48 h后大型溞（A）SOD活性和（B）CAT活性的變化Fig. 4 (A) SOD activity and (B) CAT activity variation of D. magna with different exposure treatments after 48 h exposure

在暴露48 h后，PS-MPs與ROX共同暴露組中大型溞的SOD和CAT活性相較于空白實(shí)驗(yàn)組均受到顯著抑制。在PS-MPs與ROX聯(lián)合暴露下，SOD的活性抑制率為 20.8%，高于 ROX單獨(dú)暴露的抑制率（13.7%），低于 PS-MPs單獨(dú)暴露的抑制率（26.1%），這說(shuō)明在 PS-MPs（250 μg·L-1）與 ROX（5 μg·L-1）的聯(lián)合作用下，對(duì)大型溞SOD活性產(chǎn)生了簡(jiǎn)單相加作用；而CAT的活性在PS-MPs與ROX聯(lián)合暴露下的抑制率為 60%，略大于 PS-MPs和ROX單體暴露的抑制率（抑制率分別為 24%和56%），因此我們認(rèn)為在 PS-MPs（250 μg·L-1）與ROX（5 μg·L-1）共同存在的情況下，會(huì)對(duì)大型溞CAT活性產(chǎn)生輕微的協(xié)同作用。此外，在本實(shí)驗(yàn)中，共同暴露組中大型溞的SOD活性與PS-MPs單獨(dú)暴露組和 ROX單獨(dú)暴露組均沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），這表明二者共同暴露并沒(méi)有顯著增加對(duì)大型溞的氧化脅迫。Zhang et al.（2019）等將大型溞暴露于的粒徑為 1 μm 的 PS-MPs（100 μg·L-1）和 ROX（10 μg·L-1）后也發(fā)現(xiàn)聯(lián)合暴露組與單一暴露組中大型溞的SOD活性沒(méi)有顯著性差異，并且觀察到了PS-MPs單一暴露或者與ROX聯(lián)合引起的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GPx）的顯著降低，這表明二者單獨(dú)或共存情況下均會(huì)對(duì)大型溞造成氧化損傷。Fonte et al.（2016）在研究頭孢氨芐與PE-MPs對(duì)蝦虎魚(yú)的聯(lián)合效應(yīng)時(shí)，同樣發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)合暴露與PE-MPs單獨(dú)暴露對(duì)蝦虎魚(yú)的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷（Lipid Peroxidation，LPO）影響沒(méi)有顯著差異，該學(xué)者認(rèn)為水中 PE-MPs會(huì)在一定程度上減輕頭孢氨芐對(duì)蝦虎魚(yú)的毒性。此外，有研究者者發(fā)現(xiàn)PS-MPs與 ROX共存能夠顯著降低紅羅非魚(yú)肝臟中丙二醛（MDA）含量，該學(xué)者認(rèn)為 PS-MPs可以通過(guò)吸附其他污染物減輕對(duì)生物體的氧化損害（Zhang et al.，2019）?，F(xiàn)階段有關(guān)MPs和抗生素聯(lián)合毒性的研究大多集中于魚(yú)類、貽貝等高營(yíng)養(yǎng)級(jí)水生生物，而有關(guān)大型溞等浮游動(dòng)物的毒性研究卻鮮有報(bào)道，本研究結(jié)果顯示在MPs和ROX共存情況下，對(duì)大型溞的抗氧化酶活性產(chǎn)生的明顯的抑制作用，但是其中的機(jī)理還尚未明晰，亟待開(kāi)展深入研究。

3 結(jié)論

本文研究了0.1 μm PS-MPs和ROX對(duì)浮游生物斜生柵藻和大型溞的單一與聯(lián)合毒性。結(jié)果表明，MPs和ROX單一與聯(lián)合暴露對(duì)斜生柵藻的生長(zhǎng)以及光合作用均有明顯的抑制作用，但是二者聯(lián)合毒性并沒(méi)有比單一毒性更加顯著；MPs和 ROX單一與聯(lián)合暴露對(duì)大型溞的牧食率和濾水率均有明顯的抑制作用，在二者共存的情況下，PS-MPs能夠降低ROX對(duì)大型溞覓食行為的影響；MPs與ROX對(duì)大型溞的SOD和CAT等抗氧化酶活性有著一定的抑制作用，在二者共存條件下，會(huì)對(duì)大型溞SOD活性產(chǎn)生相加作用，對(duì)CAT活性產(chǎn)生輕微的協(xié)同作用。本研究結(jié)果可為新興污染物在水環(huán)境中聯(lián)合毒性的深入了解提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)可為其在水環(huán)境中的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和控制提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。