板藍(lán)根指標(biāo)成分分布分析及藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

鐘昆芮，王亞芳，張連彥，周艷飛，高 婷

（北京市獸藥監(jiān)察所，北京102629）

板藍(lán)根為十字花科菘藍(lán)的干燥根（Isatis indigotica Fort.）的干燥根，是我國(guó)治療感冒常用傳統(tǒng)大宗中藥材，能清熱解毒、扶正固本，研究表明板藍(lán)根具有抗病毒、抗菌、抗炎、解熱、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等作用。隨著養(yǎng)殖環(huán)節(jié)獸用抗菌藥減量化行動(dòng)開展，尋求良好的抗生素替代品勢(shì)在必行，板藍(lán)根既能防病更能治病，在減抗、替抗方面具有優(yōu)勢(shì)，種植產(chǎn)區(qū)逐年擴(kuò)大，不同產(chǎn)區(qū)板藍(lán)根品質(zhì)和外觀性狀差異較大，板藍(lán)根藥源穩(wěn)定性、種植區(qū)域選擇、藥材資源合理規(guī)劃不確定性凸顯［1-3］，因此板藍(lán)根中有效成分含量分布情況和質(zhì)量評(píng)價(jià)體系亟待研究補(bǔ)充。

2015版《中國(guó)獸藥典》中板藍(lán)根注射液含量測(cè)定指標(biāo)成分為（R，S）-告依春，而精氨酸、靛藍(lán)、靛玉紅及核苷類成分（鳥苷、尿苷、腺苷）具有抗病毒［4-5］、消炎抑菌［6］、抗氧化［7-8］等藥理活性且含量所占比例較高，亦被廣泛用作指標(biāo)成分衡量藥材質(zhì)量。

本文測(cè)定并分析河北、甘肅、東北、山東等11個(gè)不同產(chǎn)地來(lái)源板藍(lán)根中精氨酸、靛藍(lán)、靛玉紅、鳥苷、尿苷、腺苷和（R，S）-告依春的含量分布情況，綜合多成分進(jìn)行各產(chǎn)地板藍(lán)根質(zhì)量評(píng)價(jià)研究，補(bǔ)充板藍(lán)根藥源選擇依據(jù)，為板藍(lán)根藥材資源的合理規(guī)劃提供參考。

1 儀器與材料

Agilent 1260高效液相色譜儀，Alltech 2000ES蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，Waters e2695高效液相色譜儀，2998 PDA檢測(cè)器，DTL-500型超聲波清洗機(jī)（北京德泰隆科技發(fā)展有限責(zé)任公司），超純水機(jī)（Milli-Q 公司，Advantage A10）。

試劑三氟乙酸和甲醇均為色譜純（Fisher Chemical），N，N-二甲基甲酰胺為分析純（北京化工廠），水為自制高純水。精氨酸（批號(hào)140685-201707），鳥苷（批號(hào) 111977-201501），尿苷（批號(hào)110887-201803），腺苷（批號(hào) 110879-201703），靛藍(lán)（批號(hào)110716-201612），靛玉紅（批號(hào)110717-200204），（R，S） - 告依春 （批號(hào) 111753-201706），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

2 方 法

2.1 指標(biāo)成分含量測(cè)定

2.1.1 精氨酸 色譜柱 ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫 30 ℃；流動(dòng)相水 -三氟醋酸 （100 ∶0.2），流速 0.3 mL／min；蒸發(fā)光檢測(cè)器漂移管溫度110℃，載氣流量2.5 L／min。取精氨酸對(duì)照品12.5 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取2 mL，置10 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。取通過(guò)3號(hào)篩的供試品粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞瓶中，精密加流動(dòng)相50 mL，超聲處理30 min，放至室溫，濾過(guò)；精密量取續(xù)濾液2 mL，置10 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，作為供試品溶液。

2.1.2 靛藍(lán)、靛玉紅 色譜柱 Kromasil 100-5C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相水 - 甲醇（70 ∶30），流速 1 ml／min，柱溫 30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm。分別取靛藍(lán)、靛玉紅對(duì)照品2.5 mg，置同一100 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺溶解，超聲30 min，N，N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液。取通過(guò)3號(hào)篩的供試品粉末約5 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加甲醇-三氯甲烷（400∶100）50 mL，超聲處理30 min，放冷至室溫，濾過(guò)，濾液回收溶劑至干，N，N-二甲基甲酰胺溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶，定容置刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.1.3 核苷類、（R，S） -告依春 Atlantis T3 色譜柱（4.6 mm ×150 mm，5 μm），流動(dòng)相甲醇（A） -水（B）梯度洗脫（0 ～3 min，3%A；3 ～20 min，3% ～10%A；20 ～40 min，10% ～70%A；40 ～50 min，70%A；50.01 ～60 min，3%A），流速 0.8 mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm。取通過(guò)3號(hào)篩的供試品粉末約0.5 g，精密加50%甲醇溶液50 mL，超聲30 min，離心（6000 r／min，5 min），取上清液，作為供試品溶液。分別取尿苷、鳥苷、腺苷對(duì)照品20 mg精密稱定，置100 mL量瓶中，加50%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，精密量取1 mL，置100 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度。取（R，S）-告依春對(duì)照品20 mg精密稱定，置100 mL量瓶中，加50%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度。

2.2 指標(biāo)成分分布分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析技術(shù)，以因子分析提取對(duì)不同產(chǎn)地板藍(lán)根評(píng)價(jià)貢獻(xiàn)率大的主因子，進(jìn)一步選取藥材評(píng)價(jià)指標(biāo)成分。KMO和Bartlett檢驗(yàn)判斷變量是否適合因子分析，結(jié)合碎石圖和因子貢獻(xiàn)率選擇主因子，因子載荷值經(jīng)Kaiser標(biāo)準(zhǔn)化正交旋轉(zhuǎn)法旋轉(zhuǎn)以明確因子的含義，選取評(píng)價(jià)指標(biāo)成分。根據(jù)成分得分系數(shù)矩陣計(jì)算主因子得分，由此進(jìn)一步計(jì)算不同產(chǎn)地板藍(lán)根綜合評(píng)分并排序。以選取的評(píng)價(jià)指標(biāo)成分含量作為變量，對(duì)產(chǎn)地進(jìn)行Q型聚類分析，聚類方法為組間聯(lián)接法，樣品間距離選擇平方Euclidean距離。結(jié)合各產(chǎn)地板藍(lán)根因子分析綜合得分排名順序和聚類分析產(chǎn)地分類結(jié)果，結(jié)合聚類分析結(jié)果和因子分析綜合排名分析指標(biāo)成分分布情況，評(píng)價(jià)各產(chǎn)地板藍(lán)根藥材質(zhì)量。

3 結(jié)果與分析

3.1 含量測(cè)定 指標(biāo)成分精氨酸、靛藍(lán)、靛玉紅、鳥苷、尿苷、腺苷和（R，S）-告依春含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同產(chǎn)地來(lái)源板藍(lán)根中指標(biāo)成分含量Tab 1 Index component content of Radix Isatidis from different origins

3.2 評(píng)價(jià)指標(biāo)成分選取 KMO和Bartlett檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1（1），Sig值小于顯著水平 0.05，表明7個(gè)指標(biāo)成分間存在相關(guān)關(guān)系，KMO值越接近1越適合因子分析，發(fā)現(xiàn) KMO 值0.446偏低（ ＜0.5），精氨酸變量共同度0.569偏低，選取除精氨酸外6個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行KMO和 Bartlett檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1（2），KMO 值為 0.638，指標(biāo)成分變量共同度高，表明指標(biāo)成分中大部分信息能被因子提取，因子分析結(jié)果有效因子特征值碎石圖見(jiàn)圖2，碎石圖以斜率解釋變異，可見(jiàn)因子1、2斜率大、連線陡峭，從因子3開始斜率變平緩，此后的因子對(duì)變異的解釋逐漸減小。因子對(duì)板藍(lán)根藥材評(píng)價(jià)的貢獻(xiàn)率表見(jiàn)圖3，因子1的特征值為 3.866（＞1），占總特征值的64.441%，因子2 的特征值為 1.342（ ＞1），占總特征值的22.365%，結(jié)合碎石圖和因子貢獻(xiàn)率選擇因子1和2作為主因子，二者占特征值累積百分比高達(dá) 86.806%。

圖1 因子分析可行性判斷Fig 1 Feasibility judgment of factor analysis

圖2 因子特征值碎石Fig 2 Gravel of factor eigenvalue

經(jīng)Kaiser標(biāo)準(zhǔn)化正交旋轉(zhuǎn)法得到旋轉(zhuǎn)后的因子載荷值，結(jié)果見(jiàn)圖4～圖5，因子1上載荷較大的指標(biāo)成分為鳥苷、尿苷、腺苷，因子2上載荷較大的指標(biāo)成分為靛藍(lán)、靛玉紅，此5種指標(biāo)成分對(duì)板藍(lán)根藥材評(píng)價(jià)起到關(guān)鍵作用。（R，S）-告依春在主因子1、2上的載荷值均極低，表明其在板藍(lán)根產(chǎn)地差異性解釋上貢獻(xiàn)小。

各指標(biāo)成分得分系數(shù)矩陣見(jiàn)圖6，依據(jù)成分得分系數(shù)矩陣計(jì)算得不同產(chǎn)地來(lái)源的11個(gè)板藍(lán)根樣品因子1、2的因子得分F1和F2，以各因子的方差貢獻(xiàn)率為權(quán)，由各因子線性組合得到綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)函數(shù)Z＝（a1F1＋ a2F2＋… ＋ aiFi）／（ a1＋ a2＋…＋ai），為即板藍(lán)根綜合因子得分表達(dá)式為Z＝（64.441% ×F1＋22.365% × F1） ／86.806%，以上表達(dá)式計(jì)算得不同產(chǎn)地板藍(lán)根綜合因子得分并排序，結(jié)果見(jiàn)表2。

3.3 產(chǎn)地分析 以不同產(chǎn)地來(lái)源的11個(gè)板藍(lán)根樣品中鳥苷、尿苷、腺苷、靛藍(lán)、靛玉紅的含量作為變量進(jìn)行聚類分析，聚類結(jié)果見(jiàn)圖9，直觀分布見(jiàn)圖10。

圖3 因子貢獻(xiàn)率Fig 3 Factor contribution rate

圖4 旋轉(zhuǎn)的因子載荷Fig 4 Rotated factor load

圖6 成分得分系數(shù)矩陣Fig 6 Component score coefficient matrix

圖5 旋轉(zhuǎn)空間中的成分Fig 5 Components in the rotating space

表2 主因子得分及綜合得分排名Tab 2 Main factor score and comprehensive score ranking

圖9 聚類分析樹形圖Fig 9 Cluster analysis tree

圖10 產(chǎn)區(qū)分布直觀圖Fig 10 Production area distribution map

聚類樹形圖給出聚類每一次合并的情況，將不同產(chǎn)地來(lái)源的11個(gè)板藍(lán)根樣品藥材分為三類：東北（1號(hào)和5號(hào)）、甘肅（8號(hào)）和黑龍江（9號(hào)）產(chǎn)地距離較近，歸為一類，安國(guó)（4號(hào)）、安徽（6號(hào)）、甘肅（3號(hào)）、山東（7號(hào)）產(chǎn)地距離較近歸為一類，根據(jù)樹形圖判斷此兩類距離較近，品質(zhì)較為接近。第三類為河北（2號(hào)和11號(hào)）、東北（10號(hào)），此類與前兩類距離遠(yuǎn)，表明這三個(gè)產(chǎn)地板藍(lán)根樣品與其余樣品有明顯的差異。

3.4 分布分析和質(zhì)量評(píng)價(jià) 各產(chǎn)地板藍(lán)根因子分析綜合得分排名順序見(jiàn)表3，與聚類結(jié)果結(jié)合分析發(fā)現(xiàn)與其他產(chǎn)地距離較遠(yuǎn)的第三類板藍(lán)根樣品綜合排名最高，其中排名前二的板藍(lán)根樣品產(chǎn)地為河北（11號(hào)和2號(hào)）表明河北產(chǎn)板藍(lán)根品質(zhì)最佳。

表3 不同產(chǎn)地來(lái)源板藍(lán)根綜合排序表Tab 3 Comprehensive sorting of Radix Isatidis from different origins

結(jié)合聚類分析結(jié)果和因子分析綜合排名，板藍(lán)根主要分為三大產(chǎn)區(qū)，即東三省北部產(chǎn)區(qū)、河北中部產(chǎn)區(qū)和甘肅-山東-安徽南部產(chǎn)區(qū)，直觀圖見(jiàn)圖10。

4 討論與結(jié)論

東北產(chǎn)10號(hào)板藍(lán)根因子分析綜合得分排名第三，但聚類第一類板藍(lán)根樣品幾乎全部產(chǎn)自東北，綜合得分排名靠后，觀察到10號(hào)板藍(lán)根來(lái)源與綜合得分排名第一的板藍(lán)根樣品一致，表明同一產(chǎn)區(qū)板藍(lán)根品質(zhì)存在差異，可能種植技術(shù)在一定程度上決定板藍(lán)根品質(zhì)。甘肅產(chǎn)區(qū)3號(hào)樣品與8號(hào)樣品綜合得分分差較大，且聚類分析結(jié)果分屬兩類，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)甘肅產(chǎn)區(qū)內(nèi)板藍(lán)根品質(zhì)差異明顯［10-12］，可能與甘肅省板藍(lán)根種植面積廣，覆蓋地貌豐富有關(guān)，可在建立多指標(biāo)成分評(píng)價(jià)體系下進(jìn)一步深入研究板藍(lán)根品質(zhì)影響因素。

（R，S）-告依春在對(duì)不同產(chǎn)地板藍(lán)根差異性解釋上貢獻(xiàn)小，提示（R，S）-告依春含量不僅與板藍(lán)根產(chǎn)區(qū)相關(guān)；因子分析中精氨酸變量共同度低，其信息不能大部分地被因子提取，表明精氨酸變量在反映研究對(duì)象板藍(lán)根的角度與所建立的評(píng)價(jià)體系有區(qū)別。然而除靛藍(lán)、核苷類成分外，（R，S）-告依春和精氨酸與板藍(lán)根與抑制流感病毒藥理活性亦關(guān)系密切［4，12］，二者分布規(guī)律尚待進(jìn)一步闡明，由此可從應(yīng)用角度選擇不同評(píng)價(jià)指標(biāo)或建立多重評(píng)價(jià)體系。