兩種中藥顆粒劑對(duì)正常小鼠免疫細(xì)胞因子調(diào)節(jié)作用的研究

葉志惠，蘭新財(cái)，歐 彬，趙麗麗，麻軍法，盧 駿

（浙江金大康動(dòng)物保健品有限公司，浙江金華321016）

機(jī)體免疫系統(tǒng)擔(dān)負(fù)著調(diào)節(jié)各細(xì)胞間多種生理功能的任務(wù)，而發(fā)揮這些重要調(diào)節(jié)功能的蛋白質(zhì)之一是細(xì)胞因子。IL-2、IFN-γ、TNF等細(xì)胞因子主要介導(dǎo)與細(xì)胞免疫有關(guān)的免疫應(yīng)答，IL-4等細(xì)胞因子主要參與體液免疫。IL-2可促進(jìn)T細(xì)胞生長(zhǎng)、B細(xì)胞增殖分化，增強(qiáng)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的殺傷作用，提高NK細(xì)胞活性；IL-4在調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞的分化和活化，促進(jìn)以Th2細(xì)胞為特征的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。

隨著養(yǎng)殖集約化程度的不斷提高，因免疫抑制性疾病、霉菌毒素中毒、抗生素濫用、應(yīng)激等造成免疫抑制問題較為突出，補(bǔ)益類中藥和方劑對(duì)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

芪貞增免顆粒被收載于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，并已獲得發(fā)明專利授權(quán)；人參莖葉總皂苷顆粒為國(guó)家三類新獸藥。該兩種中藥顆粒劑在增強(qiáng)體液免疫方面已進(jìn)行了大量研究工作，為了進(jìn)一步考察該兩種中藥顆粒劑對(duì)正常小鼠IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF等細(xì)胞因子的作用，特進(jìn)行本試驗(yàn)，為下一步進(jìn)行芪貞增免顆粒和人參莖葉總皂苷顆粒的臨床研究和推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 試驗(yàn)藥物 芪貞增免顆粒（由浙江金大康動(dòng)物保健品有限公司提供，批號(hào)：20180505，試驗(yàn)給藥劑量定為低劑量組 0.3 g／kg·bw，高劑量組 0.9 g／kg·bw）。

人參莖葉總皂苷顆粒（由浙江金大康動(dòng)物保健品有限公司提供，批號(hào)：20180506，試驗(yàn)給藥劑量定為低劑量組50 mg／kg·bw，高劑量組150 mg／kg·bw）。

以上兩種中藥顆粒劑的低劑量組為臨床推薦用量，高劑量組為臨床推薦用量的3倍。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 ICR小鼠，SPF級(jí)，體重為18～20 g，雌雄各半。南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供。

1.3 試驗(yàn)材料 小鼠血清 IL-2、IL-4、TNF-α及INF-γ細(xì)胞因子含量ELISA試劑盒：采購(gòu)自南京建成生物工程有限公司，生產(chǎn)批號(hào)均為201806。注射器、灌胃針、燒杯、解剖器械、電子天平等。

2 方 法

2.1 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于清潔、安靜的環(huán)境中，環(huán)境溫度控制在20℃左右，自然光照，飼喂鼠全價(jià)顆粒料（采購(gòu)自南京江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁育場(chǎng)，生產(chǎn)批號(hào)：2018060501），自由采食和飲水。試驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，觀察其健康狀況，選擇健康、營(yíng)養(yǎng)狀況良好的進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2 試驗(yàn)分組 將芪貞增免顆粒與人參莖葉總皂苷顆粒分別配置成高、低兩個(gè)濃度，每天每只小鼠灌胃不同濃度的溶液0.1 mL／10 g。試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為5組，分別為對(duì)照組及兩個(gè)藥物的高劑量組、低劑量組，每組10只，雌雄各半。試驗(yàn)期15 d。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

2.3.1 一般狀態(tài) 分別于試驗(yàn)開始、第 7 d、第15 d每天早上于固定時(shí)間點(diǎn)測(cè)定各組小鼠的飲食量、飲水量、體重，觀察小鼠外觀、精神狀態(tài)等變化情況。

2.3.2 胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)測(cè)定 小鼠末次給藥后12 h，禁食不禁水，稱量體重、眼球采血后，脫頸處死，剖取胸腺和脾臟，濾紙吸取表面殘血及多余水分，稱取濕重，計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。

2.3.3 小鼠血清細(xì)胞因子含量檢測(cè) 小鼠眼球采血后靜置2 h，4000 rpm離心，收集血清，分裝，于-20℃保存。按照ELISA試劑盒說明，檢測(cè)小鼠血清細(xì)胞因子IL-2、IL-4、TNF-α及INF-γ含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 臨床表現(xiàn) 試驗(yàn)過程中，各組小鼠精神狀態(tài)良好，毛發(fā)順暢，采食飲水正常，糞便干燥無(wú)異常，未觀察到臨床可見的異常情況（見圖1）。試驗(yàn)結(jié)束后，剖檢大體檢查，內(nèi)臟器官均正常，無(wú)可見的大體病變（見圖2）。

3.2 小鼠體重變化 從表1可知，整個(gè)試驗(yàn)過程中兩種中藥顆粒劑的高劑量組和低劑量組小鼠的不同時(shí)間的體重均與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。表明兩種中藥顆粒劑對(duì)小鼠的生長(zhǎng)基本無(wú)影響。

圖1 試驗(yàn)小鼠外觀正常Fig 1 The appearance of the test mice was normal

圖2 解剖無(wú)可見病變Fig 2 No visible lesion in anatomy

表1 對(duì)小鼠體重的影響（單位：g）Tab 1 Effects on body weight of mice

3.3 對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響

由表2可見，兩種中藥顆粒劑高、低劑量組對(duì)雌性小鼠的脾臟和胸腺的器官指數(shù)均影響較小，未見顯著差異，但各給藥組對(duì)雄性小鼠的胸腺均有較顯著的促進(jìn)作用（P＜0.05），但對(duì)脾臟的影響較小，人參莖葉總皂苷高劑量組的脾臟指數(shù)顯著小于對(duì)照組（P ＜0.01）。

表2 對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響Tab 2 Effect on immune organ index in mice

3.4 對(duì)血清細(xì)胞因子含量的影響

由表3可見，兩種中藥顆粒劑的低劑量組均能夠顯著的促進(jìn)雌性小鼠的血清IL-2、IL-4和TNF-α的分泌（P＜0.01），其中芪貞增免顆粒和人參莖葉總皂苷顆粒的低劑量組同時(shí)對(duì)雌性小鼠的血清IFN-γ有極顯著的促進(jìn)作用（P＜0.01）；人參莖葉總皂苷顆粒的低劑量組對(duì)雄性小鼠的血清IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α具有顯著的促進(jìn)作用（P＜0.05），但高劑量組則差異不顯著，同時(shí)芪貞增免顆粒的低劑量組對(duì)雄性小鼠的IL-4和IFN-γ也有顯著的促進(jìn)作用，但其他指標(biāo)影響不大。從總體試驗(yàn)結(jié)果看，兩種中藥顆粒劑的低劑量組對(duì)小鼠血清幾種細(xì)胞因子的促進(jìn)作用要優(yōu)于高劑量組。

表3 對(duì)細(xì)胞因子IL-2、IL-4的影響Tab 3 Effect on cytokines IL-2 and IL-4

表4 對(duì)細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α的影響Tab 4 Effect on cytokines IFN-γ and TNF-α

4 討論與結(jié)論

4.1 芪貞增免顆粒和人參莖葉總皂苷顆粒對(duì)小鼠血清中IL-2的影響 IL-2是由T淋巴細(xì)胞在促有絲分裂素或特異性抗原刺激下產(chǎn)生的，在機(jī)體免疫反應(yīng)中具有重要調(diào)節(jié)作用的一種淋巴因子，IL-2具有廣泛的生物學(xué)特性：促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的克隆擴(kuò)增，通過T淋巴細(xì)胞數(shù)目增多及CD4＋T細(xì)胞活性的增強(qiáng)提高機(jī)體的免疫功能［1］；促進(jìn)胸腺細(xì)胞的分裂，并由IL-2與T或B淋巴細(xì)胞表面特異受體相互作用，誘導(dǎo)合成DNA；使靜止的前細(xì)胞毒T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞，以發(fā)揮其細(xì)胞毒作用［2］；提高自然殺傷細(xì)胞的活性；協(xié)同刺激B細(xì)胞增殖和分泌Ig［3］；調(diào)控免疫干擾素的釋放，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生干擾素等，從而進(jìn)一步增強(qiáng)了機(jī)體的免疫功能。

試驗(yàn)中，兩種中藥顆粒劑的不同劑量均能夠顯著的促進(jìn)雌性小鼠血清IL-2的分泌，并且人參莖葉總皂苷的低劑量對(duì)雄性小鼠也有極顯著的促進(jìn)作用，芪貞增免顆粒兩個(gè)劑量雖能一定程度上提高，但是差異不顯著（P ＞0.05）。

4.2 芪貞增免顆粒和人參莖葉總皂苷顆粒對(duì)小鼠血清IL-4的影響 有學(xué)者認(rèn)為，Th1／Th2通過自身或其它免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子進(jìn)行自我調(diào)節(jié)和相互調(diào)節(jié)，維持 Thl／Th2細(xì)胞之間的免疫平衡［4］。 Thl／Th2的平衡狀態(tài)作為機(jī)體免疫平衡的核心，在機(jī)體的內(nèi)環(huán)境特別是免疫系統(tǒng)穩(wěn)定方面起著重要調(diào)節(jié)作用。Abehsira-Amor等［5］證實(shí) IL-4對(duì)Th0細(xì)胞分化為Th1和Th2起著關(guān)鍵性調(diào)控作用。IL-4是II型輔助T細(xì)胞（Th2細(xì)胞）分泌的細(xì)胞因子。IL-4的生物作用，包括刺激活化B細(xì)胞和T細(xì)胞增殖、CD4＋T細(xì)胞分化成II型輔助T細(xì)胞。它也在調(diào)節(jié)體液免疫和適應(yīng)性免疫中起關(guān)鍵作用。

試驗(yàn)中，兩種中藥顆粒劑的不同劑量均能夠極顯著的提高血清中IL-4的含量，同時(shí)低劑量組對(duì)雄性小鼠的IL-4也有顯著的提升作用，但是高劑量組卻沒有達(dá)到顯著水平。

4.3 芪貞增免顆粒和人參莖葉總皂苷顆粒對(duì)小鼠血清IFN-γ的影響 干擾素是細(xì)胞受到適度的刺激后產(chǎn)生的一種微量的、具有廣泛生物學(xué)活性的糖蛋白，一般可分為IFN-α、IFN-β和IFN-γ。其中IFN-γ的抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用均比IFN-α和IFN-β強(qiáng)。現(xiàn)代研究表明，許多中藥能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ，且中藥具有來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉及毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)。

試驗(yàn)中，兩種中藥顆粒劑的低劑量組均可極顯著提高小鼠血清中IFN-γ含量，但是兩種中藥顆粒劑的高劑量組與對(duì)照組相比雖有升高但是差異不顯著。兩種中藥顆粒劑中活性成分本身就是免疫活性物質(zhì)，所含的多糖與皂甙，能夠促進(jìn)機(jī)體網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能，提高免疫細(xì)胞活性，誘導(dǎo)干擾素等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而提高機(jī)體免疫力。

4.4 芪貞增免顆粒和人參莖葉總皂苷顆粒對(duì)小鼠血清TNF-α的影響 TNF按結(jié)構(gòu)可分為TNF-α和TNF-β，目前對(duì)TNF-β功能所知有限，研究較多的是TNF-α。TNF-α來(lái)源廣泛，體內(nèi)的多種細(xì)胞，如單核／巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞和星形細(xì)胞等均具有產(chǎn)生和釋放TNF-α的能力，是機(jī)體維持內(nèi)部自穩(wěn)、抵抗各種致病因素不可或缺的免疫調(diào)節(jié)因子［6］。TNF-α具有廣泛的生物學(xué)功能：強(qiáng)大的抗腫瘤作用，可直接殺傷腫瘤細(xì)胞及抑制DNA的合成；可活化巨噬細(xì)胞，增加NK細(xì)胞活性，誘生如 IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、CSF 等多種免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)，還能調(diào)節(jié)T、B淋巴細(xì)胞的增殖和分化，在宿主防御機(jī)制中起重要作用［7］。

試驗(yàn)中，兩種中藥顆粒劑對(duì)雌性小鼠的血清TNF-α的含量具有極顯著的促進(jìn)作用，人參莖葉總皂苷顆粒的低劑量組對(duì)雄性小鼠亦有極顯著的促進(jìn)作用，芪貞增免顆粒對(duì)雄性小鼠的TNF-α雖有提升但是差異不顯著。

通過試驗(yàn)研究，芪貞增免顆粒和人參莖葉總皂苷顆粒在一定劑量范圍內(nèi)能夠顯著提高小鼠血清IL-2、IL-4、IFN-γ 和 TNF-α 的分泌，對(duì)雌性小鼠的作用尤為顯著。表明該兩種中藥顆粒劑具有顯著提高小鼠相關(guān)免疫細(xì)胞因子的作用。對(duì)下一步該兩種中藥顆粒劑的臨床研究和推廣應(yīng)用具有重要意義。