牛蒡苷元及牛蒡子提取物的急性毒性試驗(yàn)研究

何 斌，冉志平，周 琦，張海靜，楊文海，邵志勇，吳利軍，陳夏冰，陳 潔，操繼躍

（1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢430208；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，武漢430070；3.天津市寶坻區(qū)畜牧水產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，天津301800）

牛蒡子是一種常用中藥，具有疏散風(fēng)熱、宣肺透疹功效，臨床上用于治療外感風(fēng)熱、咳嗽氣喘、咽喉腫痛等癥［1］。牛蒡苷元為牛蒡子和牛蒡子提取物的直接有效成分［2］，具有抗炎［3］、抗病毒［4］、抗腫瘤［5］、抗糖尿?。?］等眾多藥理作用，具有良好的研發(fā)和應(yīng)用前景；目前，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)牛蒡苷元及牛蒡子提取物的安全性評(píng)級(jí)研究，本文根據(jù)獸藥指導(dǎo)原則經(jīng)口給藥急性毒性試驗(yàn)要求，研究了牛蒡苷元及牛蒡子水提物在昆明小鼠體內(nèi)經(jīng)口給藥后的急性毒性，為新獸藥的研發(fā)和臨床用藥提供理論資料，為中獸藥現(xiàn)代化進(jìn)行有意義的探索。

1 材 料

1.1 儀器設(shè)備 注射器、燒杯、小鼠灌胃針；小鼠獨(dú)立送風(fēng)（IVC）系統(tǒng)；手術(shù)剪、鑷子，JY2002型電子天平、島津AUY2002型分析天平等。

1.2 藥品與試劑 牛蒡苷元：含量98.12%，由武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所動(dòng)物疾病防控學(xué)科實(shí)驗(yàn)室自制；牛蒡子提取物：牛蒡苷元含量3.10%，由武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所動(dòng)物疾病防控學(xué)科實(shí)驗(yàn)室自制，使用時(shí)，用0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液配制成混懸液；羧甲基纖維素鈉：由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，使用時(shí)，用蒸餾水配制成0.5%的水溶液，冷處放置，限7 d內(nèi)使用。二甲亞砜、丙二醇、乙醇：購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要溶液的配制 牛蒡苷元溶液的制備：分別準(zhǔn)確稱(chēng)取牛蒡苷元 200.0、159.0、126.0、100.0、79.5、63.0、50.0 mg，置于 10 mL 容量瓶中，加入少量二甲亞砜助溶，配制成濃度分別為20.0、15.9、12.6、10.0、7.95、6.3、5.0 mg／mL 的牛蒡苷元溶液，灌胃前充分搖勻。

0.5%羧甲基纖維素鈉的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g羧甲基纖維素鈉，溶解于100 mL蒸餾水中，保存于4℃冰箱內(nèi)，限7 d內(nèi)使用。

牛蒡子提取物的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取牛蒡子提取物15.0 g，溶解于50 mL的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中，配成均勻混懸液，濃度為 0.3 g／mL，現(xiàn)配現(xiàn)用，灌胃前充分搖勻。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種小鼠，120只，雌雄各半，3～4周齡，體重18～22 g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2008-0005。小鼠購(gòu)買(mǎi)后在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房?jī)?nèi)預(yù)飼養(yǎng)一周，飼料為全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（鄂）2014-0081。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中保持室內(nèi)清潔衛(wèi)生，空氣流通。小鼠每籠5只，雌雄分開(kāi)，自由飲水、采食。室溫控制在20～25℃，相對(duì)濕度40% ～70%，照明采用12 h／12 h晝夜明暗交替，每周更換2次墊料。

2 方 法

2.1 動(dòng)物分組與劑量設(shè)計(jì)

2.2.1 牛蒡苷元實(shí)驗(yàn)組 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，將80只昆明小鼠隨機(jī)分成8組，每組10只，雌雄各半。設(shè)置7個(gè)給藥組及1個(gè)空白對(duì)照組，給藥組劑量分別為 400、318、252、200、159、126、100、0 mg／kg.bw。

2.1.2 牛蒡子提取物實(shí)驗(yàn)組 根據(jù)急性毒性預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，沒(méi)有出現(xiàn)小鼠死亡的情況，故進(jìn)行最大耐受量（MTD）的測(cè)定。將40只昆明小鼠隨機(jī)分成2組，為給藥組和溶媒對(duì)照組，每組20只，雌雄各半。按照牛蒡子提取物能溶解的最大濃度0.3 g／mL（同時(shí)藥液能通過(guò)灌胃針管），小鼠的最大灌胃給藥體積0.4 mL／10 g.bw 給藥，24 h 內(nèi)灌胃 3 次，3 次累計(jì)給予 1.2 mL／10 g.bw，相當(dāng)于牛蒡子提取物36 g／kg.bw，作為給藥組。溶媒對(duì)照組給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。

2.2 給藥

2.2.1 牛蒡苷元實(shí)驗(yàn)組 給藥前12～16 h動(dòng)物禁食不禁水，牛蒡苷元實(shí)驗(yàn)各組均按照0.2 mL／10 g.bw的給藥體積進(jìn)行一次性灌胃給藥；給藥后2 h給予飼料，自由飲水。

2.2.2 牛蒡子提取物實(shí)驗(yàn)組 給藥組小鼠灌胃給予牛蒡子提取物藥液（0.3 g／mL，0.4 mL／10 g.bw），抽取藥液時(shí)始終進(jìn)行攪拌，溶媒對(duì)照組給予等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，首次給藥后2 h給予飼料，自由飲水。24 h內(nèi)給藥3次，每次間隔時(shí)間6 h。

2.3 試驗(yàn)結(jié)果觀察

2.3.1 牛蒡苷元實(shí)驗(yàn)組 給藥后仔細(xì)觀察和詳細(xì)記錄小鼠出現(xiàn)的毒性反應(yīng)癥狀及開(kāi)始和消失時(shí)間，記錄小鼠的死亡數(shù)目及死亡時(shí)間。對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃給藥后連續(xù)觀察8 h，以后每天觀察記錄2次，連續(xù)觀察14 d。觀察并記錄小鼠毛色、眼睛、分泌物、排泄物、呼吸、自主活動(dòng)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)行為等的變化情況以及小鼠死亡時(shí)間和死亡表現(xiàn)，對(duì)所有死亡或處死小鼠進(jìn)行尸檢。

2.3.2 牛蒡子提取物實(shí)驗(yàn)組 3次給藥間隔期間連續(xù)觀察小鼠的反應(yīng)，最后一次給藥后再連續(xù)觀察4～6 h，以后每天觀察記錄2次，連續(xù)觀察14 d。詳細(xì)觀察并記錄小鼠給藥后的反應(yīng)，包括：神經(jīng)系統(tǒng)方面：行為及反應(yīng)（姿勢(shì)變化、不正常叫聲、煩躁不安、呆滯等）、運(yùn)動(dòng)（肌肉抽搐、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)、僵硬等）、瞳孔及分泌物（瞳孔有無(wú)縮小或放大、流淚、流涎等）。呼吸及心血管方面：呼吸急促或過(guò)緩、心跳過(guò)強(qiáng)或過(guò)弱、流鼻涕等。胃腸方面：腹部氣脹或收縮，腹瀉或便秘等。泌尿生殖系統(tǒng)方面：陰戶(hù)、乳腺腫脹、會(huì)陰部污穢等。皮膚和被毛方面：顏色、張力、完整性、有無(wú)發(fā)紅、皮疹等。黏膜和眼方面：有無(wú)充血、出血、黏液、眼球突出、震顫或渾濁等。

于給藥前和給藥最后一天對(duì)小鼠稱(chēng)重，并記錄。詳細(xì)記錄小鼠出現(xiàn)毒性反應(yīng)的癥狀、起始時(shí)間、嚴(yán)重程度、持續(xù)時(shí)間等，記錄小鼠死亡數(shù)目及死亡時(shí)間。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)所有小鼠進(jìn)行大體解剖，肉眼觀察各個(gè)器官有無(wú)異常，并與對(duì)照組進(jìn)行比較，當(dāng)組織器官出現(xiàn)顏色、質(zhì)地、體積等改變時(shí)，均應(yīng)記錄并進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，初步判斷可能的毒性靶器官。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示各劑量組動(dòng)物體重，進(jìn)行方差分析，并按動(dòng)物性別分別統(tǒng)計(jì)。

3 結(jié)果與分析

3.1 牛蒡苷元實(shí)驗(yàn)組 小鼠在給藥后15 min內(nèi)出現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)，表現(xiàn)為心跳加快、興奮、狂躁、驚厥、運(yùn)動(dòng)失調(diào)等，在出現(xiàn)角弓反張的掙扎后迅速死亡，如圖1。小鼠死亡主要發(fā)生在給藥后12 h內(nèi)，1 d后存活小鼠恢復(fù)正常。剖檢死亡小鼠，胃內(nèi)充滿(mǎn)淡黃色液體，其他臟器未見(jiàn)異常，如圖2。給藥后死亡數(shù)量見(jiàn)表1。

根據(jù)簡(jiǎn)化蔻氏LD50計(jì)算方法：

圖1 死亡結(jié)果Fig 1 Death result

圖2 解剖結(jié)果Fig 2 Anatomical result

表1 牛蒡苷元灌胃給藥后急性毒性死亡數(shù)量Tab 1 Acute oral toxicity test of arctigenin in mice

牛蒡苷元急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果表明：小鼠灌胃給予牛蒡苷元的半數(shù)致死量為219.8 mg／kg，死亡均發(fā)生在3 h以?xún)?nèi)，存活動(dòng)物均正常生長(zhǎng)。依據(jù)獸藥指導(dǎo)原則急性毒性分級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，牛蒡苷元屬中等毒級(jí)。

3.2 牛蒡子提取物實(shí)驗(yàn)組 給藥間隔期間和14 d觀察期內(nèi)，各組小鼠精神狀況良好，行為活動(dòng)正常，皮膚和被毛清潔，大小便正常，無(wú)異常分泌物，亦未見(jiàn)其他中毒反應(yīng)癥狀。至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)小鼠沒(méi)有出現(xiàn)死亡情況。

小鼠體重增長(zhǎng)正常，給藥組與溶媒對(duì)照組比較，體重變化差異不顯著（P＞0.05）。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行大體解剖，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎等主要臟器，均無(wú)異常變化。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 采用簡(jiǎn)化寇氏法計(jì)算小鼠口服牛蒡苷元的LD50及置信區(qū)間Tab 2 Using the simplified Karber＇s method calculation of mice orally arctigenin LD50 and confidence interval

表3 牛蒡子提取物小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果（S.D）Tab 3 Acute oral toxicity test of Arctii Fructus powder in mice（S.D）

表3 牛蒡子提取物小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果（S.D）Tab 3 Acute oral toxicity test of Arctii Fructus powder in mice（S.D）

注：給藥組與空白組比較，P＞0.05Note：Give medicine group compared with the control group， P ＞0.05

?

采用最大耐受量法（MTD）進(jìn)行測(cè)定牛蒡子提取物急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明：牛蒡子提取物的最大藥物濃度0.3 g／mL，小鼠的最大灌胃體積0.4 mL／10 g.bw，24 h內(nèi)進(jìn)行3次灌胃給藥，小鼠在14 d觀察期內(nèi)均沒(méi)有出現(xiàn)明顯中毒癥狀及死亡情況，得出該樣品的MTD值≥36 g／kg.bw，依據(jù)獸藥指導(dǎo)原則急性毒性分級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，該提取物屬實(shí)際無(wú)毒級(jí)［7］。

4 討論與結(jié)論

急性毒性試驗(yàn)是對(duì)動(dòng)物進(jìn)行1次給藥或在24 h內(nèi)進(jìn)行2～3次給藥，通過(guò)觀察動(dòng)物的中毒癥狀及死亡情況等指標(biāo)來(lái)判斷毒性反應(yīng)的性質(zhì)和程度，評(píng)價(jià)藥物的毒性大小的試驗(yàn)。在新藥研發(fā)過(guò)程中，通常要進(jìn)行急性毒性研究，所得到的結(jié)果可以初步探索藥物毒性作用大小和靶器官，并為其他毒性試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)提供參考。本試驗(yàn)采用昆明種小鼠進(jìn)行牛蒡苷元和牛蒡子提取物經(jīng)口給藥的急性毒性試驗(yàn)。

牛蒡苷元預(yù)試驗(yàn)過(guò)程中，100%致死劑量為400 mg／kg，0%致死劑量為100 mg／kg，確定Ⅳ為7，r為 1.26，因此確定各組劑量分別為 400、318、252、200、159、126、100 mg／kg.bw。 試驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠灌胃給予牛蒡苷元的半數(shù)致死量為219.8 mg／kg，死亡均發(fā)生在3 h以?xún)?nèi)，存活動(dòng)物均正常生長(zhǎng)，根據(jù)小鼠死亡時(shí)間和死亡特征，推測(cè)牛蒡苷元具有一定的神經(jīng)毒性，依據(jù)獸藥指導(dǎo)原則急性毒性分級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，牛蒡苷元屬中等毒級(jí)。牛蒡苷元較一般中草藥及中草藥提取物急性毒性大，雙黃連口服液對(duì)小白鼠最小致死量范圍為49.2～60.8 g／kg，根據(jù)中藥毒性分級(jí)可判斷雙黃連口服液為小毒［8］；中藥復(fù)方制劑“歸芪飲”灌服給藥的LD50為22.44 g／kg，按照毒理學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，LD50大于10000 mg／kg即屬于無(wú)毒性物質(zhì)，從而表明中藥復(fù)方制劑“歸芪飲”安全無(wú)毒［9］；銀黃連翹散急性毒性試驗(yàn)中，兩次重復(fù)試驗(yàn) LD50大于 5000 mg／kg，屬實(shí)際無(wú)毒［10］；這表明牛蒡苷元在獸醫(yī)臨床使用中需要注意其急性毒性所帶來(lái)的危害。

在進(jìn)行牛蒡子提取物預(yù)試驗(yàn)過(guò)程中，分別以36、18、9 g／kg.bw 的劑量進(jìn)行灌胃給藥，結(jié)果各劑量組小鼠均未出現(xiàn)死亡情況，且沒(méi)有表現(xiàn)出毒性癥狀，說(shuō)明牛蒡子粉的毒性低，無(wú)法進(jìn)行LD50的測(cè)定。故采用最大耐受量法，以預(yù)試驗(yàn)的最大劑量36 g／kg.bw（即牛蒡子粉的最大藥物濃度 0.3 g／mL，小鼠的最大灌胃體積 0.4 mL／10g.bw，24 h 內(nèi)灌胃3 次，3 次累計(jì)給予1.2 mL／10 g.bw）作為給藥劑量進(jìn)行灌胃給藥，在此劑量下，小鼠生長(zhǎng)狀況良好，無(wú)任何明顯中毒癥狀及死亡情況，小鼠體重增長(zhǎng)正常，給藥組與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行大體解剖，各臟器均無(wú)形態(tài)及顏色異常。試驗(yàn)結(jié)果為：雌雄小鼠急性經(jīng)口MTD均≥36 g／kg.bw，根據(jù)獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則對(duì)急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，牛蒡子粉為實(shí)際無(wú)毒級(jí)，這一研究結(jié)果符合中草藥綠色、安全的特性，提示其在獸醫(yī)臨床中可長(zhǎng)期使用。根據(jù)急性毒性試驗(yàn)的結(jié)果，可初步評(píng)價(jià)牛蒡子粉在短期內(nèi)用藥比較安全，為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)藥物的安全性，還需要對(duì)其進(jìn)行長(zhǎng)期毒性研究。