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    腎衰康灌腸液通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)HK-2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究?

    2019-08-22 01:37:28羅芯怡葉乃菁鄧榮榮李明權(quán)
    關(guān)鍵詞:腎衰含藥內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

    羅芯怡,葉乃菁,鄧榮榮,李明權(quán)

    (1.成都中醫(yī)藥大學(xué),成都 610075; 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,成都 610075)

    急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是常見(jiàn)的急危重癥,其死亡率高,缺乏有效的治療措施,臨床以對(duì)癥處理和腎臟替代治療為主,缺乏有效的治療藥物,嚴(yán)重威脅影響患者的生命安全和生存質(zhì)量。缺血性急性腎損傷是急性腎損傷的主要類型,占75%以上[1]。研究表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)引起促生存信號(hào)通路和促凋亡信號(hào)通路調(diào)控失衡,導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞過(guò)度凋亡,是缺血性急性腎損傷發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制[2-4]。ERS蛋白如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能調(diào)節(jié)蛋白(GRP78)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)源性轉(zhuǎn)錄因子(CHOP)等表達(dá)增加,可提高ERS狀態(tài)下細(xì)胞處理未折疊蛋白或抵御其他細(xì)胞應(yīng)激的能力[5]。

    腎衰康灌腸液是目前以急性腎損傷為適應(yīng)癥的惟一上市應(yīng)用的中成藥,具有確切的臨床療效,但腎衰康灌腸液在細(xì)胞層面對(duì)急性腎損傷的治療作用研究缺乏。為驗(yàn)證該藥的有效性,本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞)缺氧再?gòu)?fù)氧模型模擬腎缺血再灌注損傷,以排除在體各因素的影響,觀察細(xì)胞凋亡情況及GRP78、CHOP表達(dá)的變化,探討腎衰康灌腸液是否有抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激治療缺血性急性腎損傷的作用。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    健康新西蘭SPFWistar級(jí)大白兔6只,雌雄各半,體質(zhì)量 2.0~2.2 kg,購(gòu)自達(dá)碩公司[合格證號(hào)SCXK(川)2012-11],動(dòng)物分籠飼養(yǎng),保持室內(nèi)相對(duì)濕度(60±5)%,溫度20~22 ℃,室內(nèi)12 h明暗自動(dòng)切換,自由飲水,標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

    實(shí)驗(yàn)藥品:腎衰康灌腸液(大黃、黃芪、丹參、紅花組成),20 ml×10支/盒,海南天元制藥廠提供(批號(hào)Z46020083),常溫保存。對(duì)照灌腸液:PBS溶液,成都中醫(yī)藥大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室配置,保存于室溫中。

    1.3 試劑及儀器

    實(shí)驗(yàn)試劑: CHOP、GRP78抗體均由Abcam公司提供,HK-2細(xì)胞、DMEN/F12由Gibco公司提供, CFSE及PI染液由Sigma公司提供,細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒由BD公司提供,活性氧檢測(cè)試劑由Invitrogen公司提供等。 實(shí)驗(yàn)儀器:正置、倒置熒光顯微鏡(BX51,OLYMPUS/日本),流式儀(bio-rad),離心機(jī)(ST16R,Thereto/美國(guó)),超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1FD,蘇凈安泰),高頻數(shù)控超聲波清洗器(KQ-200TDB,昆山市超聲儀器有限公司),電泳系統(tǒng)(PowerPac Basic, Bio-rad/美國(guó)),恒溫震蕩箱(QYC-200型,上海福瑪), RT-PCR儀(PIKORed96,美國(guó)ThermoFisher儀器有限公司)、冰柜(DW-40 W 100,海爾)等。

    1.4 實(shí)驗(yàn)方法

    1.4.1 含藥血清的制備及標(biāo)本采集 動(dòng)物飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室,購(gòu)買后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常血清組、空白組、腎衰康灌腸液高劑量組3組各2只。

    正常血清組給予正常喂養(yǎng);腎衰康灌腸液高劑量組給予腎衰康灌腸液灌腸,藥量按人與動(dòng)物體表面積換算得出,高劑量為9.617 ml·kg-1[6-7];空白組給予等量PBS溶液灌腸。腎衰康灌腸液高劑量組和空白組每天灌腸量分4次完成,于第4天上午灌腸1次后,3組兔子分別采血離心取上清、過(guò)濾除菌。

    以腎衰康灌腸液高劑量組血清與正常血清組血清按比例混合,制備腎衰康灌腸液中劑量組血清(含高劑量組血清50%)和腎衰康灌腸液低劑量組血清(含高劑量組血清25%)。將空白組、腎衰康灌腸液高劑量組、腎衰康灌腸液中劑量組、腎衰康灌腸液低劑量組各組血清冷存。

    1.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及處理 人腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2細(xì)胞)以含 10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液在37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下傳代培養(yǎng),同步化24 h。

    1.當(dāng)前在小學(xué)生英語(yǔ)的教學(xué)領(lǐng)域,有一大部分教師沿用傳統(tǒng)英語(yǔ)教學(xué)方法,不僅在方法上被時(shí)代所淘汰,在教學(xué)理念上也非常陳舊和落后,很多農(nóng)村的教師在新式的教學(xué)方法方面幾乎沒(méi)有涉及過(guò)信息化教學(xué)模式,在他們的教學(xué)過(guò)程中根本無(wú)法有效地在課堂上吸引學(xué)生的注意力。在這種情況下,學(xué)生學(xué)習(xí)積極性很難被充分調(diào)動(dòng)。

    取2組細(xì)胞,空白組常規(guī)培養(yǎng),不預(yù)缺氧/復(fù)氧處理,也不加含藥血清處理;模型組細(xì)胞密封處理,以模擬體內(nèi)細(xì)胞缺血再灌注損傷過(guò)程,然后檢測(cè)從造模開(kāi)始(0 h)0、1、2、3、4、5、6、7 h各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平,以推測(cè)細(xì)胞缺氧復(fù)氧的造模時(shí)間。

    造模時(shí)間確定后,隨機(jī)分為正常培養(yǎng)組、缺氧/復(fù)氧組、低劑量組、中劑量組、高劑量組5組。正常培養(yǎng)組加入空白組兔血清(含PBS血清),其余4組密封處理,待造模時(shí)間解除密封,以模擬體內(nèi)細(xì)胞缺血再灌注損傷狀態(tài)。缺氧/復(fù)氧組再加入空白組兔血清(含PBS血清),腎衰康灌腸液各劑量組分別再加入其高、中、低劑量含藥血清。以上各組血清的體積分?jǐn)?shù)為 0. 1,孵育48 h,并分別于0、4、8、12、24和48 h檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

    1.4.3 觀察指標(biāo)與方法 細(xì)胞ROS檢測(cè):測(cè)定細(xì)胞在造模結(jié)束并加入相應(yīng)血清后在加蓋并膠帶密封7 h后0、1、2、3、4、5、6、7 h細(xì)胞內(nèi)ROS水平,以推測(cè)細(xì)胞缺氧復(fù)氧的造模時(shí)間。操作方法:稀釋ROS原液,收集細(xì)胞加入一定量的ROS工作液。37 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min后,于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光;吸棄ROS染液,PBS清洗2次,加入Hoechst33345染液(250X,藍(lán)光),37 ℃培養(yǎng)箱孵育5~10 min,PBS清洗觀察熒光。

    細(xì)胞損傷/凋亡率檢測(cè):以CFSE/PI法、流式細(xì)胞分析聯(lián)合Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)5組細(xì)胞造模后分別加入空白組、對(duì)照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組5組血清后0、4、8、12 h的細(xì)胞凋亡/死亡情況。操作方法:收集細(xì)胞,細(xì)胞懸浮液準(zhǔn)備,分別染色加入等體積CFSE、 FITC Annexin V和PI工作液,混合均勻于37 ℃孵育10 min,PBS清洗,于熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)基因檢測(cè):采用RT-qPCR法檢測(cè)對(duì)照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組4組血清造模后0、4、8、12 h時(shí)細(xì)胞內(nèi)ERS標(biāo)志分子GRP78、CHOP的mRNA。操作方法:將組織塊剪成小塊,加入定量的Trizol細(xì)胞裂解液,然后用超聲細(xì)胞粉碎儀處理,細(xì)胞裂解液變渾濁即可。對(duì)于細(xì)胞:用PBS溶液將細(xì)胞清洗1次,每孔加入400 μL trizol細(xì)胞裂解液,吹打使細(xì)胞完全裂解;分離,沉淀為RNA,洗滌、溶解RNA,RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA(引物序列:Actin:上游:5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′,下游:5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′,GRP78:上游:5′-CATCACGCCGTCCTATGTCG-3′,下游:5′-CGTCAAAGACCGTGTTCTCG-3′,CHOP:上游:5′-GGAAACAGAGTGGTCATTCCC-3′,下游:5′-CTGCTTGAGCCGTTCATTCTC-3′),37 ℃孵育40 min,終止反應(yīng),85 ℃孵育5 min,cDNA產(chǎn)物稀釋20~50倍后使用,保存于-20 ℃,然后將PCR板置于RT-PCR儀上運(yùn)行。

    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)蛋白檢測(cè):半定量western用于檢測(cè)對(duì)照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組4組血清造模后0、4、8、12 h時(shí)細(xì)胞內(nèi)ERS標(biāo)志分子GRP78、CHOP的蛋白表達(dá)情況。操作方法:收集蛋白樣品配制凝膠,上樣與電泳,按順序加入5 μL maker,5-10 μL樣品,5 μL loading buffer。加入電泳緩沖液,插好正負(fù)極,用90 V 跑完濃縮膠后,調(diào)節(jié)電壓至130 V跑分離膠,待樣品接近凝膠底端時(shí)關(guān)閉電壓;轉(zhuǎn)模封閉,將PVCF膜在甲醇中浸泡2 min,然后用轉(zhuǎn)膜液清洗1次(1000 ml轉(zhuǎn)膜工作液的配制:100 ml 10×的轉(zhuǎn)膜液+200 ml 的乙醇 +700 ml的二次水), 4 ℃ 90 V跑1~1.5 h,BSA溶液37 ℃孵育0.5~1 h,不要清洗直接進(jìn)行一抗孵育。一抗用PBS-T(含0.1%的Tween 20的PBS溶液)按1∶1000稀釋,4 ℃過(guò)夜或室溫孵育1.5 h。然后PBS-T清洗3次,每次5 min。二抗孵育,用PBS-T(含1‰的Tween-20)按1∶1000稀釋,室溫或37 ℃孵育1 h,然后PBS-T清洗3次,每次5 min,最后顯影及定影。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 細(xì)胞ROS檢測(cè)

    圖1~3顯示,正常組細(xì)胞內(nèi)未觀察到綠色熒光;隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng),3 h時(shí)模型組(缺氧處理)出現(xiàn)綠色熒光,5 h時(shí)模型組ROS綠色熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)(箭頭提示處),細(xì)胞內(nèi)活性氧達(dá)到最高值;5 h后細(xì)胞凋亡明顯,無(wú)法進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),故細(xì)胞缺氧復(fù)氧時(shí)間點(diǎn)為密封5 h。

    2.2 CFSE/PI染色實(shí)驗(yàn)

    圖4~8顯示,造模0 h時(shí)的CFSE/PI染色結(jié)果表明,各組中紅色亮點(diǎn)沒(méi)有明顯增加,即細(xì)胞死亡率未出現(xiàn)明顯變化;4 h時(shí)各組細(xì)胞死亡率明顯增加,表明細(xì)胞模型成功;而在含藥血清處理造模細(xì)胞12 h時(shí),藥物組細(xì)胞死亡率明顯低于對(duì)照組和PBS組,其中高劑量組最為明顯,表明該藥物的藥效具有濃度依賴性;隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),各組細(xì)胞死亡率逐漸回到正常水平,造模效果消失。

    圖1 造模0 h時(shí)ROS檢測(cè)比較(×40)

    圖2 造模3 h時(shí)ROS檢測(cè)比較(×40)

    圖3 造模5 h時(shí)ROS檢測(cè)比較(×40)

    圖4 含藥血清處理造模細(xì)胞0 h后CFSE/PI染色結(jié)果比較(×40)

    圖5 含藥血清處理造模細(xì)胞4 h后CFSE/PI染色結(jié)果比較(×40)

    CFSE/PI染色結(jié)果表明,該含藥血清對(duì)缺血再灌注引起的細(xì)胞凋亡/死亡有一定的抑制效果,高劑量組藥效最佳。CFSE/PI染色法表明,本次實(shí)驗(yàn)HK-2細(xì)胞缺血再灌注損傷模型建立成功。隨著造模后時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞凋亡逐漸增加直到24 h,各組凋亡率與空白對(duì)照組相當(dāng),此時(shí)藥物作用失效。我們推測(cè)腎衰康灌腸液抑制細(xì)胞凋亡與藥物劑量有關(guān)。

    2.3 流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡情況

    圖6 含藥血清處理造模細(xì)胞12 h后CFSE/PI染色結(jié)果比較(×40)

    圖7 含藥血清處理造模細(xì)胞24 h后CFSE/PI染色結(jié)果比較(×40)

    注:*P<0.05,**P<0.01圖8 含藥血清對(duì)各組處理細(xì)胞0~24 h、CFSE/PI染色的影響

    圖9、10顯示,為進(jìn)一步探索腎衰康灌腸液含藥血清對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷HK-2細(xì)胞的凋亡影響和量化相關(guān)指標(biāo),我們采用Annexin V-FITC/PI聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù),定量分析各組細(xì)胞在造模后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡/死亡率。造模0 h時(shí),各組細(xì)胞的凋亡/死亡率均未出現(xiàn)明顯變化;從0 h開(kāi)始到12 h,對(duì)照組和PBS組均能檢測(cè)到大量的細(xì)胞凋亡/死亡率;而在24 h后,細(xì)胞凋亡/死亡明顯恢復(fù),造模效果喪失(48 h數(shù)據(jù)未展示)。在12 h,3個(gè)含藥血清組均有明顯的凋亡/死亡抑制效果。

    上述結(jié)果顯示,在HK-2細(xì)胞中含藥血清對(duì)缺血再灌注引起的細(xì)胞凋亡/死亡具有明顯的抑制效果,且這一效果可以持續(xù)到缺血再灌注損傷影響消失。

    2.4 RT-PCR實(shí)驗(yàn)

    圖11、12顯示,在檢測(cè)基因及蛋白時(shí),因正常組未缺氧/復(fù)氧造模檢測(cè)無(wú)意義,故檢測(cè)時(shí)未再檢測(cè)正常組相關(guān)指標(biāo),對(duì)照組即可對(duì)照。含藥血清處理模型細(xì)胞4 h后,GRP78、CHOP基因表達(dá)均下降發(fā)生明顯變化;從4 h到12 h GRP78升高表達(dá),逐漸恢復(fù)至正常水平。相對(duì)于PBS組,低、中、高劑量組對(duì)HK-2細(xì)胞中GRP78、CHOP的基因表達(dá)(P<0.05)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果顯示,含藥血清抑制缺血再灌注損傷模型HK-2細(xì)胞凋亡與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。

    2.5 WB實(shí)驗(yàn)

    圖13顯示,GRP78和 CHOP蛋白表達(dá)在空白組及實(shí)驗(yàn)組,無(wú)論高、中、低劑量改變不明顯,說(shuō)明腎衰康灌腸液改變蛋白變化不明顯,對(duì)抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中GRP78、CHOP蛋白表達(dá)不明確。其中CHOP條帶下出現(xiàn)非特異性條帶,可能是蛋白降解后產(chǎn)生的小片段堆積在膠底導(dǎo)致,對(duì)最后結(jié)果無(wú)明顯影響。

    圖9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡/死亡率

    注:*P<0.05圖10 不同時(shí)間點(diǎn)各組處理的細(xì)胞凋亡/死亡率比較

    注:*P<0.05圖11 相對(duì)于PBS組,低、中、高劑量組對(duì)HK-2細(xì)胞中GRP78的基因表達(dá)

    注:*P<0.05圖12 相對(duì)于PBS組,低、中、高劑量組對(duì)HK-2細(xì)胞中CHOP的基因表達(dá)

    注:條帶分子量β-actin:45 kDa;CHOP:27 kDa;GRP78:78 kDa圖13 CHOP、GRP78蛋白表達(dá)比較

    3 討論

    急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是常見(jiàn)的急危重癥,其死亡率高[8],目前尚無(wú)有效的治療藥物,嚴(yán)重威脅患者的生命安全和生存質(zhì)量。成都中醫(yī)藥大學(xué)研制的腎衰康灌腸液遵循中醫(yī)“清熱解毒”“活血化瘀”“益氣利尿”治則,由大黃、黃芪、丹參、紅花組成。方中大黃通下能使病邪有出路,使堆聚在人體的水分和廢物能從腸道排出,有助于病人渡過(guò)少尿、無(wú)尿的危急階段[9]。同時(shí)大黃改善代謝作用顯著,現(xiàn)代中藥藥理研究學(xué)表明,大黃有利尿和改善腎功能的作用,可以減少腸道對(duì)氨基氮的吸收,利用氨合成蛋白質(zhì),抑制體蛋白分解,促進(jìn)尿素和肌酐隨尿液排出體外[10-12]。黃芪能扶正固本、利尿消腫,具有增強(qiáng)機(jī)體免疫、雙向調(diào)節(jié)血壓、降低蛋白尿、擴(kuò)張外周血管及增強(qiáng)非特異性免疫作用[12]。其主要成分之一黃芪甲苷,能明顯減少缺血再灌注時(shí)GRP78的表達(dá),通過(guò)抑制ERS保護(hù)大鼠缺血/再灌注器官[13];紅花、丹參具有活血化瘀的功效,可以擴(kuò)張血管,解除微血管痙攣,特別是腎小動(dòng)脈痙攣,防止血細(xì)胞聚集,改善微循環(huán),使腎血流量恢復(fù)[14-15],抑制人腎成纖維細(xì)胞增殖并促進(jìn)機(jī)體代謝,達(dá)到改善腎間質(zhì)纖維化的作用[15]。本藥臨床治療急性腎損傷有效率一直在80%以上[16]。

    本實(shí)驗(yàn)因條件有限無(wú)三氣培養(yǎng)箱,故采用檢測(cè)ROS,以推測(cè)細(xì)胞在缺氧條件下的活性情況,同時(shí)證明造模成功。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,腎衰康灌腸液對(duì)體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2細(xì)胞)缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡/死亡有明顯改善,驗(yàn)證了腎衰康灌腸液不僅臨床治療急性腎損傷有效,從細(xì)胞學(xué)角度證明對(duì)缺血性急性腎損傷也有治療作用。

    缺血性AKI是主要類型[1],其主要特征是腎小管上皮細(xì)胞的凋亡。研究表明[2-4],內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起促生存信號(hào)通路和促凋亡信號(hào)通路調(diào)控失衡,導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞過(guò)度凋亡,是缺血性急性腎損傷發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制。

    細(xì)胞在多種理化因素(缺氧、饑餓、鈣離子平衡失調(diào)、化學(xué)毒物等)的刺激下,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)會(huì)出現(xiàn)蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊及未折疊蛋白質(zhì)的聚集,這種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)在功能紊亂的狀態(tài)稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)[17]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為適應(yīng)正在改變的環(huán)境或重新建立一個(gè)正常的ER功能,將逐漸形成一種稱為未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)的信號(hào)通路[18]。UPR由3種ER感應(yīng)蛋白介導(dǎo),分別是PERK、ATF6和IRE-l,在未發(fā)生應(yīng)激時(shí)都以無(wú)活性狀態(tài)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78結(jié)合。錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白的積聚使GRP78從3種感應(yīng)蛋白上解離,轉(zhuǎn)而去結(jié)合錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白。解離后的感應(yīng)蛋白被活化并啟動(dòng)UPR,包括早期蛋白質(zhì)合成的廣泛抑制、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶和折疊酶的轉(zhuǎn)錄激活等一系列反應(yīng),從而降低錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的積累,恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能,是一個(gè)促生存信號(hào)途徑,故GRP78表達(dá)的上調(diào)是ERS的標(biāo)志,在應(yīng)激條件下對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用[19]。

    PERK、ATF6以及IRE-l信號(hào)不僅能夠啟動(dòng)ERS的生存途徑,當(dāng)過(guò)強(qiáng)或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的ERS導(dǎo)致ER功能受損時(shí),這3條信號(hào)通路同樣能夠啟動(dòng)由ERS所介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,去除受損傷的細(xì)胞。ERS引起的細(xì)胞凋亡有一套自身的信號(hào)傳遞通路,稱之為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性死亡(ER-ssociated death,ERAD)途徑[20]。目前發(fā)現(xiàn),ERAD相關(guān)途徑有3條,即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)源性轉(zhuǎn)錄因子(CHOP)、天冬氨酸特異性半肌氨酸蛋白-12(Caspase-12)和c-Ju氨基末端激酶(JNK)[21-23]。故臨床研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過(guò)CHOP、Caspase-12、JNK 3條通路研究。其中CHOP在真核動(dòng)物的組織細(xì)胞中廣泛存在,其編碼蛋白與多種細(xì)胞功能活動(dòng)(如增殖、分化、凋亡)密切相關(guān)。據(jù)研究報(bào)道,CHOP基因可通過(guò)抑制Bcl-2(凋亡負(fù)調(diào)節(jié)蛋白)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡,也可通過(guò)與促凋亡死亡受體5(DR5)基因5'翼狀區(qū)結(jié)合而增加后者蛋白的表達(dá),而后者是激活caspase家族的重要分子[24-25]。在CHOP基因過(guò)表達(dá)以及運(yùn)用CHOP敲除小鼠的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn),CHOP蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯及凋亡[26-27]。正常情況下,CHOP幾乎不表達(dá),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)可通過(guò)IRE-1、 PERK和ATF6的活化促進(jìn)CHOP的大量表達(dá),最終引起細(xì)胞凋亡。

    最后實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn),該實(shí)驗(yàn)?zāi)P痛嬖趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的激活,且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)通路參與引起細(xì)胞凋亡(GRP78,CHOP基因表達(dá)在不同組別有明顯不同),腎衰康灌腸液可減少HK-2細(xì)胞凋亡率,減輕腎缺血再灌注損傷。但是檢測(cè)對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中的GRP78、CHOP蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化,推測(cè)腎衰康灌腸液減輕腎缺血再灌注損傷的機(jī)制可能不是通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中的GRP78、CHOP起作用,可能檢測(cè)蛋白應(yīng)考慮從IRE-1、 PERK和ATF6檢測(cè),或腎衰康灌腸液治療是通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中其他信號(hào)通路起作用的,有待進(jìn)一步深入研究。

    綜上所述,本實(shí)驗(yàn)證明中藥腎衰康灌腸液確實(shí)有抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激治療HK-2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的作用。該中藥不僅臨床有效,且驗(yàn)證了中藥復(fù)方在細(xì)胞層面治療急性腎損傷的有效性,為急性腎損傷的中醫(yī)治療提供了新的理論依據(jù)。

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