四神丸對(duì)慢性復(fù)發(fā)型結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織LDH、SDH、Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活力的影響?

王海燕，劉 億，葛 巍，鹿秀云，李燕珍，劉端勇Δ，趙海梅Δ

(1. 江西中醫(yī)藥大學(xué),南昌 330004； 2. 江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,南昌 330006)

四神丸出自南宋·許叔微所撰寫的《普濟(jì)本事方》，由二神丸與五味子散組合而成，主治脾腎陽(yáng)虛之腎泄[1]?，F(xiàn)代研究表明，能量代謝狀態(tài)紊亂是包括UC在內(nèi)的炎癥性腸病發(fā)病的重要特征之一[2]，而四神丸具有溫補(bǔ)脾腎之陽(yáng)的功效，然其能否調(diào)控能量代謝水平達(dá)到治療UC的目的鮮見報(bào)道。本研究將通過(guò)測(cè)定大鼠結(jié)腸組織LDH、SDH、Na+-K+-ATPase和 Ca2+-Mg2+-ATPase活力變化，以闡述四神丸治療實(shí)驗(yàn)性大鼠UC的可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物及分組

健康SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量180～200 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供(合格證號(hào)SCXK(湘)2013-0004)。將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、四神丸高、中、低劑量組和美沙拉嗪對(duì)照組各10只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要藥物和試劑

四神丸(SSP)購(gòu)于北京同仁堂天然藥物(唐山)有限公司(生產(chǎn)批號(hào)16080053)；美沙拉嗪腸溶片購(gòu)于葵花藥業(yè)集團(tuán)佳木斯鹿靈制制藥有限公司(生產(chǎn)批號(hào)170438)；三硝基苯磺酸(2,4,6-Trinitrobenzenesulfonic acid solution，TNBS)分子量為293.17，購(gòu)于SIGMA公司(生產(chǎn)批號(hào)SLBP0899V)。

1.3 主要儀器與試劑

低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf)、722型分光光度計(jì)(上海儀電)；LDH、SDH、Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 模型復(fù)制

參照文獻(xiàn)[3]和結(jié)合前期研究復(fù)制慢性復(fù)發(fā)性UC大鼠模型。第1天，動(dòng)物麻醉(3%戊巴比妥0.14 ml/kg)，用0.29 mm直徑塑料軟管從肛門將0.8 ml 5%TNBS/ 50%乙醇混合溶液(3 mg/kg TNBS)注入結(jié)腸8 cm處，倒置待動(dòng)物自然蘇醒。第14、28天重復(fù)上述操作，正常組注入等量生理鹽水。

2.2 給藥方法

第29天，四神丸低、中、高劑量組分別給予1.25、2.5、5 g/kg四神丸灌胃1周，美沙拉嗪對(duì)照組給予150 mg/kg美沙拉嗪灌胃1周。

2.3 標(biāo)本采集及處理

第36天，動(dòng)物麻醉處死，截取結(jié)腸PBS洗凈污穢物。留取部分結(jié)腸組織4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色，觀察結(jié)腸病理改變；剩余組織置于-80 ℃冰箱保存，用于檢測(cè)LDH、SDH、Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase的活力值。

2.4 一般狀態(tài)評(píng)價(jià)

觀察動(dòng)物毛發(fā)、進(jìn)食、大便性狀及活動(dòng)狀態(tài)。

2.5 結(jié)腸黏膜肉眼損傷評(píng)分及鏡下病理評(píng)分

觀察結(jié)腸黏膜充血、水腫、潰瘍及淋巴結(jié)等情況，測(cè)定結(jié)腸質(zhì)量和長(zhǎng)度。參照文獻(xiàn)[4-5]進(jìn)行結(jié)腸黏膜肉眼及鏡下結(jié)腸組織病理?yè)p傷形態(tài)學(xué)評(píng)分。

2.6 結(jié)腸組織LDH、SDH、Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活力值檢測(cè)

大鼠麻醉后快速脫椎處死，分離結(jié)腸組織，冰PBS溶液沖洗，制備生理鹽水組織勻漿，3500 r/min離心15 min分離上清液，并采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量，Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活力值檢測(cè)按照試劑盒說(shuō)明書，采取誘導(dǎo)促酶反應(yīng)和定磷法測(cè)定其ATP酶活性，LDH、SDH活力值檢測(cè)按照試劑盒說(shuō)明書規(guī)范操作，采用分光光度計(jì)法測(cè)定其活性，由南京建成生物科技有限公司完成。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 一般狀況變化

與正常組比較，模型組大鼠毛發(fā)暗淡不光澤、參差不齊，大便溏稀潛血、肛周污穢、少食少動(dòng)、嗜睡怕冷、精神極度萎靡；各治療組與模型組比較，食量增加、活躍多動(dòng)、大便成型，狀態(tài)好轉(zhuǎn)。

3.2 結(jié)腸黏膜肉眼損傷評(píng)分及鏡下病理評(píng)分結(jié)果

圖1表1顯示，肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，TNBS誘導(dǎo)后大鼠結(jié)腸黏膜充血、水腫，潰瘍面形成，結(jié)腸皺襞紋理粗細(xì)雜亂；各治療組結(jié)腸黏膜充血、水腫減輕，潰瘍甚小。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，模型組黏膜病灶可見上皮組織缺失、水腫、充血，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，伴見潰瘍形成；各治療組大鼠結(jié)腸基本恢復(fù)正常，伴有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與正常組比較，模型組結(jié)腸質(zhì)量、結(jié)腸肉眼下及鏡下?lián)p傷評(píng)分均明顯升高(P<0.01)，結(jié)腸長(zhǎng)度則明顯縮短(P<0.01)；而經(jīng)四神丸給藥治療后，與模型組比較，各給藥組結(jié)腸質(zhì)量、結(jié)腸肉眼下及鏡下?lián)p傷評(píng)分均明顯下降(P<0.01)，結(jié)腸長(zhǎng)度則明顯恢復(fù)(P<0.01)。上述結(jié)果表明，四神丸可有效治療慢性復(fù)發(fā)型結(jié)腸炎。

注：A.正常組；B.模型組；C.四神丸高劑量組；D. 四神丸中劑量組；E. 四神丸低劑量組；F.美沙拉嗪組圖1 各組大鼠結(jié)腸黏膜病理?yè)p傷HE染色比較 (×100)

3.3 結(jié)腸組織LDH、SDH、Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活力變化

表2顯示，與正常組比較，模型組結(jié)腸黏膜組織中SDH、Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活力均顯著下降 (P<0.05或0.01)，LDH活力明顯提升(P<0.05)；而各治療組均能降低LDH活力，同時(shí)顯著提升SDH、Na+-K+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase活力(P<0.05)。上述結(jié)果表明，四神丸可有效調(diào)控慢性復(fù)發(fā)型結(jié)腸炎大鼠能量代謝狀態(tài)和水平。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)觀察到，大鼠經(jīng)TNBS灌腸造模后，大鼠結(jié)腸黏膜損傷、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、潰瘍形成，肉眼及鏡下?lián)p傷評(píng)分明顯升高，與以往UC動(dòng)物模型相似[6]。同時(shí)伴見Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活力顯著下降，提示TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜能量代謝狀態(tài)紊亂。

表1 四神丸治療慢性復(fù)發(fā)型結(jié)腸炎大鼠的療效評(píng)價(jià)(分，

注：與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

表2 四神丸對(duì)慢性復(fù)發(fā)型結(jié)腸炎大鼠能量代謝相關(guān)指標(biāo)影響比較

注：與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

結(jié)腸上皮組織的破壞損傷是潰瘍性結(jié)腸炎的重要病理特征，而能量代謝紊亂是導(dǎo)致結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞通透性增加的重要原因之一[2]。ATP的耗竭可引起上皮細(xì)胞間連接骨架的萎縮、斷裂、減少，進(jìn)而導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞間隙增寬，結(jié)腸黏膜上皮間通透性增加，腸黏膜屏障破壞，致使細(xì)菌、抗原等致炎物質(zhì)穿過(guò)腸黏膜屏障，進(jìn)入固有層激活炎癥反應(yīng)，最終誘導(dǎo)炎癥損傷[7]。然而能量代謝相關(guān)酶活性改變對(duì)腸上皮細(xì)胞屏障功能和能量代謝同樣具有重要意義。ATP酶(ATPase)是一種廣泛存在于哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞膜上的載體蛋白，參與細(xì)胞的物質(zhì)代謝和能量轉(zhuǎn)換過(guò)程。其中Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase可利用離子梯度差通過(guò)與各離子親和力的改變，將細(xì)胞內(nèi)外的電離子、營(yíng)養(yǎng)物和代謝物等逆電化學(xué)梯度從低濃度側(cè)向高濃度側(cè)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，這種耗能的主動(dòng)運(yùn)輸方式對(duì)細(xì)胞滲透壓的平衡和細(xì)胞體積的恒定有重要意義，也為細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育提供了能量及物質(zhì)基礎(chǔ)[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，慢性腸炎動(dòng)物模型的腸絨毛細(xì)胞存在Na+-K+-ATPase活性下降，究其原因與細(xì)胞連接骨架錨定蛋白的表達(dá)能力退化有關(guān)[9]。進(jìn)一步提示，能量的缺乏是鈉鉀泵和鈣鎂泵功能異常的重要原因之一。LDH是葡萄糖無(wú)氧酵解的關(guān)鍵酶，當(dāng)結(jié)腸組織受到損害時(shí)，可導(dǎo)致局部組織缺氧，代謝物大量堆積，自由基增多，進(jìn)而引起細(xì)胞膜破損。而細(xì)胞可通過(guò)啟動(dòng)保護(hù)性代償機(jī)制，增加LDH的分泌，催化乳酸氧化，故LDH可作為腸上皮細(xì)胞的損傷監(jiān)測(cè)指標(biāo)[10]。SDH為有氧代謝(三羧酸循環(huán))的限速酶和線粒體的標(biāo)志酶，通過(guò)其活性的改變可直接反映有氧反應(yīng)的強(qiáng)弱和間接反映線粒體功能的好壞，可作為腸上皮細(xì)胞能量供給的參考[11]。在本實(shí)驗(yàn)中，TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸黏膜時(shí)，使局部組織缺氧，能量代謝紊亂，骨架蛋白支撐乏力，ATP酶活力下降，正常電解質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)破壞，細(xì)胞受損，腸黏膜屏障功能受損，進(jìn)而導(dǎo)致致病因素入侵，炎性損傷產(chǎn)生，潰瘍形成，提示能量代謝狀態(tài)紊亂是結(jié)腸炎的重要特征之一。經(jīng)四神丸治療后，結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸質(zhì)量、長(zhǎng)度和病理?yè)p傷評(píng)分得到改善的同時(shí)，結(jié)腸組織LDH活力隨之降低，SDH、Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活力則相應(yīng)提升。這與之前發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂連用肉豆蔻可改善大鼠肝組織能量代謝的結(jié)果相符[12]。進(jìn)一步揭示了四神丸有效治療慢性復(fù)發(fā)性UC的機(jī)制可能是通過(guò)干預(yù)腸上皮細(xì)胞的能量代謝，增加其能量供給，保證鈉鉀泵和鈣鎂泵的正常運(yùn)行，以平衡細(xì)胞的滲透壓，恒定細(xì)胞體積，保持腸上皮細(xì)胞屏障的完整性，進(jìn)而減少致炎物質(zhì)的侵入，緩解腸道炎癥。但四神丸如何產(chǎn)生能量，與哪些基因或信號(hào)有關(guān)，是否存在免疫細(xì)胞活化都有待于進(jìn)一步的深入研究。